Summary
Ex-Vivo pancreatic Islet Studien sind wichtig für Diabetes-Forschung. Bestehende Techniken an kultivierte Inselchen in ihrer Muttersprache 3-dimensionale Architektur zu studieren sind zeitaufwendig, ineffizient und selten verwendete. Diese Arbeit beschreibt eine neue, einfache und effiziente Methode zur Erzeugung von qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des gesamten kultivierten Inselchen.
Abstract
Experimente mit isolierten pankreatischen kleinen Inseln sind wichtig für Diabetes-Forschung, aber Inselchen sind teuer und der begrenzten Fülle. Inselchen enthalten einer gemischten Zellpopulation in einer strukturierten Architektur, die Funktion auswirkt, und menschliche Inselchen sind weit verbreitet in Zelle Typ Zusammensetzung variabel. Aktuelle häufig verwendete Methoden der kultivierte Inselchen zu studieren zählen Molekulare Studien auf ganze Inseln, begehen disparaten Inselchen Zelltypen zusammen, oder Mikroskopie oder Molekulare Studien über verteilte Inselzellen Inselchen Architektur zu stören. Für in Vivo Inselchen Studien ist Paraffin-eingebetteten Pankreas-Schnitt eine leistungsfähige Technik zellspezifische Ergebnisse in der nativen Pankreas-Umgebung zu bewerten. Post-Kultur Inselchen von Paraffin-Schnitt studieren würde bieten mehrere Vorteile: Erkennung von mehrere Ergebnisse für gleichen Inselchen (möglicherweise sogar die exakt gleichen Inselchen, mit Schnittserien), Handy-Typ-spezifische Messungen und Erhaltung Eingeborener kleine Insel Zell-Zell und Zelle-Substrat Interaktionen während experimentelle Exposition und zur Analyse. Jedoch isoliert vorhandene Techniken für die Einbettung von Inselchen Post-Kultur sind ineffizient, zeitaufwändig, anfällig für Verlust von Material und in der Regel produzieren Abschnitte mit unzureichenden Inselchen Zahlen bis zur Quantifizierung der Ergebnisse nützlich sein. Klinische Pathologie Zelle Block Vorbereitung Laboreinrichtungen sind unzugänglich und unpraktisch für grundlegende Forschungslabors. Wir haben eine verbesserte und vereinfachte Benchtop-Methode entwickelt, die Abschnitte mit stabile Erträge und Verteilung der Inselchen generiert. Feste Inselchen sind Nukleinsäuretablette in warmen histologischen Agarosegel und pipettieren in eine flache Scheibe auf einer standard-Glas-Folie, so dass die kleinen Inseln in einer Ebene verteilt sind. Nach standard Dehydrierung und einbetten können mehrere (10 +) 4-5 µm Abschnitte aus dem gleichen Inselchen Block geschnitten werden. Mit dieser Methode können auf Maus, Ratte und menschlichen Inselchen histologische und immunofluorescent Analysen durchgeführt werden. Dies ist eine effektive, kostengünstige, zeitsparende Ansatz zur Zelle-typspezifischen, intakt-Architektur Resultate von den kultivierten Inseln zu beurteilen.
Introduction
Pankreas Langerhans-Inseln, die einzige Quelle des zirkulierenden Insulin, sind eine kritische Gewebe für Ermittler Diabetes Mellitus zu studieren. Aus jedem gegebenen Organismus haben Inselchen variabler Größe, Zelle Art Frequenz und Architektur1,2,3. Die konventionelle Strategie in Vivo Struktur und Zusammensetzung der endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse Inselchen zu studieren ist durch Pankreas Gewebe4,5-Schnitt. Da Inseln nur einen kleinen Bruchteil des Pankreas zellulären Gesamtgehalt bestehen, sind Molekulare Studien auf isolierte Inseln durchgeführt. Ex-Vivo Inselchen Kultur Experimente testen ansprechen auf Nährstoffe, bieten gen Modulation (Transfektion, Transduktion) oder experimentelle Behandlungen wichtige Einblicke in Mechanismen moduliert endokrine Zelle überleben, Verbreitung und Funktion 5 , 6.
