Method Article

Malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável

DOI:

10.3791/58003

⸱

July 21st, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, Harvard University, 3Department of Physics, Korea University

In This Article

Summary

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Sondas de malha eletrônica perfeitamente integram e fornecem o nível estável, a longo prazo, single-neurônio gravação dentro do cérebro. Este protocolo usa malha eletrônica para na vivo experiências, envolvendo a fabricação de malha eletrônica, carregando em agulhas, injeção estereotáxica, interface de entrada/saída, experiências de gravação e histologia de tecido contendo malha sondas.

Abstract

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Sondas de eletrofisiologia do cérebro implantáveis são ferramentas valiosas em neurociência, devido à sua capacidade para gravar atividade neural com alta resolução spatiotemporal de regiões do cérebro superficial e profunda. Seu uso tem sido dificultado, no entanto, incompatibilidades mecânicas e estruturais entre as sondas e cérebro tecido que normalmente leva à micromovimentos e gliose com resultante do sinal instabilidade em experimentos de gravação crônica. Em contraste, após a implantação da eletrônica de malha super flexível através da injeção de seringa, a malha sondas forma uma interface perfeita, livre de gliose com o tecido circundante do cérebro que permite o controle estável de neurônios individuais em pelo menos um ano escala de tempo. Este detalhes de protocolo as etapas em um experimento de gravação neural típica do mouse usando a seringa injetável malha eletrônica, incluindo a fabricação de malha eletrônica em um padrão baseado em fotolitos processo possível em muitas universidades, carregando malha eletrônica em padrão agulhas capilares, injeção estereotáxica em vivo, conexão da malha entrada/saída para interfaces de instrumentação padrão, contido ou sessões de gravação, movimentando-se livremente e histológica de seccionamento do cérebro que contenham tecido malha eletrônica. Representante gravações neurais e histologia dados são apresentados. Os investigadores familiarizados com este protocolo terá o conhecimento necessário para incorporar a malha eletrônica em suas próprias experiências e aproveitar as oportunidades únicas oferecidas pela interface neural estável a longo prazo, tais como estudos de envelhecimento processos, desenvolvimento do cérebro e a patogênese da doença cerebral.

Introduction

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O desenvolvimento de ferramentas capazes de mapear o cérebro com resolução de single-neurônio é de importância central de neurociência e Neurologia. Tecnologias não-invasivas para estudos neurais como Eletroencefalografia (EEG), ressonância magnética funcional (fMRI) e magnetoencefalografia (MEG) provaram ser valiosas para correlacionar atividade cerebral com comportamento em seres humanos1, 2, mas eles não têm a resolução spatiotemporal necessária para estudar a estrutura e a dinâmica de redes neurais no seu micrômetro fundamental e milissegundo escalas, respectivamente3,4. Sondas de certa eletrocorticografia (ECoG) e métodos de imagem ópticos usando corantes sensíveis à voltagem conseguiram gravar unitárias cravação atividade na vivo5,6, mas são geralmente eficazes apenas perto do superfície do cérebro, limitando a aplicabilidade a estudos de regiões cerebrais superficial. Em contraste, implantáveis elétricas sondas podem medir single-neurônio eletrofisiologia em movimentando-se livremente animais de praticamente qualquer região do cérebro sem a necessidade de rotulagem fluorescente, tornando-os indispensáveis para a neurociência de sistemas-nível, especialmente como microfabrication técnicas da indústria de semicondutores têm empurrado a quantidade de canais para as centenas e milhares de3,7,8,9. Em virtude desses recursos, implantáveis elétricas sondas já fez muitas contribuições importantes de neurociência e Neurologia, incluindo estudos fundamentais de processamento no sistema visual10, o tratamento de neurológica de informações doenças como a doença de Parkinson,11e a demonstração de interfaces cérebro-máquina (especificas) para próteses avançadas12,13.

