Summary
نماذج الاستيلاء الحادة هامة لدراسة الآليات الكامنة وراء الأحداث صرعية. وعلاوة على ذلك، يوفر القدرة على توليد أحداث صرعية عند الطلب طريقة ذات كفاءة عالية لدراسة تسلسل الأحداث الكامنة وراء مبادرتهم. وهنا يصف لنا نماذج الاستيلاء القشرية 4-أمينوبيريديني الحاد في الماوس والأنسجة البشرية.
Abstract
السيطرة على المضبوطات لا تزال قضية تمثل تحديا للمجتمع الطبي. لإحراز تقدم، يحتاج الباحثون طريقة لدراسة ديناميات الاستيلاء على نطاق واسع والتحقيق في آلياتها الأساسية. نماذج الاستيلاء الحادة هي مريحة وتوفر القدرة على إجراء التسجيلات الكهربية ويمكن أن تولد كمية كبيرة من اليكتروجرافيك مثل الاستيلاء على الأحداث (إيكتال). ثم يمكن أن تكون متقدمة نتائج واعدة من نماذج الاستيلاء على حدة نماذج الصرع المزمن والتجارب السريرية. وهكذا، ستكون ضرورية لجعل النتائج ذات الصلة سريرياً دراسة المضبوطات في نماذج الحادة التي تحاكي إخلاص توقيعات الاستيلاء على السريرية اليكتروجرافيك والديناميكية. دراسة الأحداث إيكتال في نماذج الحادة مصادرة إعداد من الأنسجة البشرية مهم أيضا لجعل النتائج ذات الصلة سريرياً. التركيز الرئيسي في هذه الورقة في النموذج 4-AP القشرية بسبب متعددة الاستعمالات في توليد الأحداث إيكتال في الدراسات في فيفو و في المختبر وكذلك في الماوس والأنسجة البشرية. كما وصف طريقة بديلة للاستيلاء على الاستقراء باستخدام نموذج2 + صفر-مغ الطرق الواردة في هذه الورقة ويقدم عرضاً مفصلاً للمزايا والقيود المفروضة على النشاط مثل صرعية التي تم إنشاؤها في مختلف الحادة نماذج الاستيلاء. وعلاوة على ذلك، بالاستفادة من أوبتوجينيتيك المتاحة تجارياً في سلالات الماوس، يمكن استخدام نبضة خفيفة قصيرة (30 مللي ثانية) لتشغيل حدث ictal مماثلة لتلك التي تحدث تلقائياً. وبالمثل، يمكن تطبيق نفث العصبية (زبدي حمض غاما الأمينية أو غلوتامات) 30-100 مللي ثانية للأنسجة البشرية لتحريك الأحداث إيكتال التي تكون مماثلة لتلك التي تحدث تلقائياً. القدرة على تحريك الأحداث إيكتال على الطلب في نماذج الاستيلاء الحادة يوفر القدرة المكتشف حديثا لمراقبة تسلسل الأحداث التي تكمن وراء الاستيلاء على الشروع في ديناميات وتقييم كفاءة العلاجات المضادة الاستيلاء المحتملة.
Introduction
يمكنك استخراج نماذج الاستيلاء على حدة بنجاح تذكرنا الأحداث إيكتال التي لوحظت في للالكهربائي (EEG) للأفراد التي تعاني من الاستيلاء على اليكتروجرافيك التواقيع. الباحثين استخدام هذه الأحداث مثل إيكتال (يشار إليها هنا 'أحداث ictal') كالأمهات البديلات للاستيلاء على حدث1. سريرياً، كأحداث ictal وكيل موثوق بها للاستيلاء على الأحداث منذ المضبوطات هي اضطراب عصبي التي تنشأ من الدماغ. في وحدة مراقبة الصرع، أطباء الأعصاب تعتمد على الكشف عن الأحداث ictal للتأكد من منطقة ابيليبتوجينيك في الدماغ وعزلها لاستئصال2. في وحدة العناية المركزة، رصد الأطباء النشاط ictal تقييم ما إذا كان أي نشاط حجز تصر على المرضى مخدراً3. السيطرة على المضبوطات لا يزال يتعين قضية التي تمثل تحديا للمجتمع الطبي، كما أن 30% مرضى الصرع المقاومة للأدوية لأن الأدوية المتوفرة4،5، و 10 في المائة من الحالات الطبية التي تنطوي على مضبوطات المخدرات التي يسببها لا يستجيب ل العلاج القياسي3. وهذا يعرض يشكل مصدر قلق للمجتمع، كما المنظورة هو 10 في المائة سكان أمريكا تعاني من الاستيلاء على الأحداث في حياتهم و 3% ومن المتوقع وضع الصرع6.
دراسة المضبوطات في نماذج الصرع المزمن هو مكلفة وشاقة، وغالباً ما يستغرق شهورا لإعداد7. كما أن من الصعب إجراء التسجيلات الكهربية في الانتقال بحرية الحيوانات. التجارب السريرية البشرية تواجه قضايا مماثلة، فضلا عن تعقيدات إضافية تتصل بموافقة المريض، تقلب في خلفيات المشاركين و اعتبارات أخلاقية وتشارك8. من ناحية أخرى، نماذج الاستيلاء على حدة، مواتية لأنها ملائمة لإعداد نسبيا وفعالة من حيث التكلفة، وقادرة على توليد كميات كبيرة من الأحداث ictal لدراسة9. بالإضافة إلى ذلك، تم إصلاح الأنسجة في وضع مستقر، حتى الظروف تعتبر مثالية لإجراء التسجيلات الكهربية اللازمة لدراسة ديناميات الاستيلاء والفسيولوجيا المرضية الأساسية ذات الصلة. نماذج الاستيلاء على حدة تظل مواتية أكثر من نماذج في السيليكون (الكمبيوتر) نظراً لأنها تعتمد على المواد البيولوجية ويتألف من شبكة الخلايا العصبية المكونة للدماغ مع جميع العوامل الكامنة والربط متشابك، وأن لم يتم القبض على باستخدام الكمبيوتر حتى أكثر تفصيلاً ونماذج10. هذه الميزات لجعل نماذج الحادة الاستيلاء على وشك أن تكون فعالة في الكشف عن العلاجات المضادة مصادرة المحتملة وجعل النتائج الأولية قبل دفع لهم لإجراء مزيد من التحقيقات في نماذج الصرع المزمن والتجارب السريرية.
بشكل عام، نماذج الاستيلاء الحادة مستمدة من أنسجة المخ المعتادة التي قد تعرض لظروف فرط منفعل. للحث على أحداث ictal ذات الصلة سريرياً في أنسجة المخ السليمة، من المهم أن نفهم أن الدماغ يعمل على النحو الأمثل في حالة حرجة11 متوازنة12فيها الإثارة (ه) وتثبيط (ط). حدوث اضطراب في ه--أنا التوازن يمكن أن يؤدي إلى فرط منفعل الاستيلاء على الدولة التي تتسبب في أحداث إيكتال. وبناء على ذلك، ضمن هذا الإطار المفاهيمي، هناك اثنين من الاستراتيجيات الرئيسية لتوليد أحداث ictal شرائح المخ (في المختبر) أو في الأعمال التحضيرية للجامعة في الدماغ (في فيفو): زادت أو انخفضت تثبيط ("إزالة التثبيط") الإثارة ("غير-إزالة التثبيط"). بيد أن الأحداث ictal مرتبة عالية وتزامن الأحداث التي تتطلب تأثير إينتيرنيورونس جابايرجيك الانسجام في نشاط شبكات عصبونية13،14. ولهذا السبب، نماذج غير إزالة التثبيط هي الأكثر فعالية لتوليد الأحداث إيكتال في الشبكات العصبية معزولة، مثل في في المختبر شريحة الدماغ15، بينما في المختبر نماذج إزالة التثبيط يؤدي عادة إلى النتوءات النشاط تذكر النتوءات الشبيهة إينتيريكتال. وعلاوة على ذلك، ضمن هذا الإطار المفاهيمي، حدث أثناء مزامنة لحظة يمكن أن تؤدي إلى أيضا موثوق حدث إيكتال16. وفي الواقع، حدث ictal يمكن أن تحدثها أي اضطراب طفيف المطبقة على الجهاز العصبي17 عندما يكون في نقطة انتقال ("التشعب") حالة حرجة18. تقليديا، كانت هذه الاضطرابات الناجمة عن التحفيز الكهربائي. لكن التطورات الأخيرة التي أوبتوجينيتيكس في علم الأعصاب، يوفر الآن استراتيجية أكثر أناقة لحمل الدولة الحيوية انتقالات16.