Ex-Vivo Inselchen Experimente sind oft mit molekularen Studien der ganzen Inseln oder histologische oder Molekulare Studien der dispergierten Inselzellen gewachsen in monomolekularen Film5,6analysiert. Molekulare Analyse der ganzen Inseln führt die schwere Einschränkung der mehrfache Zelltypen, die falsch-negativen oder falsch-positiven Ergebnissen auf jede einzelne Zelle Art hochgerechnet führen kann. Zelle Dispersion auf Deckgläsern für Post-Kultur-Mikroskopie ermöglicht Handy-Typ-spezifische Ergebnis Messung, aber stört Inselchen Architektur, die Reaktion auf Intervention verändern kann und Identifizierung von architekturbezogenen Ergebnisse ausschließt. Darüber hinaus kann in der Regel nur ein einziges Ergebnis gemessen werden; zum Beispiel um Beta-Zell-Proliferation und Beta-Zelltod unter den gleichen Bedingungen zu messen, müssen zwei separate Experimente durchgeführt werden. Diese Ansätze sind auch blind für Inter Inselchen Variabilität, eine Fläche von zunehmendes Interesse im Bereich. Sortier Inselzellen durch Durchflusszytometrie für Zelle-Typ-spezifischen molekularen Studien oder einzellige RNA Studien sind elegant, aber teuer, zeitaufwändig, begrenzt durch Gewebe Fülle, Beseitigung von Architektur und nicht gut geeignet, um routinemäßige Zelle Kulturanalysen 5 , 7. konfokale Bildgebung des gesamten-Mount Immunostained Inselchen bietet qualitativ hochwertige Daten intakt-Architektur, aber ist sehr arbeitsintensiv, und von jeder Probe gewonnene Daten beschränkt sich auf Ergebnisse in einem einzigen Immunostaining8erkennbar.
Die Möglichkeit, qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des Post-Kultur ganze Inseln erzeugen würden viele dieser Bedenken ansprechen. Hohen Kosten, niedrig-Fülle Inselchen Gewebe von einzigartigen genetischen Modellen oder von menschlichen Organspendern oder Inselchen Status Post in Vivo oder in Vitro experimentelle Manipulation, sind kostbar. Erhalten mehrere Paraffin Abschnitte von den gleichen Inseln könnten mehrere Typ-zellspezifische intakt-Architektur Analysen aus dem gleichen Experiment.
Bestehende Techniken an Insel-Pellets für Schnitt erzeugen sind unvollkommen. Histologie-optimierte Agarose ist eine wässrige niedrigen Schmelzpunkt-Gel, die weit verbreitet ist in der Verarbeitung von histologischer und zytologischen Proben einschließlich fragmentierte oder kleine Gewebeproben, die schwer zu Prozess-9. Ein Inselchen Einbettung Ansatz ist, unterbrechen die Inselchen in Agarose in einem Microcentrifuge Schlauch, Zentrifugieren pellet-das Material, Abrufen des Agar-Steckers dann verarbeiten und embed für10,11-Schnitt. Extrahieren von verfestigten Probe von der Unterseite des Rohres ist zeitaufwändig und schwierig, was zu gelegentlichen Fragmentierung der Probe und Verletzungsgefahr. Die Inseln sind in der Spitze des Steckers, führt zu unzureichenden Inselchen Verteilung in Abschnitten, die von dieser Methode erhalten konzentriert. Der Runde Unterseite des Steckers erschwert einbetten, so dass eine kleine Insel-Armen Region für Schnitt dargestellt wird. Insgesamt führt diese Methode zu geringe Ausbeute und aufgehäuften Inselchen Verteilung in den sich daraus ergebenden Abschnitten.
Diese neue Methode ist eine vereinfachte und verbesserte Ansatz für die Vorbereitung der Insel Abschnitte. Inselchen sind konzentriert in einem kleinen Volumen und dann auf die glatte Oberfläche des einen Objektträger, eine kleine Scheibe mit den kleinen Inseln in einer Ebene zu bilden. Die Histogel-Insel-Scheibe ist für Paraffin, die Einbettung in eine verkürzte Dehydrierung und Xylol Infiltration Protokoll verarbeitet. Der bisherige Ansatz, der die Inseln in der Unterseite eines Microfuge Rohres konzentriert, wird auch als Vergleich durchgeführt. Diese neue Technik verbessert die Ausbeute an Inseln pro Abschnitt, die Aufteilung der Inseln in den einzelnen Abschnitten und nimmt weniger Zeit, die Insel-Blöcke auf Kassetten zu übertragen. Diese Technik eignet sich für kleine Insel Biologen oder andere Wissenschaftler studieren kleine Stücke des Gewebes, die Produktivität zu maximieren wollen verwenden eines Low-Fülle Gewebes durch die Messung mehrere Ergebnisse für ein einzelnes Sample in seiner nativen Gewebearchitektur.
