نقدم هنا، بروتوكول خطوة بخطوة للتصوير محاور عصبية myelinated في شريحة الدماغ ثابت باستخدام النانو خالية من التسمية التصوير تقنية تستند إلى ريفليكتوميتري الطيفية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مجهر ريفليكتوميتريك الطيفية على محاور عصبية ميليناتيد في الموقع
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الجهاز العصبي الثدييات، يوفر المايلين عزل كهربائي التي انورابينج الألياف إكسون في دوامة متعدد الطبقات. مستوحاة من هندسته المعمارية سوبسيلولار نظم عالية، وضعنا مؤخرا طريقة جديدة لتصوير، المسمى ريفليكتوميتري الطيفية (صبري)، الذي يتيح التصوير النانوي خالية من التسمية لم يسبق لها مثيل من محاور عصبية myelinated يعيش في الموقع. والمبدأ الأساسي الحصول على معلومات نانوستروكتورال عن طريق تحليل الطيف الانعكاس لهيكل سوبسيلولار متعدد الطبقات. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول مفصلة خطوة بخطوة للقيام تصوير صبري أساسية من أنسجة عصبية باستخدام نظام مجهرية [كنفوكل] تجارية، مزودة بليزر الضوء الأبيض وعامل تصفية الانضباطي. نحن تغطي إجراءات إعداد عينة، اقتناء البيانات الطيفية، ومعالجة للحصول على معلومات نانوستروكتورال الصور.
المقدمة
في الجهاز العصبي الثدييات، يوفر المايلين التوصيل السريع العصب وسلامة محواري قبل انورابينج الألياف إكسون مع مانعات الغشائي متعدد الطبقات. يتكون هيكلها المتعدد الطبقات من النانو رقيقة-أفلام تتألف من أغشية البلازما بالتناوب (~ 5 نانومتر)، سيتوسول (~ 3 نانومتر)، والأماكن خارج الخلية (~ 7 نانومتر)1،2. مجهرية البصرية، بما في ذلك مجهرية فائقة القرار الأخير، ليست مناسبة لمراقبة ديناميات النانو المايلين بسبب القرار غير كاف بسبب الحيود الضوئية3،،من45. على الرغم من أن المجهر الإلكتروني يمكن أن توفر التفاصيل الدقيقة ل nanostructu....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بموافقة جميع العمليات الجراحية "العناية بالحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة سونغكيونكوان.
1. إعداد نموذج
ملاحظة: اﻷوتوكﻻف جميع الأدوات الجراحية قبل التعامل مع الحيوانات. القيام بأداء جميع العمليات الجراحية في غرفة مخصصة للعمليات الجراحية. يجب أن تلبس العباءات الجراحية المعقمة وقفازات من جميع الموظفين في غرفة العمليات الجراحية في جميع الأوقات.
-
تثبيت الأنسجة
- إعداد اثنين من الحقن 10 مل كل مليئة بالفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وبارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني.
- تخدير العمر 7-12 أسبوع ماوس (C57BL/6J أو أي خطوط الماوس مع أي من الجنسين) بإدارة خلي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وفقا للبروتوكول، وقد أعدت شريحة الدماغ ثابت مع تلطيخ خارجية، استهداف المايلين فلوروفوري (انظر الجدول للمواد). تصوير صبري أجرى على شريحة الدماغ باستخدام مجهر الطيفي تجارية [كنفوكل] بالتزامن مع الأسفار [كنفوكل] التصوير (الشكل 4 أ). لصبري، تم تعيين الكثافة البصرية الإدخال إلى 5 ميكرومتر µW/2 مع وقت يسكن بكسل المايكروثانيه ~ 1. هذه الجرعة الخفيفة على أمر من حجم أقل من الأسفار التقليدية مجهرية [كنفوكل]12. يستغرق .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
صبري هو خال من تسمية تصوير أسلوباً جديداً يستند إلى قياس التداخل الطيفي، الذي يقدم معلومات نانوية في محاور عصبية myelinated لايف للمرة الأولى،. في اقتناء البروتوكول الحالي، القرار المكانية لقطر إكسون وسام 10 نانومتر. وعلاوة على ذلك، يستخدم سبيري أوامر من حجم أقل جرعة خفيفة مقارنة بغيرها ميكروسكوبيس القرار فائقة؛ ومن ثم، فحر من الضيائية وفوتوبليتشينج. صبري ستوفر سبيلاً جديداً لدراسة ديناميات النانو من محاور عصبية ميليناتيد.
البروتوكول الموضحة هنا يستند المسح الطيفي بوساطة أكوستو والبصريات وكاشف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن تضارب المصالح المالية: J. كوون وتشوي م. مخترعين تكنولوجيا براءات الاختراع في انتظار الموضحة في هذه المقالة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل بمعهد العلوم الأساسية (IBS-R015-D1) ومن "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تمولها وزارة التعليم (2017R1A6A1A03015642).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| قاطع الزجاج | - | يمكن شراؤه من متجر محلي أو متاجر عبر الإنترنت. | |
| طلاء الأظافر | - | يمكن شراؤه من متجر محلي أو متاجر عبر الإنترنت. | |
| هدف Apochromat 40 مرة ؛ NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | نوع الغمر في |
| الماء Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Fluoromyelin Red (F34652). |
| Leica SP8 TCS مجهر | Leica Microsystems | SP8 | راجع "تكوين المجهر" في قسم المقدمة للحصول على التفاصيل. |
| برنامج التصوير | Leica Microsystems | LAS-X-Matlab | |
| MathWorks | - | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | مطلي بالفضة المحمية. |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | تقنيات الحياة | 14190-136-Paraformaldehyde | |
| Biosolution | BP031a | 4٪ v / v في | |
| PBS غطاء زلة | Thermo Fisher | 3306 | السماكة: # 1 (0.13 إلى 0.17 مم) |
| زجاج منزلق | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | السماكة: ~ 1 مم |
| Super Glue | Henkel | Loctite 406 | استخدم معدات توزيع لتجنب ملامسة الجلد أو العين. |
| مضخة الحقنة | Brainetree Scientific | BS-8000 | DUAL-Vibratome |
| Leica Biosystems | |||
| VT1200S-White-light laser | NKT الضوئيات | EXB-6 | EXB-6 تم استبدالها ب EXU-6. |
المراجع
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS mye....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