الطرق الموضحة في هذه الورقة لشرح كيفية توليد أحداث ictal على الطلب في نماذج الاستيلاء الحادة في المختبر (الخطوة 1 من البروتوكول) ودراسات في فيفو (الخطوة 2 من البروتوكول). أنها تنطوي على اختيار منطقة الدماغ والاستيلاء على أسلوب الحث ونوع الدراسة والأنواع؛ ومع ذلك، سينصب على اختيار نموذج حادة 4-AP القشرية الاستيلاء الموصى بها بسبب متعددة الاستعمالات في مجموعة متنوعة واسعة من أنواع الدراسة. يقوم نموذج الاستيلاء على 4-AP الحادة في المختبر على بروتوكول قياسي لإعداد شرائح الدماغ عالية الجودة للتسجيلات الكهربية وتصوير الدراسات19. قد استخدمت فعلا هذه البروتوكولات لجعل الشرائح في المختبر الدماغ الاكليلية من قشرة سوماتوسينسوري والحركية للفئران16،البشر و20 21. تعديلات لتوليد الأحداث إيكتال في هذه الأنواع من شرائح المخ سابقا ثبتت16 والتفاصيل الكاملة موصوفة في بروتوكول أدناه. نموذج 4-AP القشرية الاستيلاء الحادة في فيفو يستند إلى بروتوكول قياسي لإعداد اوديما للتصوير الدراسات22. التعديل أن أي إطار (الشريحة الزجاجية) مثبت بعد اوديما. بدلاً من ذلك، وكلاء بروكونفولسانت (4-أ فب) تطبق موضعياً على قشرة المكشوفة للحث على أحداث ictal بينما الحيوان تحت التخدير العام. على حد علمنا، كان لدينا فريق الأول من وضع هذا الحاد في فيفو الاستيلاء القشرية النموذجي في الفئران16،23. الحاد في فيفو الاستيلاء القشرية 4-AP نموذج إعداد من الفئران الكبار وضعت استكمالا لنموذج شريحة في المختبر من نسيج الأحداث. النسخ المتماثل للنتائج التي توصل إليها في نموذج الحجز الكبار في فيفو يساعد على تعميم النتائج المستخلصة من نماذج شريحة بمعالجة الشواغل الكامنة فيما يتعلق بالشروط غير الفسيولوجية شريحة الدماغ 2D (مقابل ثلاثي الجامعة في الدماغ الهيكل) والاختلافات الفسيولوجية بين الأحداث والبالغين الأنسجة.
ويتضح طريقة بدء الحدث إيكتال عند الطلب باستخدام أما نفث العصبية مع استراتيجيات بيكوسبريتزير أو أوبتوجينيتيك. على حد علمنا، مجموعتنا هو الأول من بدء الأحداث إيكتال في الأنسجة البشرية باستخدام أجهزة الإرسال العصبية عبر بيكوسبريتزير16. استراتيجيات أوبتوجينيتيك، من سلالة الفئران C57BL/6 سلالة التقليدية المستخدمة للتعبير عن المتسلسلات. التعبير عن تشانيلرهودوبسين-2 (ChR2) في إينتيرنيورونس جابايرجيك أو جلوتاماتيرجيك الخلايا الهرمية سيوفر القدرة الاختيارية على توليد أحداث ictal على الطلب مع نبضات خفيفة قصيرة. سلالات الفئران أوبتوجينيتيك مناسبة تشمل متغير C57BL/6 المتاحة تجارياً التي تعرب عن ChR2 في إينتيرنيورونس، أما باستخدام الماوس حويصلية غابا الناقل بروموتور (فجأت)24، أو الخلايا الهرمية، باستخدام مستضد خلايا الغدة الصعترية الماوس 1 مروج (Thy1)25. هذه الفئران ChR2 فجأت و Thy1-ChR2 المتاحة تجارياً تتيح الفرصة لتنشيط الخلايا العصبية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك، على التوالي، في اللحاء الجديد مع الأزرق (470 nm) الضوء. القدرة على توليد أحداث ictal على الطلب في نماذج الاستيلاء الحاد يمكن أن تقدم فرصاً جديدة دراسة ديناميات الشروع في ضبط وتقييم كفاءة العلاجات المضادة الاستيلاء المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجرى جميع البحوث التي تنطوي على المرضى تحت بروتوكول التي وافق عليها "المجلس أخلاقيات جامعة الصحة شبكة البحوث" وفقا "إعلان هلسنكي". الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية من قبل "المجلس الكندي للعناية بالحيوان" ووافقت عليها "اللجنة رعاية الحيوان كريمبيل بحوث المعهد".
1-البروتوكول الأول: الحادة في المختبر "النموذجي الاستيلاء"
- إعداد الحلول التشريح والسائل الدماغي النخاعي اصطناعية
- كاربوجيناتي الماء عالي النقاوة (وهو المياه التي تمت تصفيتها مع أومه 18.2 MΩ·cm) مع كاربوجين (95% O25% CO2) لمدة 5 دقائق باستخدام الهواء حجر الفقاقيع (أجهزة التهوية لأحواض السمك).
ملاحظة: يمكن توصيل الأحجار الهواء إلى منظم عبر أنابيب خزان كاربوجين سيليكون القياسية. إذا لم تتوفر الحجارة الهواء، ختم إغلاق نهاية الأنبوب سيليكون وكزه الثقوب الصغيرة في الختم للسماح بالغاز كاربوجين إلى فقاعة بها وكاربوجيناتي الحل. - تحضير حلاً تشريح بتذويب الذوائب من الجدول 1 في الماء عالي النقاوة. إضافة كاكل2 إلى حل الذي تم كاربوجيناتيد لمدة 5 دقائق على الأقل لمساعدته على حل.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، أضف كاكل2 أولاً، ذلك لأنه يمكن أن يحل بسهولة في إيجاد حل غير المشبعة. الحل في شكل سائل، ينبغي أن يكون موسم 300-320/L والرقم الهيدروجيني 7.4 بعد يجري مشبعة كاربوجين.- البرد حل تشريح 0-4 درجة مئوية. اترك الحل في الثلاجة بين عشية وضحاها أو وضع الحل في الثلاجة ح 1 ومراقبة درجة الحرارة بشكل مستمر.
ملاحظة: يمكن تخزين الحل تشريح لمدة تصل إلى ثلاث ليال؛ تجاهل بعد ذلك. - كاربوجيناتي الحل تشريح لمدة 5-10 دقيقة قبل الاستخدام.
ملاحظة: من الناحية المثالية، الحل يجب أن تظهر أما كطين أو يكون الانتقال إلى طين قبل الاستخدام.
- البرد حل تشريح 0-4 درجة مئوية. اترك الحل في الثلاجة بين عشية وضحاها أو وضع الحل في الثلاجة ح 1 ومراقبة درجة الحرارة بشكل مستمر.
- إعداد القوارض من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام) بإذابة الذوائب من الجدول 2 (أو الجدول 3 لقام البشرية) في الماء عالي النقاوة. كاربوجيناتي الحل قام في حين أنها في حمام مياه ساخنة إلى 35 درجة مئوية حتى الاستخدام. إضافة كاكل2 إلى حل الذي تم كاربوجيناتيد لمدة 5 دقائق على الأقل لمساعدته على حل.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، إضافة كاكل2 أولاً حيث أنه يمكن حل أسهل في إيجاد حل غير المشبعة. الحل في شكل سائل، ينبغي أن يكون موسم 290-320/L والرقم الهيدروجيني 7.4 بعد يجري مشبعة كاربوجين. وينبغي بذل الحلول في وحدات التخزين 1 أو 2 أو 4 لتر حسب مدة التجارب. جعل 4 L لمدة يوم كامل (8 ساعات) للتجارب. قام ينبغي أن الطازجة كل يوم؛ لا تقم بتخزينها لفترة أطول من 1 د.
- كاربوجيناتي الماء عالي النقاوة (وهو المياه التي تمت تصفيتها مع أومه 18.2 MΩ·cm) مع كاربوجين (95% O25% CO2) لمدة 5 دقائق باستخدام الهواء حجر الفقاقيع (أجهزة التهوية لأحواض السمك).
- تشريح الماوس لجمع أنسجة المخ
ملاحظة: للأنسجة البشرية، انتقل إلى الخطوة التالية (الخطوة 1، 3) على جعل شرائح الدماغ مع فيبرتوم. ينبغي الحصول على القطع على شكل مكعبات (1 سم3) من أنسجة المخ من الأعصاب استخدام الإجراءات الموصوفة سابقا26،27.- جمع جميع الأدوات والمواد اللازمة لتشريح الحيوان. قم بإعداد مساحة العمل للتحضير لتشريح الحيوان.
- تحقق في خزان كاربوجين (95 ٪ س2/5%CO2) للتأكد من أنه ليس فارغاً. استبدال اسطوانة غاز قبل التجارب إذا كان هناك أقل من 500 رطل ضغط المتبقية.