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Protocol
Alle Verfahren, bei denen Tiere wurden durch die University of Massachusetts Medical School institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt. Menschlichen Inselchen Studien wurden von UMass Institutional Review Board bestimmt, nicht für IRB Überprüfung oder Befreiung zu qualifizieren, weil sie nicht den Gebrauch von menschlichen Probanden einbeziehen.
1. Insel Isolation und Kultur
- Inselchen zu isolieren und getrennt von kontaminierenden exokrinen und duktalen Gewebe mit der Methode Ihrer Wahl.
Hinweis: Diese Methode wurde mit kleinen Inseln isoliert von Kollagenase duktale Insufflation und Ficoll Trennung12 (Nagetier) oder nach der Auslieferung Inselchen aus der integrierten Islet Vertriebsprogramm (IIDP13, Mensch) optimiert. Inselchen wurden mit einer Mikropipette P200 handverlesen. - Zur Optimierung der Morphologie der Insel ermöglichen Sie Inselchen in 10 mL komplette Insel Medium (RPMI mit 10 % FBS, Penicillin/Streptomycin und 5,5 Mmol/L Glucose) in eine Feuchte Kammer, die mit 5 % CO2 bei 37 ° c über Nacht erholen Obwohl dieser Schritt nicht erforderlich ist, um Abschnitte zu erhalten, die Inseln sind nach einer Erholungszeit mehr intakt (siehe Abbildung 2).
(2) Insel Fixierung
- Mit einer Low-Bindung-P200-Spitze, ca. 250 Inselchen äquivalente (IEQ)13 mit einem kalibrierten Raster unter einem Stereomikroskop in ein 1,5 mL geringe Bindung Microfuge Rohr aussuchen. Low-Bindung Tipps und Röhren reduzieren Inselchen Verlust.
- Ermöglichen Sie Inselchen, sich an der Unterseite des Microfuge Rohres. Entfernen Sie die meisten überstand mit P200 pipettieren Spitze, kümmert sich nicht um alle Inseln zu entfernen.
- Fügen Sie 1 mL PBS. Rohr in eine schwingende Eimer Zentrifuge zentrifugieren, bis die Geschwindigkeit 200 X g erreicht und dann Anhalten der Spins. Den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die PBS waschen, für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.
- Fügen Sie 500 µL 10 % Formalin-Lösung oder Paraformaldehyd 4 % frisch zubereitet. 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Für die Ergebnisse bei dieser Methode getestet waren diese Fixierung Methoden zu unterscheiden. Kürzere Fixierung kann auch möglich sein; Es wird empfohlen, die Dauer der Fixierung für gewünschtes Ergebnis zu optimieren.
- Entfernen Sie das Fixiermittel mit P200 Spitze.
- Fügen Sie 1 mL PBS. Zentrifugieren Sie Rohr, bis die Geschwindigkeit 200 X g erreicht und dann Anhalten der Spins. Den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die PBS waschen, für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.
- Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
3. Vorbereitung der Insel CD (Abbildung 1)
- Schmelzen Sie bei der ersten Verwendung des Gels (z. B. Histogel) bei 70 ° C zu und Aliquote in 1,5 mL Microfuge Rohre für langfristige Lagerung. Aliquoten Volumen ist nicht kritisch, da Aliquote wiederverwendet werden können.
- Das Gel (ca. 100 µL pro Probe) bei 70 ° C warm, indem man Microfuge-Röhrchen mit Gel aliquoten in einem Heizblock eingestellt auf 70 ° c
- Übertragen Sie Agarose blaue Perlen (10 µL für jede Probe) in einem 1,5 mL sauber Microfuge Rohr. Gründlich Aufschwemmen der Perlen vor dem pipettieren.
