Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’extraction des acides nucléiques virus rapide de virus inactivés Germains. L’extraction est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité. La méthode ne dépend pas des installations de laboratoire et peut être utilisé n’importe où (par exemple, dans des hôpitaux de campagne).

Résumé

Le diagnostic rapide d’une infection est essentiel pour la gestion des épidémies, le confinement de risque et les soins aux patients. Nous avons déjà montré une méthode pour l’inactivation rapide chevet du virus Ebola lors des prélèvements sanguins pour les tests de sécurité d’acide nucléique (NA) en ajoutant un tampon de lyse/liaison commerciale directement dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide. Avec cette approche de chevet inactivation, nous avons développé une sûre, rapide et simplifiée chevet NA méthode d’extraction pour la détection ultérieure d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. L’extraction de la NA est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité.

Après que le sang est prélevé dans le tampon de lyse/liaison, les contenus sont mélangés en retournant le tube à la main, et le mélange est incubé pendant 20 min à température ambiante. Particules de verre magnétique (POP) sont ajoutés au tube, et le contenu est mélangé en retournant le tube de prélèvement à la main. Pop est ensuite recueillies sur le côté du tube de prélèvement à l’aide d’un support magnétique ou un aimant et un élastique. Les pop est lavées trois fois, et après l’addition de tampon d’élution, directement dans le tube de prélèvement, le NAs sont prêt pour les tests de NA, comme qPCR ou amplification isotherme boucle (lampe), sans l’élimination des pop de la réaction. La méthode d’extraction de NA ne dépend pas des installations de laboratoire et peut facilement être utilisé n’importe où (par exemple, dans les hôpitaux de campagne et les salles d’hôpital isolement). Lorsque cette méthode d’extraction de NA est combinée avec lampe et un instrument portatif, un diagnostic peut être obtenu au sein de 40 min de la collecte de sang.

Introduction

En cas d’épidémie de virus, lorsque les patients sont confinés à l’hôpital d’isolement ou lorsqu’un diagnostic rapide est nécessaire, un diagnostic moléculaire précis, simple et sûr de point-of-care est impératif pour le confinement des soins et risque patient. Les deux récentes éclosions virales, du virus Ebola (EBOV) en Afrique de l’Ouest (2013) et le virus Zika en Amérique du Sud (2015), ont augmenté l’intérêt pour l’amélioration point-of-care moléculaires tests diagnostiques, comme isotherme boucle-négociée de transcription inverse amplification (RT-lampe)^1,2 et recombinase polymérase amplification (RPA)

Protocole

Le Comité sur l’éthique de la recherche biomédicale, région de la capitale a donné un consentement éclairé, et toutes les méthodes décrites ici ont été exemptés de l’examen par le système des comités éthiques, conformément à la loi danoise sur les projets de développement de test.

1. préparation des Tubes sous vide de prélèvement sanguin pour l’Inactivation des Virus et Extraction rapide de NA

ATTENTION : La mémoire tampon utilisée pour ce protocole contient guanidinium thiocyanate (GITC) et un agent tensio-actif non ionique, qui sont irritants. Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriés, utiliser un....

Résultats

Le protocole présenté ici est simple et efficace et peut être largement appliqué à n’importe quel test moléculaire à être effectuées sur des échantillons de sang infectieux inactivés avec le tampon de lyse/liaison. Le flux de travail pour l’inactivation de sang et l’extraction de la NA est illustré à la Figure 1, y compris la préparation de sang collection tubes à vide⁷ (Figure 1 a), le sang collection

Discussion

Dans ce rapport, nous décrivons une sûre, rapide et simple chevet NA extraction méthode manuelle pour la détection moléculaire en aval d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. La méthode d’extraction NA décrite a été développée pour être effectuée directement sur des échantillons de sang prélevés dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide contenant la lyse/fixation tampon (Table des matières)⁷. Cet mémoire tampon spécifique inactive EBOV

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vacutainer K2 Tubes EDTA (4 mL)	Becton Dickinson	368861
Plus Blood Collection	Becton Dickinson	362725
23G x 1 aiguille	Becton Dickinson	300800
Luer LOK seringue (3 mL)	Becton Dickinson	309658
Aiguille papillon avec tube d’extension de petit calibre	Jø ; rgen Kruuse A/S	121714
1 % Virkon	Nomeco A/S	849265
MagNA Pure LC Kit d’isolement d’ADN I - Tampon de lyse/liaison - Recharge	Roche Diagnostics A/S	03246752001
MagNA Pure LC Kit d’isolement d’acide nucléique total	Roche Diagnostics A/S	3038505001
Nunc&trade ; Tubes cryogéniques pour biobanques et cultures cellulaires (1,8 mL)	Thermo Fisher Scientific	375418
Nunc&trade ; Tubes cryogéniques pour biobanques et cultures cellulaires (3,6 mL)	Thermo Fisher Scientific	379189
Nunc&trade ; Tubes cryogéniques pour biobanques et culture cellulaire (4,5 mL)	Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag&trade ;-5 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12303D
Pipette de transfert (3,5 mL)	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific&trade ; Samco&commerce ; Pipettes de transfert à pointe fine (1,5 mL)	Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific&trade ; Nunc&commerce ; Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 50 mL	Thermo Fisher Scientific	339652