- معايرة فيبرتوم (تهتز بتقطيع اللحم والأنسجة بليد) وفقا لدليل إرشادات الشركة المصنعة. ضبط فيبرتوم تعيين سعة قطع من 1 ملم وسرعة قطع 0.12 mm/s.
ملاحظة: قد تختلف الإعدادات المثلى لكل الفردية تهتز أنسجة النصل القاطع؛ ومع ذلك، بشكل عام، ينبغي أن تكون السعة العالية وسرعة القطع يجب أن يكون منخفضا. - ملء قاعة حضانة شريحة الدماغ (أي، حارس شريحة الدماغ) مع قام وفقاعة أنه مع كاربوجين. ثم وضع في غرفة الحضانة في حمام مائي في 35 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدم القوارض قام لشرائح الدماغ القوارض وقام البشرية لشرائح المخ البشري.
- الحصول على ماوس الأحداث من أي من الجنسين، بين سن 13 د (p13) إلى د 21 (p21، حيث p0 هو تاريخ الميلاد).
- تخدير الماوس مع حقن داخل من الصوديوم بينتوباربيتال (55 مغ/كغ وزن الجسم). بمجرد عميق تخديره الماوس، كما يتبين من غياب منعكس قرصه أخمص القدمين، على الفور استخدام أداة مقصلة الموافقة على التعليم والتدريب المهني لقطع رأس الماوس في حركة سريعة واحدة.
ملاحظة: يعد الحقن بينتوباربيتال الصوديوم وفقا للإجراءات التي أوصت بها المبادئ التوجيهية المؤسسية. - عقد الآنف الماوس على استقرار مقطوعة الرأس وجعل شق خط الوسط ابتداء من بين العيون للماوس وعلى طول فروة الرأس لفضح الجمجمة بلطف. ضمان لم يتم ضغط الجمجمة بالضغوط التي مورست قبل الحلاقة. استخدام زاوية حافة الشفرة لزيادة دقة قطع.
- انتشار عدا اللوحات لفروة الرأس الماوس باستخدام الأصابع لفضح الجمجمة. ثم، استخدم الزاوية الطازجة من الحافة الشائكة جعل شق على طول خط الوسط من الجمجمة؛ إيلاء اهتمام دقيق لتجنب أي اتصال مع قشرة الدماغ.
- إدراج منشقة الملقط إلى مأخذ العين الماوس على استقرار مقطوعة الرأس ووضعه في طبق بتري مليئة الباردة (0-4 درجة مئوية) الحل التشريح. تأكد من أن الرأس هو مغمورة تماما في الحل تشريح.
- استخدام مجموعة ثانية من الملقط منشقة للطف قشر فروة الرأس الماوس بعيداً، إزالة عظم الآنف تقشير أنه، وإزالة الجزء الخلفي (الجانب والذيلية) للجمجمة.
ملاحظة: عظم الآنف من الفئران الأحداث لينة جداً وكسر بسهولة. - استخدام ملعقة صغيرة لقص الأعصاب البصرية، تريجيمينال الأعصاب، والحبل الشوكي. ثم، استخدم ملعقة صغيرة بلطف فصل الدماغ الجمجمة. ترك الدماغ مغمورة تماما في طبق بتري مليئة بتشريح الحل.
- جمع جميع الأدوات والمواد اللازمة لتشريح الحيوان. قم بإعداد مساحة العمل للتحضير لتشريح الحيوان.
- إعداد شرائح القشرية من قشرة سوماتوسينسوري موتور
- ملء علبة المخزن المؤقت فيبرتوم مع ~ 150 مل البرد (0-4 درجة مئوية) الحل التشريح.
ملاحظة: بشكل اختياري، إبقاء علبة المخزن المؤقت في الثلاجة حتى الحاجة للحفاظ على درجة حرارة منخفضة أثناء إجراء تشريح. - الصق أنسجة المخ من الماوس أو الإنسان على خشبة المسرح فيبرتوم (العينة حامل/صينية) استخدام الغراء لاصق الفورية. للفئران، قطع والذيلية جزء صغير من الدماغ (أي، المخيخ) حيث أنه يمكن أن يتم لصقها بسهولة شقة على صاحب العينة (السماح للجانب روسترال من الدماغ لمواجهة الحد الأقصى).
ملاحظة: بدلاً من ذلك، شرائح المخ الماوس الأفقي يمكن أن تعده الالتصاق الجهة الظهرية من الدماغ على صاحب العينة (الجانب البطني للمخ ينبغي أن يواجه السقف)28. - بلطف ضع صاحب العينة (مع أنسجة المخ) داخل علبة المخزن المؤقت. التأكد من أن يواجه الجزء الظهرية الدماغ الشفرة فيبرتوم.
ملاحظة: من المهم لتقليل مقدار الوقت يتعرض الدماغ للهواء.
- ملء علبة المخزن المؤقت فيبرتوم مع ~ 150 مل البرد (0-4 درجة مئوية) الحل التشريح.
- تقطيع أنسجة المخ وجمع
- شريحة الدماغ إلى شرائح سميكة ميكرومترات 450 استخدام في فيبرتوم في الظهرية إلى اتجاه البطني. ضمان بقاء الدماغ مرتبط تماما بعلبة العينة بينما تشريح ذلك.
- جعل في أول خطوة من نوعها في الدماغ الماوس لإزالة لمبة شمي. ثم، وجعل التخفيضات اللاحقة حتى يتم ملاحظة منطقة موتور somatosensory (تقع في منتصف الطريق تقريبا بين لمبة شمي وبريجما).
ملاحظة: بشكل اختياري، شريحة الدماغ في أرق (200 ميكرومتر) شرائح حتى يظهر كلثوم الإحضار في رأي الاكليلية من الدماغ، والذي يشير إلى أن منطقة somatosensory موتور الوثيق.
- جعل في أول خطوة من نوعها في الدماغ الماوس لإزالة لمبة شمي. ثم، وجعل التخفيضات اللاحقة حتى يتم ملاحظة منطقة موتور somatosensory (تقع في منتصف الطريق تقريبا بين لمبة شمي وبريجما).
- استخدام ماصة نقل تحمل على نطاق لجمع شرائح الاكليلية (450 ميكرو) التي تحتوي على منطقة سوماتوسينسوري والحركية وتغرق منها في طبق بتري يحتوي على الباردة (0-4 درجة مئوية) الحل التشريح.
- استخدام شفرة حلاقة جديدة وقطع الأنسجة الزائدة أي من الشرائح. للحصول على شرائح الاكليلية من الفئران، أداء عرضية قص أسفل كوميسوري نيوكورتيكال (أي، كلثوم الإحضار). لا تقطع في حركة ساوينج؛ ببساطة تطبيق الضغط على الشفرة الأنسجة واستخدام فرشاة تعرض بالتفصيل لفصل الأنسجة بلطف. تأكد من تقليل حركة الشريحة الاكليلية.
- استخدام ماصة نقل تحمل على نطاق لنقل الجزء الظهرية الاكليلية الشرائح التي تحتوي على اللحاء الجديد (طبقة 1-6) إلى طبق بتري ثاني مليئة بالدفء (35 درجة مئوية) قام للحظة (~ 1 s). ثم، على الفور نقل الشرائح إلى غرفة حضانة التي تحتوي على كاربوجيناتيد الحارة (35 درجة مئوية) قام.
ملاحظة: غرض نقل إلى طبق بتري مع قام لتقليل نقل الحل التشريح إلى غرفة الحضانة بينما نقل شرائح المخ مع ماصة واسعة-تتحمل. تستخدم الدائرة حضانة آبار متعددة للحفاظ على شرائح مختلفة من الدماغ ونظم. - تجاهل بقية الدماغ والذبيحة الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- شريحة الدماغ إلى شرائح سميكة ميكرومترات 450 استخدام في فيبرتوم في الظهرية إلى اتجاه البطني. ضمان بقاء الدماغ مرتبط تماما بعلبة العينة بينما تشريح ذلك.
- الاحتضان وصيانتها
- تترك شرائح المخ مغمورة قليلاً في غرفة الحضانة عند 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم إزالة غرفة الحضانة من حمام المياه والسماح لها بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية). انتظر ح 1 لشرائح المخ لاسترداد قبل إجراء التسجيلات الكهربية.
ملاحظة: تأكد من هناك لا فقاعات الهواء التي تجمع تحت شرائح الدماغ في غرفة الحضانة. فقاعات الهواء هي واجهات الجوية التي تتسبب في تلف الأنسجة. يمكن الحفاظ على شرائح المخ الماوس ح 6-8، بينما يمكن تخزين أنسجة المخ البشري ليصل إلى 24 ساعة في غرفة حضانة كاربوجيناتيد جيدا مع قام المناسبة.