Hinweis: Blaue Perlen werden mit den Inseln um visuelle Identifizierung des eingebetteten Materials in der Agarose-Taste und der paraffinblock bei gemischt. Die Anzahl der blauen Perlen verwendet, ist nicht entscheidend für das Ergebnis, aber vermeiden Sie übermäßige Perlen (> 5 x die Anzahl der Inseln) ermöglichen optimale Verteilung der Inselchen in Abschnitten. - Waschen Sie die blauen Perlen mit 1mL PBS, zweimal. Spinnen Sie für jedes waschen die Perlen 1 min bei 800 X g. Nach der zweiten Wäsche Aufschwemmen der Perlen im (n+ 2) x 10 µL PBS, wobei n die Anzahl der Probenröhrchen ist; zum Beispiel wäre das PBS-Volumen hinzu die Perlen für 2 Probenröhrchen 40 µL.
- Zentrifugieren Sie der Microfuge Röhrchen mit Inselchen (kurze Spin 200 X g) und entfernen Sie die meisten des Überstands. Die Spitze einer 10 µL Mikropipette Spitze mit einer Schere oder einem Messer abgeschnitten und jedes Insel-Rohr, mit einer sauberen Spitze für jede Probe 10 µL Perlen verleihen. Verwechseln Sie nicht (zur Vermeidung von Inselchen zu verlieren).
- Zentrifugieren Sie Inselchen und Perlen (kurze Spin 200 X g). Entfernen Sie so viel PBS wie möglich mit unbeschnittenen 10 µL Mikropipette Spitze.
- Beschriften Sie den Objektträger für Probenidentifikation. Zwei bis drei Proben können auf jeder Folie zubereitet werden. Legen Sie die Folie, auf der Bank in der Nähe der Heizblock mit erwärmten Gel. Schneiden Sie die Spitzen der drei bis fünf 20 µL geringe Bindung Mikropipette Tipps pro Probe mit einer Rasierklinge oder Schere. Laden Sie zwei P20 Mikropipetten mit geschnittenen Tipps zum schnellen Wechsel von einem zum anderen ermöglichen.
- Mit der ersten mikropipette, 15-20 µL warme Gel fügen Sie das Inselchen/Perlen Microfuge Rohr hinzu; sofort zu mischen, Luftblasen zu vermeiden; und übernehmen Sie die flüssigen Agar/Inseln/Perlen-Mischung auf die Folie zu bilden ein < 1 cm Durchmesser Scheibe. Legen Sie die Disk am Rand der Folie, so dass Platz für den äußeren Gel-Ring (nächster Schritt). Tippen Sie auf die Folie vorsichtig ein paar Mal um zu den kleinen Inseln und Perlen zu begleichen.
- Fügen Sie mithilfe einer zweiten Mikropipette 20 µL warme Gel in das Probenröhrchen. Mit der ersten mikropipette, Mischung neue Gel mit alle verbleibenden Inseln/Perlen, wieder in den Heizblock Erwärmung, wenn es beginnt zu festigen, dann wenden Sie diese Mischung auf die Folie, um die original-CD. Wiederholen Sie bei Bedarf mit zusätzlichen vorgeschnittenen Tipps, bis die Disc die gewünschte Größe und Dicke ist.
Hinweis: Handhabung der gelierten Disc ist einfacher, wenn der äußere Ring etwas dicker ist. 3 x 20 µL Gel ist in der Regel ausreichend. Dieser Schritt minimiert Verlust von kleinen Inseln durch Rohr Waschungen und fügt Insel-Armen Agarose an der Außenseite der Scheibe Scheibe Handhabung zu erleichtern. - Bereiten Sie jede Scheibe einzeln und verfolgen Sie vorsichtig beispielauftrag wenn mehrere Disks auf jeder Folie zu platzieren.
- Legen Sie die Folien auf einer ebenen Fläche von nassem Eis, mit einem Deckel für 10 Minuten oder bis das Gel verfestigt sich. Es ist schwieriger, die Disc aus dem Glas zu schieben, wenn es trocknet.
- Label-Biopsie Verarbeitung/Einbettung Gewebe Kassetten mit Bleistift, eine pro Probe. Trocknen Sie die Rückseite der Folie zu vermeiden, das blaue Papier anfeuchten.
