Qui, presentiamo un protocollo passo-passo per l'imaging di assoni myelinated in una fetta di cervello fisso utilizzando una scala nanometrica privo di etichetta tecnica basato su riflettometria spettrale di imaging.
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Articolo metodologico
Microscopia spettrale riflettometrica su assoni Myelinated In Situ
In questo articolo
Sommario
Abstract
In un sistema nervoso dei mammiferi, mielina fornisce un isolamento elettrico da avviluppando le fibre dell'assone in una spirale multistrata. Ispirato dalla sua architettura subcellulare altamente organizzato, abbiamo recentemente sviluppato una nuova modalità di imaging, denominata riflettometria spettrale (isotropi), che permette l'imaging senza precedenti su scala nanometrica privo di etichetta degli assoni myelinated live in situ. Il principio di fondo è quello di ottenere informazioni nanostrutturale analizzando lo spettro di riflettanza della struttura subcellulare multistrato. In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'esecuzione di un imaging di SpeRe base dei tessuti nervosi utilizzando un sistema al microscopio confocale commerciale, dotato di un laser a luce bianca e un filtro sintonizzabile. Copriamo le procedure di preparazione del campione, acquisizione di dati spettrali e di elaborazione delle immagini per ottenere informazioni nanostrutturale.
Introduzione
Nel sistema nervoso dei mammiferi, mielina fornisce integrità assonale e conduzione nervosa rapida avviluppando le fibre dell'assone con guaine membranose multistrate. La sua struttura multistrato è composto da alternando film sottili su scala nanometrica composto da membrane plasmatiche (~ 5 nm), cytosol (~ 3 nm) e spazi extracellulari (7 ~ nm)1,2. Microscopia ottica, compreso il recente microscopia di Super-risoluzione, non sono adatti per l'osservazione delle dinamiche di mielina su scala nanometrica a causa della loro risoluzione insufficiente a causa della diffrazione ottica3,....
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Protocollo
Tutte le procedure chirurgiche sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Sungkyunkwan University.
1. preparazione del campione
Nota: Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima di movimentazione degli animali. Condurre tutte le prestazioni chirurgiche in una sala dedicata alle procedure chirurgiche. Guanti e camici chirurgici sterili devono essere indossati per tutto il personale nella sala chirurgica in ogni momento.
-
Fissazione del tessuto
- Preparare due siringhe da 10 mL che ciascuno riempito con tampone fosfato salino (PBS) e paraforma....
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Risultati
Secondo il protocollo, una fetta di cervello fisso è stata preparata con un fluoroforo mielina-targeting la colorazione esogena (Vedi Tabella materiali). Bullonerie imaging è stata eseguita sulla fetta di cervello utilizzando un microscopio confocale commerciale iperspettrali in combinazione con fluorescenza confocale imaging (Figura 4a). Bullonerie, ingresso ottico intensità è stato impostato per 5 µW/µm2 con un tempo di sosta di .......
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Discussione
Bullonerie è una nuova modalità imaging privo di etichetta basata su interferometria spettrale, che per la prima volta, offre le informazioni su scala nanometrica in assoni myelinated dal vivo. L'attuale protocollo di acquisizione, la risoluzione spaziale per il diametro dell'assone è dell'ordine di 10 nm. Inoltre, SpeRe utilizza gli ordini di grandezza più bassa dose di luce rispetto ad altri microscopie di Super-risoluzione; così, è esente da fototossicità e photobleaching. Bullonerie fornirebbe una nuova strada per st.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano concorrenti interessi finanziari: Kwon J. e M. Choi sono gli inventori della tecnologia in attesa di brevetto descritto in questo articolo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto di scienze fondamentali (IBS-R015-D1) e dal programma di base scienza ricerca attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell'istruzione (2017R1A6A1A03015642).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tagliavetro | : | può essere acquistato in un minimarket locale o nei negozi online. | |
| Smalto per unghie | : | può essere acquistato in un minimarket locale o nei negozi online. | |
| Obiettivo apocromatico 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Tipo ad immersione in acqua |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | In alternativa, è possibile utilizzare Fluoromyelin Red (F34652). |
| Microscopio Leica SP8 TCS | Leica Microsystems | SP8 | Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla sezione "Configurazione del microscopio" nella sezione introduttiva. |
| Software di imaging | Leica Microsystems | LAS-X-Matlab | |
| MathWorks | - | - | |
| Specchio | Thorlabs | PF10-03-P01 | Rivestito con argento protetto. |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Life technologies | 14190-136-Paraformaldeide | |
| Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS | |
| Vetrino coprioggetto | Thermo Fisher | 3306 | Spessore: #1 (da 0,13 a 0,17 mm) |
| Vetrino scorrevole | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Spessore: ~1 mm |
| Super colla | Henkel | Loctite 406 | Utilizzare un'apparecchiatura di erogazione per evitare il contatto con la pelle o gli occhi. |
| Pompa a siringa | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL-Vibratome | |
| Leica Biosystems | VT1200S-Laser | ||
| a luce bianca | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 è stato interrotto e sostituito da EXU-6. |
Riferimenti
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS mye....
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Ristampe e permessi