- تترك شرائح المخ مغمورة قليلاً في غرفة الحضانة عند 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم إزالة غرفة الحضانة من حمام المياه والسماح لها بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية). انتظر ح 1 لشرائح المخ لاسترداد قبل إجراء التسجيلات الكهربية.
- التسجيلات الكهربية للطبقة القشرية سطحية
ملاحظة: يلاحظ الأحداث إيكتال في التسجيلات الميدانية المحلية خارج الخلية (طابعات الحجم الكبير) المحتملة من شرائح المخ. يمكن ملاحظة طابعات الحجم الكبير شريحة الدماغ وتسجل مع نوع واجهة دائرة29 أو نظام مغمورة صفيف متعدد قطب (طيران الشرق الأوسط)16. الإجراء الذي تم وصفه سابقا16 ويرد أدناه وصف تفاصيل إضافية.- استخدام ماصة نقل تحمل على نطاق أو فرشاة تعرض بالتفصيل لنقل شريحة الدماغ على أكبر قليلاً العدسة قبل قطع الورق الذي يقام في مكان استخدام الملاقط طب أسنان. نقل الورق العدسة (الذي هو يستريح شريحة الدماغ على) إلى دائرة التسجيل وتأمينه في الموقف مع شاشة القيثارة.
- تشغيل الحار (35 درجة مئوية)، كاربوجيناتيد قام بيرفوساتي من خلال دائرة التسجيل عبر شريحة الدماغ بمعدل 3 مل/دقيقة (~ 1 بالتنقيط/s). استخدام مقياس حرارة رقمي لضمان الدائرة تسجيل 33-36 درجة مئوية.
- سحب الزجاج كهربائي مع مقاومة MΩ 1-3 من أنابيب زجاج البورسليكات (مع قطر خارجي من 1.5 مم) باستخدام ساحبة. الردم أقطاب الزجاج مع قام (~ 10 ميليلتر) استخدام المحاقن هاملتون. تجاهل مسرى فورا إذا كان التلميح معطوب.
ملاحظة: التبييض سلك الفضة (5 دقائق) والسماح فقط لجزء الحد أدنى (أي، في التلميح) الأسلاك الفضية تكون غارقة في الأقطاب قام الزجاج مملوءة بالعودة لتقليل الضوضاء والانجراف خلال التسجيلات. إزالة أي قام الزائدة من الزجاج الكهربائي مع حقنه هاملتون إذا لزم الأمر. - استخدام مجهر ستيريو 20 X بدقة دليل تسجيل الزجاج الكهربائي إلى سطحية القشرية الطبقة (2/3) باستخدام دليل المتلاعبين. سجل/عرض النشاط الكهربائي للمخ الشريحة على جهاز كمبيوتر مع البرامج القياسية.
ملاحظة: سوف يحمل شرائح قابلة للتطبيق (عالية الجودة) الدماغ محتملة مقولة قوية في الاستجابة للمحفزات الكهربائية التطبيقية (المايكروثانيه 100، 30-300 μA) أو نبضات الضوء (30 مللي ثانية، 10 ميغاواط/مم2) للأنسجة أوبتوجينيتيك.
- أنشطة مثل الاستيلاء
- نتخلل قام تحتوي على 100 ميكرومتر 4-أمينوبيريميديني (4-AP) على شريحة الدماغ. حل 80 ملغ 4-AP في 8.5 مل من الماء لجعل حل أسهم من 100 ملم 4-آب إضافة 100 ميليلتر حل الأسهم 4-AP 100 مم إلى 100 مل قام لتحقيق بيرفوساتي قام مع 100 ميكرومتر 4-AP.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدم صفر-Mg2 + قام (الجدول 4)، حلاً قام معدلة تتضمن لا المضافة Mg2 +, نتخلل شريحة الدماغ. للأنسجة البشرية، واستخدام تركيبة من 100 ميكرومتر 4-أ فب في صفر-Mg2 + "قام البشرية" (الجدول 5) إلى تحقيق النتائج المثلى. متوسط الوقت اللازم لإحداث إيكتال أن يظهر 15 دقيقة؛ ومع ذلك، قد يستغرق مدة تصل إلى 40 دقيقة لبعض شرائح المخ.
- نتخلل قام تحتوي على 100 ميكرومتر 4-أمينوبيريميديني (4-AP) على شريحة الدماغ. حل 80 ملغ 4-AP في 8.5 مل من الماء لجعل حل أسهم من 100 ملم 4-آب إضافة 100 ميليلتر حل الأسهم 4-AP 100 مم إلى 100 مل قام لتحقيق بيرفوساتي قام مع 100 ميكرومتر 4-AP.
- جيل الاستيلاء على الطلب: استراتيجية أوبتوجينيتيك للفئران أوبتوجينيتيك
- تطبيق نبضة قصيرة (30 مللي ثانية) الأزرق (470 nm) خفيفة (بكثافة إنتاج2 ميغاواط 1 الحد أدنى/مم) الشروع في حدث إيكتال. استخدم مناور يدوي لوضع مكم 1,000 أساسية قطرها ألياف ضوئية (0.39 نا) مباشرة فوق منطقة التسجيل.
ملاحظة: تعيين معدل الصور--تحفيز لمطابقة المعدل المنشود لوقوع الحدث إيكتال (أي1 نبض كل 50 ثانية). بيد أن معدل لا يمكن المبالغة مفرط من معدل الجوهرية التي تحدث الأحداث ictal.
- تطبيق نبضة قصيرة (30 مللي ثانية) الأزرق (470 nm) خفيفة (بكثافة إنتاج2 ميغاواط 1 الحد أدنى/مم) الشروع في حدث إيكتال. استخدم مناور يدوي لوضع مكم 1,000 أساسية قطرها ألياف ضوئية (0.39 نا) مباشرة فوق منطقة التسجيل.
- جيل الاستيلاء على الطلب: استراتيجية غير أوبتوجينيتيك للأنسجة البشرية
- ضع شريحة الدماغ حيث أن الطبقات السطحية من المنبع، والطبقات العميقة المصب لتدفق بيرفوساتي من خلال دائرة التسجيل.
- سحب من زجاج كهربائي (نفس النوع كالمستخدمة للتسجيلات طابعات الحجم الكبير) واللمس بلطف طرفها مع ممسحة مهمة حساسة لإنشاء فتحه صغيرة. الردم مسرى مع ~ 25 ميليلتر من 100 ملم غابا (يذوب في الماء) وإرفاقه بيكوسبريتزير. وبدلاً من ذلك، الردم مسرى مع 200 ميكرومتر غلوتامات (يذوب في الماء).
ملاحظة: لتقدير حجم يجري ينفخ من بيكوسبريتزير (~ 50 ميليلتر)، تنطبق نفخة اختبار على صفيحة بلاستيكية (يفضل أن تكون الشبكية). ثم قم بتطبيق معالجة تجميعية لوحدات التخزين المعروفة (أي10 ميليلتر، 20 ميليلتر، ميليلتر 50 أو 100 ميليلتر) مع ماصة لمقارنة مع نفخة الاختبار. - تطبيق نفث العصبي (GABA أو غلوتامات) على الأنسجة البشرية مع بيكوسبريتزير (10-20 psi مدة 30-100 مللي ثانية) الشروع في حدث إيكتال. تطبيق نفخة واحدة من 100 ملم GABA إلى الطبقة العميقة (5) من أنسجة المخ لتوليد الأحداث إيكتال في طبقة سطحية (2/3). وبدلاً من ذلك، تنطبق نفخة واحدة من 200 ميكرومتر غلوتامات مباشرة على الطبقة السطحية لتوليد الأحداث إيكتال في طبقة سطحية.
ملاحظة: تعيين معدل بيكوسبريتزير نفخة لمطابقة المعدل المنشود لوقوع الحدث إيكتال (أي1 نبض كل 50 ثانية). بيد أن معدل لا يمكن المبالغة مفرط من معدل الجوهرية التي تحدث الأحداث ictal.
2-البروتوكول الثاني: الحاد في فيفو "نموذج الحجز"
-
إعداد العمليات الجراحية وجراحة
- الحصول على ماوس الكبار (p35-p60) من أي من الجنسين.
- تخدير عميق الماوس مع الكيتامين (95 مغ/كغ) وإكسيلازيني (5 ملغ/كغ). إجراء اختبار تو-رشة منعكس لضمان هو مخدراً الماوس. بدلاً من ذلك، استخدم إيسوفلوراني (4% لتحريض، 1.5-2% للجراحة) لتخدير الماوس.
ملاحظة: يمكن أن يؤثر اختيار المسكنات في30،النشاط الاستيلاء على31. - جبل الماوس في إطار ستيريوتاكسيك بتأمين رئيسها مع أشرطة الإذن. ضع وسادة ساخنة تحت الماوس لمدة الجراحة.