- Mit der stumpfen Kante einer Rasierklinge, schieben Sie die Disc in jede Richtung aus dem Glas zu befreien. Wenn es leicht gleitet, drücken Sie die Scheibe langsam aus den Mikroskop-Objektträger auf dem blauen Tissue-Papier. Legen Sie die Diskette, die flache Seite nach unten direkt auf dem Papier.
- Falten Sie die Scheibe flach halten, das Papier um die Scheibe zu Bewegung zu verhindern, legen Sie die Disk in gefaltetes Papier in der Kassette und schließen die Kassette. Wenn die Disc aus dem Glas nicht sauber schieben, fügen mehr Gel bzw. die Folie, um für ein paar Minuten Eis zurück.
- Tauchen Sie die Kassette mit PBS-Puffer in einen Becher füllen. Prozess für Paraffin einbetten am selben Tag für optimale Morphologie.
(4) Paraffin einbetten
Hinweis: Prozess Scheiben das Inselchen Gel, Paraffin-Blöcke mit einer abgekürzten Dehydrierung Serie wie unten beschrieben. Diese Technik wurde durch eine automatisierte Prozessor optimiert, aber manueller Bearbeitung sollten ähnliche Ergebnisse produzieren.
- Tauchen Sie Kassetten in 85 % Ethanol, 15 Minuten lang.
- Tauchen Sie Kassetten in 95 % igem Ethanol für 15 Minuten.
- Tauchen Sie Kassetten in 100 % igem Ethanol für 15 Minuten. Wiederholen Sie zweimal für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.
- Tauchen Sie Kassetten in Xylol für 15 Minuten. Wiederholen Sie zweimal für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.
- Tauchen Sie Kassetten in geschmolzenem Paraffin für 10 Minuten.
- Transfer-Kassetten zum frisch geschmolzenem Paraffin für 10-30 Minuten.
- Vorsichtig öffnen der Kassette und packen Sie das Blaubuch. Entfernen Sie die Gel-Disc, die flache Oberfläche, die entgegengesetzt war auf dem Papier Überblick zu behalten. Die Scheibe in eine kleine Form mit (Insel-haltigen) Fläche nach unten, Parallel zu der Schnittfläche einbetten. Für den Stecker vorsichtig aus der Kassette herausnehmen und in eine kleine Form mit der Spitze in Richtung der Schnittfläche einbetten.
(5) Paraffin-Schnitt und Färbung
- Beschriften Sie Dias nacheinander, wenn Schnittserien erforderlich sind.
- Haben Sie 5 µm Paraffin Abschnitte durch eine erfahrene histotechnikers geschnitten. Um den Ertrag zu maximieren, speichern Sie alle Abschnitte, die Material enthalten. Im allgemeinen ermöglicht sammeln 20 Abschnitte Erfassung von die meisten des Materials.
- Lagern Sie Abschnitten bei Raumtemperatur. Abschnitte sind Routine histologischen Flecke (z. B. H & E) und Immunfluoreszenz (z. B. Insulin, Glukagon und DAPI) zugänglich. Fixierung für andere Antigene, bei Bedarf zu optimieren.
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Representative Results
Eine illustrierte schematische Darstellung der Schritte zur Vorbereitung der Gel-Disc ist in Abbildung 1dargestellt. Dieses Gel Scheibe Methodenergebnisse in Paraffin-Abschnitte, die eine ausreichende Anzahl von Inseln verteilt in einer Ebene um sinnvolle Quantifizierung der Ergebnisse enthalten. Abbildung 2 zeigt niedrige Vergrößerung Bilder der daraus resultierenden Abschnitte um die Anzahl der Inseln erfasst pro Abschnitt zu veranschaulichen. In der Regel > 35 Inselchen in den einzelnen Abschnitten sichtbar waren, wenn 250 IEQ dienten für das Verfahren und > 10 Abschnitte (4 bis 5 µm) mit Inselchen wurden von jeder Probe erhalten. Erhöhung der Anzahl der Inseln, die für das Verfahren verwendet, stieg die Zahl der Inseln in den Abschnitten. Inselchen in Abschnitten waren strukturell vielfältig und in verschiedenen Größen, Unterstützung des Konzepts, dass neue und interessante Daten kann mit Abschnitten anstatt blind für Inter Inselchen Unterschiede Techniken erzielt werden. Die Methode funktioniert ebenso gut für Nager Inselchen im Labor (Ratte, Maus) und für menschliche Inselchen erhalten nach dem Versand durch den IIDP isoliert. Nagetiere Inselchen hatte deutlich mehr intakt Morphologie nach Post-Isolierung Erholung Übernachtung in Insel Medium, mit einer glatten abgerundeten Oberfläche und kompakte Kugelform (Abb. 2A). Morphologie der menschlichen Inselchen war ähnlich, wenn am Tag der Ankunft eingebettet oder nach der Wiederherstellung der Post-Versand über Nacht, vielleicht eingebettet, da die Inseln von Isolierung Stress vor der Auslieferung bereits erholt hatte. Die reaktionscup-Methode ergab eine kleinere Querschnittsfläche mit weniger Inselchen pro Abschnitt, Gewebe und dicht gepackt, Inselchen und Perlen (Abbildung 2B). Die reaktionscup Bilder dargestellt in Abbildung 2B waren das beste, was, die wir mit dieser Methode erhalten konnten; eines der Beispiele musste an weitere Querschnitte, da keine Inselchen in der ersten Reihe von Abschnitten gefunden wurden zurückgeschickt werden.
Diese Technik erzeugt hochwertige Islet Abschnitte für histologische und Immunfluoreszenz-Färbung (Abbildung 3). Insulin und Glukagon Färbung zeigte die vielfältige Zusammensetzung und Heterogenität der Architektur der Insel. In den Abschnitten deutlich rekapitulierte bekannten Architektur Unterschiede zwischen Mensch, Maus und Ratte Inselchen, mit menschlichen Inseln bestehend aus reichlich α-Zellen vermischt mit Beta-Zellen, während Maus und Ratte Inselchen ähnliche Architektur mit einem Beta-Zellen-Kern zeigten und alpha-Zellen in der Peripherie. Serienschnitte waren erhältlich; die Paneele in Abbildung 3 zeigen Schnittserien der gleichen Insel gebeizt für H & E (links) und Immunfluoreszenz (rechts).
Abbildung 1 . Abbildung der kritischen Schritte für die Herstellung der kleinen Insel Gel Disc. Gel erwärmt auf 70 ° C in einem Hitze-Block (A) ist auf die geringe Bindung Microfuge Röhre, enthält das Inselchen/Wulst-Pellet (B)übertragen. Die Inseln sind in warmen Gel Nukleinsäuretablette und auf einen Objektträger, Streugut in eine Scheibenform (C-D)übertragen. Zusätzliche saubere Gel wird auf das Microfuge Rohr übertragen, dann alle restlichen Material entfernt und umlaufend um die ersten Inselchen/Wulst-haltigen Scheibe auf den Objektträger (E-F)zu verbreiten. Nach Gelier-auf Eis, ist die Scheibe übertragen, flache Seite nach unten, zur Histologie Papier (G), die gefaltet und gelegt in einer Kassette (H) für die Verarbeitung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Paraffin Abschnitte von Gel-Discs enthalten eine große Anzahl von gut verteilten kleinen Inseln. (A) geringer Vergrößerung Platten (40 X, 3 x 3 Bilder zusammengefügt, mit 15 % Überlappung) von Maus, Ratte oder