- الجزء العلوي من الرأس الماوس استخدام المتقلب القوارض تعريض فروة الرأس للحلاقة. حقن 0.3 مل يدوكائين مع 25 5/8 في إبرة في السمحاق لتجنب النزيف أو الألم. تطبيق مرهم العين لعيون الماوس لمنعها من الجفاف خلال التجربة.
- قرصه ورفع مركز فروة الرأس الماوس تقييم ما إذا كانت ردود الفعل، قد ولت. وفي وقت لاحق، أداء أفقي قص لفضح بريجما للمنطقة لامدا للجمجمة. بلطف كشط كامل المنطقة المعرضة للجمجمة مع مسحه القطن إنشاء سطح جاف.
- أداء اوديما 4 مم في القطر في الإحداثيات روستروكودال لاتيروميديال ومم-2.00 مم 2.0 لفضح قشرة somatosensory. وضع علامة على موقع مع دائرة (4 ملم في القطر) باستخدام علامة دائمة. حفر حولها الدائرة مع حفر أسنان هوائي حتى يعطي الطبقة المتبقية من عظم اوديما بسهولة طريقة عند الضغط باستمرار. تطبيق المحلول الملحي على طبقة العظام قبل إزالة اوديما مع الملقط منشقة. وفي وقت لاحق، تطبيق المحلول الملحي الدافئ إلى منطقة مكشوفة.
-
أساليب التسجيل وتحريض مضبوطات المواد الكيميائية
- سحب الزجاج كهربائي مع مقاومة MΩ 1-3 من أنابيب زجاج البورسليكات (مع قطر خارجي من 1.5 مم) باستخدام ساحبة. الردم أقطاب الزجاج مع ~ 10 ميليلتر من قام أو المحلول الملحي هاملتون باستخدام المحاقن. تجاهل مسرى فورا إذا كان التلميح معطوب.
ملاحظة: التبييض سلك الفضة (5 دقائق) والسماح فقط لجزء الحد أدنى (أي، في التلميح) الأسلاك الفضية تكون غارقة في الأقطاب قام الزجاج مملوءة بالعودة لتقليل الضوضاء والانجراف خلال التسجيلات. إزالة أي قام الزائدة من الزجاج الكهربائي مع حقنه هاملتون إذا لزم الأمر. - استخدام مناور يدوي لتوجيه مسرى الزجاج إلى سطحية القشرية الطبقة (2/3) في منطقة سوماتوسينسوري والحركية. سجل/عرض النشاط الكهربائي للمخ الشريحة على جهاز كمبيوتر مع البرامج القياسية.
ملاحظة: الطبقة 2/3 عميق من السطح32حوالي 0.3 مم. - تطبيق موضعياً المحلول الملحي 1.5 مم 4-AP مل ~0.5 على قشرة المكشوفة للماوس مع حقنه حتى يغطي تماما اوديما. حل ملغ 14 من AP 4 في 100 مل من المحلول الملحي متساوي التوتر لجعل حل أسهم من 1.5 مم 4-AP المالحة.
ملاحظة: تعد المياه المالحة 4-AP قبل بدء التجربة. وفي المتوسط، تظهر الأحداث إيكتال 15-30 دقيقة بعد التطبيق الموضعي.
- سحب الزجاج كهربائي مع مقاومة MΩ 1-3 من أنابيب زجاج البورسليكات (مع قطر خارجي من 1.5 مم) باستخدام ساحبة. الردم أقطاب الزجاج مع ~ 10 ميليلتر من قام أو المحلول الملحي هاملتون باستخدام المحاقن. تجاهل مسرى فورا إذا كان التلميح معطوب.
-
توليد الطلب على المضبوطات في الفئران أوبتوجينيتيك
- تطبيق نبضة قصيرة (30 مللي ثانية) الأزرق (470 nm) خفيفة (بحد أدنى 10 ميغاواط/مم2 كثافة إخراج) الشروع في حدث إيكتال. استخدم مناور يدوي لوضع مكم 1,000 أساسية قطرها ألياف ضوئية (0.39 نا) مباشرة فوق منطقة التسجيل.
ملاحظة: تعيين معدل الصور--تحفيز لمطابقة المعدل المنشود لوقوع الحدث إيكتال (أي1 نبض كل 300 ثانية). بيد أن معدل لا يمكن المبالغة مفرط من معدل الجوهرية التي تحدث الأحداث ictal.
- تطبيق نبضة قصيرة (30 مللي ثانية) الأزرق (470 nm) خفيفة (بحد أدنى 10 ميغاواط/مم2 كثافة إخراج) الشروع في حدث إيكتال. استخدم مناور يدوي لوضع مكم 1,000 أساسية قطرها ألياف ضوئية (0.39 نا) مباشرة فوق منطقة التسجيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تطبيق 100 ميكرومتر 4-AP إلى شرائح الدماغ القشرية ميكرومتر الحجم 450 (التالفة) ذات النوعية الجيدة من الأحداث ChR2 فجأت موثوق بها التي يسببها متكررة ictal أحداث ماوس (> 5 ق) ضمن 15 دقيقة (الشكل 1Ai). تطبيق 100 ميكرومتر 4-وكالة اسوشييتد برس لشرائح من رداءة أسفر انفجار الأحداث أو النتوءات النشاط (الشكل 1Aii). وفي المتوسط، 40% الشرائح من كل الماوس تشريح الدماغ بنجاح إنشاء الأحداث ictal. وعلاوة على ذلك، أدى 83% (25/30) من الفئران تشريح الدماغ واحدة على الأقل من الشرائح التي ولدت الأحداث إيكتال بنجاح. شرائح المخ بصورة عفوية تحدث الأحداث ictal، تطبيق نبضة قصيرة 30 مللي الخفيفة على شريحة الدماغ موثوق بها آثار حدث إيكتال التي كانت متطابقة في مورفولوجيا (الرقم 1Aiii و 1Aiv). وقدمت نتائج نفس شرائح الدماغ من الفئران Thy1-ChR2 (الشكل 1B). وهكذا، بغض النظر عن تنشيط الخلايا العصبية يتدنى فيها، أي موجز مزامنة الحدث في عزل الشبكة العصبية القشرية أدت إلى بداية حدث ictal. تتألف هذه الأحداث ictal الحارس سبايك (برييكتال) (الشكل 2Aii و 2Bii)، منشط مثل إطلاق (الشكل 2Aiii و 2Biii) وإطلاق رمعي مثل (الشكل 2Aiv و 2Biv)، والنشاط انفجار نهاية (الشكل 2Av و 2Bv)؛ أنها مماثلة في طبيعتها للتواقيع اليكتروجرافيك المرتبطة بمضبوطات السريرية33. وعلاوة على ذلك، كانت هذه الفئران الأحداث الفيزيولوجية الكبار مثل إضافة 10 ميكرون bumetanide (بوم)، مانع NKCC1، قد لا يؤثر على أحداث ictal الناتجة عن ذلك (الشكل 2).
نموذج 4-AP شريحة القشرية في المختبر موثوق ولدت تتفق أحداث ictal ح ~ 1 (رقم 1Ai)، بينما عادة إنشاء طراز2 + صفر-ملغ ictal أحداث ~ 10 دقيقة قبل تحويل سريعاً إلى نشاط مثل الاندفاع ( الشكل 3 ألف). ومع ذلك، إذا كان مطلوب أسلوب غير 4-وكالة اسوشييتد برس للاستيلاء على الاستقراء، يمكن تعديل طراز2 + صفر-مغ بالإضافة إلى 5-10 ميكرون باكلوفين (مستقبلات GABAب مؤثر) لتحويل النشاط انفجار يعود إلى أحداث إيكتال (الشكل 3B) . بشكل عام، تستنسخ أساليب إزالة التثبيط لزيادة استثارة (أي، 4-AP أو صفر-Mg2 + قام) موثوق بها الأحداث إيكتال في الدماغ القشرية شرائح. على العكس من ذلك، أدت إلى أساليب إزالة التثبيط [أي، بيكوكوليني (مؤشر كتلة الجسم)، خصم مستقبلات GABAA ] النتوءات النشاط يذكرنا بنشاط إينتيريكتال أو تمزق النشاط، بدلاً من الأحداث إيكتال (الشكل 4 أ). وبالمثل، ولدت نماذج الاستيلاء الحادة أعدت من ميكرومتر 100 4-AP-تعامل شرائح هيبوكامبال إينتيريكتال التشويك نشاط أو مركز epilepticus تشبه ظروف تشبه في CA3 (الشكل 4 باء). في المقابل ولدت في فيفو 4-AP القشرية نموذج أحداث ictal المتكررة (> 5 ق). أحداث ictal لوحظت في سطحية طبقة (2/3) ضمن ~ 30 دقيقة لتطبيق موضعياً 1.5 مم 4-AP على قشرة الكبار ChR2 فجأت الفئران المعرضة. تطبيق نبضة ms 30 موجز الخفيفة على قشرة المكشوفة موثوق بها آثار الأحداث ictal شكلياً مماثلة لتلك التي تحدث تلقائياً (الشكل 5).