menschlichen Inselchen Abschnitte mit H & E gefärbt zeigen, dass viele kleine Inseln in den einzelnen Abschnitten sichtbar sind. Hohe Vergrößerung Kartenausschnitte (200 X) zeigen repräsentative Inselchen. Linken Tafeln zeigen Teile der Inseln eingebettet sofort nach Isolation (Maus, Ratte) oder Versand (menschlichen); richtige Platten zeigen Inselchen nach Übernachtung Erholung in der Kultur eingebettet. Blasse blaue Kreise in 40 X Bilder gesehen sind die Perlen für Visualisierung während einbetten und Schnitt enthalten. Diese besondere Beispiele sind von C57BL/6N Maus (1 Jahr alt) und BBDR Ratte (4 Wochen alt), Inseln isoliert duktale Kollagenase Injektion und Ficoll Trennung und menschliche T2D Inselchen erhielt von der IIDP. (B) 250 IEQ menschliche Inseln pro der alten Microfuge-Rohr-Technik, zum Vergleich eingebettet. Niedrige Vergrößerung Platten (40 X; eine einzelne gelöste Bild erfasst alle Material) und hohe Mag Kartenausschnitte (200 X) zeigen repräsentative Abschnitte. Kulturmedium wurde RPMI mit 10 % FBS, Penicillin/Streptomycin und 5,5 Mmol/L Glucose. Maßstabsleisten für geringer Vergrößerung Panels sind 1000 µm; Maßstabsleisten für hohe Vergrößerung Platten sind 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Vertreter histochemische und Immunfluoreszenz-Färbung auf serielle Inselchen Abschnitte. Abschnitte von Maus, Ratte und menschlichen Inselchen eingebettet, nachdem über Nacht Kultur waren für H & E gefärbt und durch Brightfield Mikroskopie abgebildet (200 X; links). Ein benachbarter Abschnitt war voller Flecken für Insulin (rot), Glukagon (grün), montiert in DAPI-haltigen Medien (blau) und abgebildet, mit Fluoreszenz-Mikroskopie (200 X; rechts). Skalieren Sie Bars: 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Diese modifizierte Gel-Disk-basierte Einbettungs-Methode bietet eine einfache, kostengünstige, und effiziente Möglichkeit, eine hohe Ausbeute an Inseln pro Abschnitt zu generieren. Bau der Gel-Disc auf einer flachen Glasoberfläche erleichtert Verbreitung Inselchen in eine gleichmäßige Verteilung über einen klar definierten Bereich. Verbreitung der Inseln in eine flache Scheibe bietet den Vorteil, setzen viele Inselchen in der Ebene des Abschnitts, Ertrag zu optimieren und damit weniger Inselchen verwendet werden. Die Scheibendicke kann Ermittler Bedürfnisse angepasst werden. Da mehrere Abschnitte abgerufen werden können, können Schnittserien der gleichen Inselchen analysiert werden, die Zahl der unterschiedlichen Ergebnisse, die auf der gleichen experimentellen Probe gemessen werden können. Obwohl hier optimiert für pankreatischen kleinen Inseln, könnte die Technik angewendet werden, auf andere Low-Fülle Material, einschließlich derjenigen mit Kleinteilen, bröckelig Natur oder Viskose Proben, die sonst schwer zu verarbeiten. Diese Methode ist für frisch-feste Inselchen optimiert und nicht für andere Arten von Material wie zuvor fixierten Inselchen getestet wurde. Diese Abschnitte können auch nützlich für in Situ Hybridisierung Assays, DNA oder RNA zu erkennen sein. Die Zugabe von zusätzlichen Gel dient zwei Zwecken: Insel Sammlung zu maximieren und das Inselchen-reiche Disc Center vor Störungen während der Handhabung/Übertragung zu schützen. Die dünnen Gel-Disc schnell erstarrt und ermöglicht verkürzte Dehydrierung und Xylol Infiltration Schritte Paraffin einbetten. Bilden die Disc auf eine flache Oberfläche anstatt in einem sekundären Behälter (Microfuge Rohr oder Kultur Platte gut) erleichtert die physisch die Scheibe an der Kassette zur Bearbeitung übertragen. Im Vergleich mit der Scheibe Technik Ergebnisse hatte die reaktionscup-Technik reduziert Inselchen Ertrag und verklumpt Inselchen Verteilung, obwohl die Gewebe nicht planaren Anordnung eine höhere Anzahl von Insel-haltigen generieren konnte Abschnitte.
Die entscheidenden Schritte des Protokolls gehören Gewebe Fixierung, Bildung der Gel-Scheibe, Paraffin einbetten und schneiden. In Bezug auf Befestigung wurde getestet von H & E und Immunfluoreszenz für Insulin und Glukagon, keinen Unterschied zwischen PFA und Formalin oder Fixierung Dauer von 10-30 Minuten (nicht dargestellt) erkannt. Allerdings sollte die Fixierung Intensität und Dauer für Endbenutzer Bedürfnisse optimiert werden. Die wichtigste Neuerung in diesem Protokoll enthaltenen ist die Vorbereitung der Gel Inselchen Scheibe; wichtige Schritte werden in Abbildung 1zusammengefasst. Wichtige Schritte umfassen die Verwendung einer kleinen Menge des Gels, um Gewebe in einem kleinen Gebiet zu konzentrieren und bilden die Scheibe auf einer flachen Oberfläche des Gewebes in einer Ebene schneiden veranlassen. Einsatz von Low-Bindung Microfuge Röhren und Tipps und eine schwingende Eimer Zentrifuge für alle Spins verbessert Gewebe Ausbeute; Inselchen kleben Kunststoff nach der Fixierung. Zugabe von leicht sichtbar Perlen unterstützt mit Scheibe Bildung, einbetten und schneiden. Entfernen so viel PBS wie möglich vor dem Hinzufügen, dass das Gel zu verdünnen die Agarose entscheidend ist, führt die Armen Erstarrung und Schwierigkeiten, die die Scheibe auf das Papier übertragen. Halten die dünne Scheibe intakt, während schieben Sie ihn aus der Glas-Folie auf das Papier eine Herausforderung sein kann. Tritt eine Falte in der Scheibe, lassen Sie es in die ursprüngliche Position zurück, fügen Sie mehr Gel und neu chill der Folie. In Bezug auf Paraffin einbetten ist es wichtig, dass die Scheibe flach-Seite nach unten und parallel zur Ebene des Schneidens eingebettet werden. Ein histotechnikers mit Paraffin Abschnitte schneiden erlebt ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens, da das Material konzentriert an der Vorderkante des Blocks. Übermäßige Verkleidung aus dem Block kann zum Verlust der Probe führen. Es wird empfohlen, Teile sammeln, sobald die blauen Perlen sichtbar sind.
Fixierung-Intensität und Dauer sollte für den Endverbraucher bestimmte Gewebe und Bedürfnisse optimiert werden. Die Anzahl der Inseln verwendet pro Probe kann bei Bedarf geändert werden. Allerdings erzeugt die Verringerung der Ausgangssubstanz Abschnitte mit weniger Inselchen. Größere oder dickere Scheiben können mit dieser Technik erzeugt werden; Austrocknung und Xylol Infiltration Schritte müssen möglicherweise verlängert werden und sollten optimiert werden. Wenn daraus resultierende Abschnitte nur eine partielle Scheibenform enthalten, betrachten Sie die Möglichkeit, das die Disc nicht Parallel zu den Schnittflächen eingebettet. Wenn zu wenige Abschnitte erhalten werden, kann der Techniker Material bei Anfangsblock Vorbereitung verloren haben.
Diese Methode erzeugt Abschnitte mit festen Inselchen Gewebe und kann als solche nur für histologische Ergebnisse verwendet werden. Um eine große Anzahl von kleinen Inseln pro Abschnitt, 200-250 IEQ zu erhalten wurde Ausgangsmaterial verwendet, das ist eine Herausforderung, um für bestimmte Experiment zu generieren. Qualitativ hochwertige Abschnitte hängen mit einem erfahrenen histotechnikers.
Die Möglichkeit, 10 + Abschnitte mit vielen kleinen Inseln aus einem einzigen versuchsbedingung generieren wird auf dem gleichen Material, experimentelle Effizienzsteigerung Quantifizierung der mehrere Ergebnisse ermöglichen. Routineanalytik intakte Inseln führen zu Fortschritten beim Verständnis im Gewebe Heterogenität, nicht nur auf zellulärer Ebene, sondern auch die Ebene der Insel derzeit über die wenig verstanden wird. Anwendung dieser Technik zu anderen Limited-Fülle Gewebeproben kann Vorteile in anderen Bereichen anbieten.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir erkennen dankbar an die Beta-Zellen-Biologie-Gruppe bei UMass Diabetes Center of Excellence für hilfreiche Ratschläge und Diskussionen. Menschlichen Pankreatische kleinen Inseln wurden durch die NIDDK finanzierte integrierte Islet Distribution Programm (IIDP) bei City of Hope zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von NIH/NIDDK finanziert: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) und von der American Diabetes Association gewähren #1-15-BS-003 (LCA) in Zusammenarbeit mit der Reihenfolge der Amaranth.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
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