التطبيق صفر-Mg2 + ولدت قام البشرية مع 100 ميكرومتر 4-AP إلى شرائح الدماغ القشرية 'غير صرع' (450 ميكرون) من مرضى الصرع الفص الصدغي موثوق الأحداث ictal المتكررة (> 5 ق) داخل ~ 30 دقيقة (الرقم 6Ai و 6Bi). إنشاء شرائح من نوعية رديئة التشويك نشاط أو أي نشاط (الشكل 1Aii). يعتبر بقاء شرائح المخ 'الجيدة' عندما فعل حافزا كهربائية قصيرة (المايكروثانيه 100، 30-300 µA) استجابة قوية، أحدثت في طابعات الحجم الكبير في بداية التجربة. حالما بدأت الأحداث ictal تعمد إلى، تطبيق نفخة قصيرة (75 مللي ثانية في 20 رطل/بوصة مربعة) من 100 ملم غابا على شريحة الدماغ تشغيل موثوق بها الأحداث إيكتال التي كانت متطابقة في التشكل لتلك التي تحدث تلقائياً (الشكل 6Aii و 6Aiii) . انخفاض تركيز غابا، 100-200 ميكرومتر، سيكون على الأرجح فعالة، وكذلك في المختبر التجارب34؛ ومع ذلك، ينصح بأعلى تركيز لغابا، 100 ملم، في فيفو تجارب35. استنسخت الملاحظات نفسها عندما تم تطبيقها نفخة قصيرة من 200 ميكرومتر غلوتامات على شرائح المخ البشري (الشكل 6Bii و 6Biii). وهكذا، بغض النظر عن مستقبلات متشابك اللاحقة التي تم تنشيطها، آثار حدث مزامنة موجز في الشبكة العصبية القشرية البشرية المعزولة موثوق حدث إيكتال.
الشكل 1: الحادة في المختبر النموذجي 4-AP القشرية الاستيلاء. خطوط سوداء تمثل المحلية ميدان المحتملة (طابعات الحجم الكبير) تسجيل؛ الخطوط الزرقاء تمثل الحافز الخفيفة. (أ) هذه الأفرقة هي استناداً إلى النتائج من طراز ماوس ChR2 فجأت. أنها توضح الأحداث إيكتال التي لوحظت في تسجيل طابعات الحجم الكبير من طبقة سطحية (2/3) شريحة الدماغ القشرية عالية الجودة تعامل مع 100 ميكرومتر 4-آب أنا) يظهر هذا الفريق عرضاً عاماً لتسجيل طابعات الحجم الكبير. الثاني) وهذه أمثلة من طابعات الحجم الكبير تسجيل من شرائح المخ رديئة النوعية. شريط المقياس الرأسي هو 0.4 mV، شريط المقياس الأفقي 20 س. ثالثا) هذا رأي التكبير في حدث إيكتال تشغيل الضوء. رابعا) هذا رأي التكبير في حدث ictal عفوية. (ب) الفريق هذه تستند إلى النتائج من طراز Thy1-ChR2 ماوس. أنها توضح الأحداث إيكتال التي لوحظت في تسجيل طابعات الحجم الكبير من طبقة سطحية (2/3) شريحة الدماغ القشرية تعامل مع 100 ميكرومتر 4-آب أنا) يظهر هذا الفريق عرضاً عاماً لتسجيل طابعات الحجم الكبير. ثانيا) هذا رأي التكبير في حدث إيكتال تشغيل الضوء. ثالثا) هذا رأي التكبير في حدث ictal عفوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إنشاء أحداث إيكتال في شريحة الدماغ (الطبقة 2/3) من حدث (p13) الماوس ChR2 فجأت perfused مع 4-AP و bumetanide (بوم). تمثل الخطوط السوداء المحلية ميدان المحتملة (طابعات الحجم الكبير) تسجيل؛ الخطوط الزرقاء تمثل الحافز الخفيفة. (أ) تظهر هذه اللوحات عفوية الحدث إيكتال. أنا) هذا الفريق يعرض لمحة عامة عن مجمل الحدث إيكتال. إظهار اللوحات التالية الثاني) سبايك الحارس، ثالثا) منشط مثل إطلاق النار، رابعا) رمعي مثل إطلاق النار، و الخامس) انفجار النشاط. (ب) إظهار هذه الألواح حدثاً ictal تشغيل الضوء. أنا) هذا الفريق يعرض لمحة عامة عن مجمل الحدث إيكتال. إظهار اللوحات التالية الثاني) طفرة أدت الضوء الحارس من شريحة نفس التسجيل، و ثالثا) منشط مثل إطلاق النار، رابعا) رمعي مثل إطلاق النار، و الخامس) انفجار النشاط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الحادة في المختبر صفر-مغ الاستيلاء القشرية نموذج2 + - تمثل الخطوط السوداء المحلية ميدان المحتملة (طابعات الحجم الكبير) تسجيل؛ الخطوط الزرقاء تمثل الحافز الخفيفة. (A) هذه الأفرقة هي استناداً إلى النتائج من طراز ماوس ChR2 فجأت. أنا) يوضح هذا الفريق الأوضاع الشبيهة epilepticus مركز الملاحظة في تسجيل طابعات الحجم الكبير من طبقة سطحية (2/3) شريحة الدماغ القشرية تعامل مع صفر-Mg2 + قام. ثانيا) هذا رأي التكبير في حدث إيكتال تشغيل الضوء. ثالثا) هذا رأي التكبير في نشاط مركز epilepticus مثل انفجار. (ب) إظهار هذه الألواح الشريحة نفس تسجيل بالإضافة إلى باكلوفين. أنا) تطبيق 5 ميكرومتر باكلوفين ملغ صفر2 + قام يحول النشاط انفجار مرة أخرى إلى أحداث ictal المتكررة، متميزة. ثانيا) هذا رأي التكبير في نشاط انفجار. ثالثا) هذا رأي التكبير في الحدث ictal متميزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الحادة في المختبر انفجار النتوءات نماذج. خطوط سوداء تمثل المحلية ميدان المحتملة (طابعات الحجم الكبير) تسجيل؛ الخطوط الزرقاء تمثل الحافز الخفيفة. (أ) هذه اللوحات تظهر النتائج من شريحة القشرية من فجأت-ChR2mouse، توضح النشاط انفجار لوحظت في سطحية طبقة (2/3) بعد إضافة 10 ميكرون مؤشر كتلة الجسم إلى 100 ميكرومتر 4AP. أنا) هذا لمحة عامة عن تسجيل طابعات الحجم الكبير. يشير الخط الأحمر المنقط عند سريانه مؤشر كتلة الجسم. ثانيا) هذا رأي التكبير في حدث إيكتال تشغيل الضوء. ثالثا) هذا رأي التكبير في نشاط انفجار العفوي. (ب) هذه اللوحات إظهار النتائج من شريحة هيبوكامبال من ماوس ChR2 فجأت، توضح حدثاً epilepticus مثل مركز الملاحظة في منطقة CA3 بعد تطبيق 100 ميكرومتر 4AP. i) هذا لمحة عامة عن تسجيل طابعات الحجم الكبير. ثانيا) هذا رأي التكبير في حدث إيكتال. ثالثا) هذا رأي التكبير في آثار خفيفة وعفوية انفجار الأحداث. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: الحادة في فيفو النموذجي 4-AP القشرية الاستيلاء. خطوط سوداء تمثل المحلية ميدان المحتملة (طابعات الحجم الكبير) تسجيل؛ الخطوط الزرقاء تمثل الحافز الخفيفة. (A) هذه اللوحات إظهار نتائج الكبار (p56) فجأت-ChR2 الماوس النموذجي مع 1.5 مم 4-أ فب تطبيق موضعياً للقشرة المكشوفة. أنا) يوضح هذا الفريق حدثاً ictal تشغيل الضوء ولاحظ في طبقة سطحية (2/3) من منطقة سوماتوسينسوري والحركية. ثانيا) هذا رأي التكبير في الحدث ictal آثار خفيفة من فريق منظمة العفو الدولية. ثالثا) هذا رأي سوبر التكبير في بداية الحدث ictal تشغيل الضوء (يشار إليه بالسهم الأسود). هذا الرقم هو الإصدار غير المصفى من هذا الرقم من تشانغ et al. 16- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: الحادة في المختبر النموذجي الاستيلاء القشرية البشرية. تمثل الخطوط السوداء المحلية ميدان المحتملة (طابعات الحجم الكبير) تسجيل؛ وتمثل الخطوط البنى نفخة بيكوسبريتزير. (أ) هذه اللوحات تبين نتائج شريحة الدماغ القشرية من فص الصدغي الآنسي مريض صرع (متلي)، التي توضح الأحداث ictal التي لوحظت في سطحية طبقة (2/3) بعد من نضح مع 100 ميكرومتر 4-AP وصفر-Mg2 + قام الإنسان . أنا) هذا لمحة عامة عن تسجيل طابعات الحجم الكبير. إظهار اللوحات التالية الثاني) التكبير في عرض 100 ملم غابا تسبب نفخة ictal الحدث و الثالث) طريقة عرض التكبير في حدث ictal عفوية. (ب) هذه اللوحات إظهار نتائج شريحة الدماغ القشرية من آخر متلي المريض، وتوضح الأحداث ictal التي لوحظت في سطحية طبقة (2/3) بعد من نضح مع 100 ميكرومتر 4-AP وصفر-Mg2 + قام البشرية. أنا) هذا لمحة عامة عن تسجيل طابعات الحجم الكبير. إظهار اللوحات التالية الثاني) طريقة عرض التكبير في 200 ميكرومتر غلوتامات تسبب نفخة ictal الحدث و الثالث) طريقة عرض التكبير في حدث ictal عفوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: وصفه لحل التشريح. هذه هي التعليمات لجعل المجلدات ل 1 أو 2 لتر. ميغاواط = الوزن الجزيئي للمذاب.
| # | كاشف | الأسفلت [مم] | ميغاواط (g/mol) | 1 لتر (ز) | L 2 (ز) |
| 1 | السكروز | 248 | 342.3 | 84.89 | 169.78 |
| 2 | بيكربونات الصوديوم (ناكو2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | سكر العنب (د-الجلوكوز) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | كلوريد البوتاسيوم (بوكل) | 2 | 74.55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | سلفات المغنزيوم (4·7H مجسو2س) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | فوسفات الصوديوم مونوباسيك مونوهيدرات (ح2نابو4· ح2س) | 1.25 | 137.99 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | كلوريد الكالسيوم (2·2H كاكل2س) | 1 | 147.01 | 0.15 | 0.29 |
الجدول 2: وصفه للقوارض الاصطناعي السائل الدماغي النخاعي (قام)- هذه هي التعليمات لجعل حجم 2 لتر أو 4 لتر. ميغاواط = الوزن الجزيئي للمذاب.
| # | كاشف | الأسفلت [مم] | ميغاواط (g/mol) | L 2 (ز) | 4 ل (ز) |
| 1 | كلوريد الصوديوم (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | بيكربونات الصوديوم (ناكو2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | سكر العنب (د-الجلوكوز) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | كلوريد البوتاسيوم (بوكل) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | سلفات المغنزيوم (مجسو4· ح2س) | 1.3 | 246.47 | 0.64 | 1.28 |
| 6 | فوسفات الصوديوم مونوباسيك مونوهيدرات (هنابو4· ح2س) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | كلوريد الكالسيوم (2·2H كاكل2س) | 1.5 | 147.01 | 0.44 | 0.88 |
الجدول 3: وصفه للبشرية الشوكي الدماغي الاصطناعي السائل (قام البشرية)- هذه هي التعليمات لجعل حجم 2 لتر أو 4 لتر. ميغاواط = الوزن الجزيئي للمذاب.
| # | كاشف | الأسفلت [مم] | ميغاواط (g/mol) | L 2 (ز) | 4 ل (ز) |
| 1 | كلوريد الصوديوم (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.38 | 28.75 |
| 2 | بيكربونات الصوديوم (ناهكو2) | 25.2 | 84.01 | 4.23 | 8.46 |
| 3 | سكر العنب (د-الجلوكوز) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | كلوريد البوتاسيوم (بوكل) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | سلفات المغنزيوم (مجسو4· ح2س) | 1 | 246.47 | 0.49 | 0.99 |
| 6 | فوسفات الصوديوم مونوباسيك مونوهيدرات (هنابو4· ح2س) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | كلوريد الكالسيوم (2·2H كاكل2س) | 1 | 147.01 | 0.29 | 0.59 |
الجدول 4: وصفه للصفر-مغ 2 + القوارض السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (صفر-ملغ2 + قام). هذه هي التعليمات لجعل حجم 2 لتر أو 4 لتر. ميغاواط = الوزن الجزيئي للمذاب.
| # | كاشف | الأسفلت [مم] | ميغاواط (g/mol) | L 2 (ز) | 4 ل (ز) |
| 1 | كلوريد الصوديوم (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | بيكربونات الصوديوم (ناكو2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | سكر العنب (د-الجلوكوز) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | كلوريد البوتاسيوم (بوكل) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | سلفات المغنزيوم (مجسو4· ح2س) | اسمياً مجاناً | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | فوسفات الصوديوم مونوباسيك مونوهيدرات (هنابو4· ح2س) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | كلوريد الكالسيوم (2·2H كاكل2س) | 1.5 | 147.01 | 0.29 | 0.59 |
الجدول 5: وصفه للصفر-مغ 2 + البشرية السائل الدماغي النخاعي اصطناعية (صفر-مغ2 + قام البشر)- هذه هي التعليمات لجعل ل 2 أو ل 4 وحدات التخزين؛ ميغاواط = الوزن الجزيئي للمذاب.
| # | كاشف | الأسفلت [مم] | ميغاواط (g/mol) | L 2 (ز) | 4 ل (ز) |
| 1 | كلوريد الصوديوم (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.38 | 28.75 |
| 2 | بيكربونات الصوديوم (ناكو2) | 25.2 | 84.01 | 4.23 | 8.46 |
| 3 | سكر العنب (د-الجلوكوز) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | كلوريد البوتاسيوم (بوكل) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | سلفات المغنزيوم (مجسو4· ح2س) | اسمياً مجاناً | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | فوسفات الصوديوم مونوباسيك مونوهيدرات (هنابو4· ح2س) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | كلوريد الكالسيوم (2·2H كاكل2س) | 1 | 147.01 | 0.29 | 0.59 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
شرائح المخ يعالجون بدواء بروكونفولسانت أو تغيير بيرفوساتي قام زيادة استثارة الشبكة العصبية والنهوض هطول الأمطار لإحداث إيكتال (أحداث شبيهة بالاستيلاء على اليكتروجرافيك). للفئران، ينبغي أن تحتوي على شرائح الاكليلية المفضل من منطقة somatosensory موتور القشرة cingulate، المنطقة 2 (CG)، ولكن ليس في منطقة ريتروسبلينيال (RS)؛ هذه العلامات التشريحية تساعد في تحديد نطاق شرائح الاكليلية التي أفضل لحفز الأحداث إيكتال. تعديل اختياري لانسجة الفئران قطع نصفي شريحة الدماغ في النصف بالنسبة لتصاميم تجريبية زوج متطابق، كما نصفي تكاد تكون متطابقة (وحدات تجريبية مماثلة). عند إعداد شرائح المخ لتوليد أحداث ictal، يتحتم الحفاظ على سلامة الشبكة العصبية وصلاتها متشابك، نظراً للأحداث ictal ظاهرة شبكات العصبية. النقاط الثلاث في الخطوة 1 من البروتوكول التي تعتبر حاسمة بالنسبة لنوعية الشريحة هي 1) تشريح الإجراء 2) حضانة والأوكسجين 3). أولاً، يتطلب إجراء تشريح على إيجاد توازن بين السرعة وتقنية. من الأهمية بمكان لتقليل الوقت بين قطع الرأس (أو الاستئصال الجراحي) والحضانة، مع الحرص أيضا مع كل جهة الاتصال والتنقل من شريحة الدماغ لتجنب الضرر. وثانيا، نوعية الأنسجة حساس جداً لدرجة حرارة الحضانة ومدتها. من المهم استخدام جهاز ضبط وقت والحرارة لضمان في الحضانة عند 35 درجة مئوية للحد الأدنى 30 ثالثا، بقاء أنسجة المخ حساس للتعرض لأي شيء آخر غير اﻷوكسيجين السائل الدماغي النخاعي (الاصطناعية). وسوف تنتهي شريحة الدماغ إذا هو لا perfused مع كاربوجيناتيد قام لفترة طويلة (~ 1 دقيقة).
شرائح الدماغ من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين p13-p16 توفر احتمال أعلى لتوليد أحداث إيكتال بنجاح. والسبب أن p16 ≤ الفئران لا تتطلب من نضح ترانسكارديال قبل تشريح. فعالية هذا يقلل من الفرصة للأخطاء، ويسرع عملية التشريح، وفائدة كبيرة، لأن مقدار الوقت بين قطع الرأس والاحتضان ارتباطاً عكسيا مع بقاء الدماغ للشريحة. وفي الوقت نفسه، من الفئران > p13 خفضت كميات من NKCC1 التي مماثلة ل الكبار36. بشكل عام، قضاء الأحداث (< p21) الأنسجة أكثر قابلية للاستمرار من أنسجة البالغين بسبب قدرة استثنائية على التعافي من إجراء تشريح المدمرة. ويقدم هذا الإطار استمرت أسبوعا بين p13 و p21 فرصة استغلال للفئران فسيولوجيا مثل الكبار والأحداث مثل القدرة على توليد بسهولة أحداث ictal37،38. ومع ذلك، إذا كانت التجارب تتطلب دراسة الأحداث إيكتال في المخ شرائح من الفئران الكبار، قام على أساس نمدج مع هيبيس وال اسكوربات سوف يساعد في تعزيز صلاحية الأنسجة الكبار24،،من3940، 41-يمكن أن تستفيد إضافة مضادات الأكسدة، مثل α--توكوفيرول، إلى الحل تشريح للأنسجة البشرية، صلاحية الأنسجة، خاصة أثناء النقل مسافات طويلة (> 30 دقيقة) بين غرفة العمليات والمختبر ل تشريح8،26. لجميع شرائح المخ، الظروف المواتية إنشاء الأحداث إيكتال لتسجيل من 450 ميكرون شرائح سميكة عند 36 درجة مئوية. شرائح المخ بحاجة إلى أن تكون على الأقل 350 ميكرون سميكة تحتوي على ما يكفي من الخلايا العصبية في الشبكة العصبية لتوليد الحدث ictal منظم. ومع ذلك، لا يمكن أن تكون شرائح أكثر سمكا من 500 ميكرون، كما أنه سوف تجعل من الصعب على الأوكسجين إلى منتشر داخل مركز الأنسجة. وتمثل الشرائح التي هي 450 ميكرون سمك أمثل، حيث يتم الإبقاء على كمية وافرة من الاتصال بالشبكة العصبية دون إعاقة التروية للأكسجين في الأنسجة. وأخيراً، هطول الأمطار الأحداث ictal الأمثل في 33-36 درجة مئوية؛ إذا لم يكن دائرة تسجيل مالا يقل عن 33 درجة مئوية، سيكون من الصعب بالنسبة إلى إجراء أحداث ictal.
حد نموذج الحجز الحاد أنها لا تولد المضبوطات. إلا أنها تولد الأحداث ictal، التي يتم التوقيع الاستيلاء على اليكتروجرافيك. الأحداث ictal، لا المكونات السلوكية المرتبطة بها، مثل فقدان الوعي أو التشنجات الحركية التي تحدد ضبط. ونتيجة لذلك، لا يمكن استخدام نماذج الاستيلاء على حدة للتأكد من فعالية العقاقير المضادة الاستيلاء على المرشحين المحتملين أو اكتساب نظرة ثاقبة ابيليبتوجينيسيس؛ مثل هذه الأسئلة البحثية ينبغي أن تعالجها نماذج الصرع المزمن والتجارب السريرية. وينبغي استخدام النماذج الاستيلاء على حدة فقط للغرض المقصود منها لإجراء الدراسات الأولية الأساسية في آليات الضبط. ينبغي المتقدم فقط النتائج الواعدة أكثر من غيرها من نماذج الاستيلاء الحاد إلى أعلى النماذج التي أكثر تكلفة، وشاقة لإعداد، وتتطلب الاعتبارات الأخلاقية أكثر تعقيداً بكثير.
لإحراز تقدم في مجال البحوث الصرع والاستيلاء، يتحتم أن يكون نموذجا للاستيلاء حادة موثوقة يمكن دقة تكرار النشاط الاستيلاء اليكتروجرافيك لوحظ سريرياً في التخطيط الدماغي للاستيلاء على المرضى. موثوق بها استخراج الأحداث إيكتال في شرائح المخ، طرق غير إزالة التثبيط زيادة استثارة المطلوبة، بينما أساليب إزالة التثبيط (أيخصم مستقبلات GABAA مؤشر كتلة الجسم) عادة ما تسفر عن النتوءات النشاط تذكر من النشاط إينتيريكتال، بدلاً من الأحداث إيكتال (الشكل 3A). الأسلوب المفضل لعدم إزالة التثبيط لتطبيق عامل بروكونفولسانت 4-وكالة اسوشييتد برس لأنه موثوق بها ويمكن أن تولد الأحداث ictal متسقة ح 1. على النقيض من ذلك، ينشئ مغ صفر2 + القشرية الطراز ictal أحداث فقط ~ 10 دقيقة قبل تحويل سريعاً إلى نشاط مثل الاندفاع (الشكل 2A). إذا كان استخدام صفر-Mg2 + النموذج، إضافة 5-10 ميكرون باكلوفين، سيساعد مؤثر مستقبلات GABAب ، تحويل النشاط انفجار يعود إلى أحداث إيكتال (الشكل 2)، كما هو موضح سابقا في شرائح هيبوكامبال42. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج 4-AP الاستيلاء في المختبر المفضل، نظراً للنتائج التي توصل إليها من أن نموذج يمكن تكراره في فيفو نظيرتها، في فيفو الاستيلاء القشرية 4-AP النموذج (الشكل 4). ليس ممكناً لتعديل كامل السائل الدماغي النخاعي بالماوس الكبار يعيش إعادة الحادة في فيفو مغ صفر2 + البيئة.
تطبيق 4-AP في شرائح الدماغ القشرية دقة إعادة الاستيلاء على النشاط لوحظ سريرياً15،33. وفي المقابل، 4-أ فب-تعامل شرائح هيبوكامبال مهيئون لتوليد إينتيريكتال التشويك النشاط43 ومركز epilepticus تشبه ظروف تشبه (الشكل 3B). وهكذا، لأغراض دراسة المضبوطات، الحادة في المختبر 4-AP القشرية النموذج المفضل أكثر في المختبر 4-AP هيبوكامبال النموذج. وعلاوة على ذلك، هناك تقريبا لا فرص لتسجيل من شرائح هيبوكامبال قابلة للحياة البشرية، كما ريسيكشنز الأكثر هيبوكامبال CA1 وتضررت CA321. وفي المقابل، الأنسجة القشرية البشرية غير المرضية أكثر سهولة حيث أن ذلك هو نتيجة ثانوية subcortical إجراءات جراحة الأعصاب مثل جراحة الصرع الفص الصدغي. يمكن أيضا الحصول على أنسجة نيوكورتيكال عدم-الصرع 'السيطرة' من العمليات الجراحية استئصال الورم. لهذه الأسباب، فهو القشرة الموقع المفضل لنمذجة النشاط الاستيلاء بسبب ما برودوكايشن بين الماوس والأنسجة البشرية لتأكيد أهميتها السريرية. وأخيراً، C57BL/6 سلالة من الفئران المفضل نظراً لسهولة يعربون عن المتسلسلات، والمتغيرات أوبتوجينيتيك متوفرة تجارياً. أوبتوجينيتيك الفئران نماذج تسمح لبدء بناء على الطلب لإحداث إيكتال عن طريق حفز خفيفة قصيرة وكسبها. وهذا يجعل هذه دراسة مضبوطات فعالة بشكل لا يصدق من خلال القضاء على أوقات الانتظار والسماح لتنشيط الخلايا العصبية الفئات السكانية الفرعية المستهدفة. وعلاوة على ذلك، يتيح القدرة على تحريك المضبوطات على الطلب عن طرق جديدة لترسيم النقطة بالضبط من بدء الاستيلاء نهائياً، ويحتمل أن تكون دراسة فعالية العقاقير المضادة الاستيلاء على المرشحين. كان برنامج سهلة الاستخدام المستندة إلى MATLAB وضعت خصيصا لاكتشاف وتصنيف مختلف أنواع الأحداث صرعية التي تحدث في النماذج في المختبر والمجراه في ضبط 4-AP. هذا البرنامج الكشف غير متوفرة للتنزيل من مستودع GitHub في مختبر فلينت (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (119603 باتاكا بيتر لام كارلين وتوفيق فلينت ألف)، ومعهد الدماغ أونتاريو (لتوفيق فلينت ألف)، ومنح البحوث الطلابية ميتش (لمايكل تشانغ). نود أن نشكر ليام طويلة لمساعدته في تصوير المخطوطة الفيديو. ونود أن نعترف باهاريخوب باريا، سيلفاباسكاران أبيشان، وشاديني الملاصقتين لمساعدتها في تجميع الأرقام والجداول في هذه المخطوطة. هي الأرقام 1A 3A, 4Aو 6A جميع الأرقام الأصلية من البيانات المنشورة في تشانغ et al. 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
References
- Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
- Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
- Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
- Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
- Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
- Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
- Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
- Engel, J. Seizures and epilepsy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
- Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
- Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
- Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
- Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
- Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
- Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
- Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
- Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
- Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
- Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
- Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
- Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
- Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
- Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
- Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
- Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).