Não obstante, instabilidade a longo prazo, que se manifesta como diminuir o pico amplitudes e sinais instáveis em escalas de tempo de semanas a meses14,15 limitou-se a aplicabilidade das sondas implantáveis para o estudo de relativamente curto prazo fenômenos, deixando perguntas tais como desenvolvimento e envelhecimento cerebral em grande parte sem resposta. As limitações na instabilidade a longo prazo são um resultado de uma incompatibilidade entre sondas convencionais e tecido cerebral em tamanho, mecânica e topologia14,15,16,17,18. Em termos de tamanho, enquanto as sinapses neuronais e somata é aproximadamente dezenas de nanômetros a dezenas de micrômetros de diâmetro19, respectivamente, sondas tradicionais muitas vezes são significativamente maiores, no caso de matrizes de microeletrodos de silício > 4 vezes o tamanho de um único neurônio corpo celular7,8. O tamanho relativamente grande de tais sondas pode perturbar a estrutura natural e conectividade de denso tecido neural, assim contribuindo para a resposta imune crônica e perturbando os circuitos neurais sendo estudado. Em termos de propriedades mecânicas, sondas tradicionais são drasticamente mais rígidas do que o tecido neural extremamente macio, na qual eles são implantados; sondas até "flexíveis", feitas a partir de 10-20 µm espessos mantos de poliimida são pelo menos 100.000 vezes mais duras que os de20,de tecido de cérebro21. Esta incompatibilidade na rigidez de flexão faz com que o movimento relativo de cisalhamento entre a sonda e cérebro tecido, levando à unitárias não confiável de rastreamento durante gravações estendidas e induzindo gliose crônica no local do implante. Finalmente, a estrutura topológica de sondas convencionais cérebro necessariamente exclui um volume sólido do tecido. Tal incompatibilidade na topologia interrompe a conectividade dos circuitos neurais, opõe-se a natural distribuição tridimensional (3D) interpenetrated de neurônios, células gliais e os vasos sanguíneos no cérebro tecido22e dificulta o transporte 3D de sinalização moléculas23. Juntas, estas deficiências de sondas convencionais de têm-los feito aquém a compatibilidade a longo prazo, procurada para aplicações clínicas e estudos de neurociência longitudinal a nível de single-neurônio.

Para superar estas deficiências, procuramos borrar a linha entre os sistemas neurais e electrónicos através do desenvolvimento de um novo paradigma de "tecido-como" neurais sondas denominado malha eletrônica16,21,24. Malha eletrônica soluciona os problemas de correspondência acima em tamanho, mecânica e topologia incorporando características (1) estruturais da mesma nanômetros para escala de tamanho micrométrico do tecido neural, (2) mecânicas Propriedades semelhantes do tecido cerebral e (3) um 3D se topologia que é > 90% espaço aberto e, portanto, acomoda interpenetração por neurônios e a difusão de moléculas através do ambiente extracelular. Malha eletrônica sondas podem ser entregues precisamente para regiões específicas do cérebro, através de uma seringa e uma agulha, causando danos mínimos agudo enquanto implantação mesmo em profunda do cérebro regiões21,25. Axônios e soma neuronal têm sido mostrados para interpenetrar a estrutura de sonda de eletrônica de malha 3D aberto dentro pós-injeção de semanas, criando assim uma interface perfeita, livre de gliose entre gravação eletrônica e em torno de tecido de cérebro21 , 26 , 27. estas características únicas permitiram malha eletrônica sondas para estàvel acompanhar atividade cravação de neurônios individuais mesmos ao longo de pelo menos um ano calendário27. Além disso, a fabricação da malha eletrônica baseada em fotolitografia (PL) fornece alta escalabilidade do número de eletrodos que podem ser incorporados, com demonstrada canal conta até 128 eletrodos por sonda usando litografia de máscara de contacto simples 28 e um design de (e/s) de entrada/saída de plug-and-play que permite a rápida conexão elétrica para periféricos eletrônicos sem equipamento especializado29.

Uma ampla gama de estudos pode beneficiar de incorporar protocolos de medição eletrônica de malha. A maioria dos experimentos de gravação intracortical poderiam se beneficiar do procedimento de implantação minimamente invasiva malha electronics através da injeção de seringa, drasticamente reduzida resposta imune pós-implante, e a capacidade de deixar malha eletrônica na tecido durante a subsequente histologia e imunocoloração para análise precisa do ambiente biológico ao redor de cada local de gravação. Experimentos de gravação crônica em particular irão derivar o valor da capacidade única de malha eletrônica para controlar um grande número de neurônios individuais por meses a anos. Esse recurso cria oportunidades para estudos com resolução de single-neurônio que eram anteriormente impraticáveis, tais como estudos de envelhecimento longitudinal de circuitos neurais, investigações do cérebro em desenvolvimento e informações sobre a patogênese da espongiformes transmissíveis16.

Este protocolo, descreveremos todos os passos a chave em um experimento de gravação neural típica do mouse usando a seringa injetável malha eletrônica (ver Figura 1). Etapas descritas incluem a fabricação de malha eletrônica em um possível processo padrão baseado no PL em muitas universidades, carregando malha eletrônica em padrão agulhas capilares, injeção estereotáxica de malha eletrônica na vivo, conexão da malha I/O para interfaces de instrumentação padrão, as sessões de gravação contida ou livremente móveis e corte histológico de tecido cerebral contendo malha eletrônica. Alguns pesquisadores usando malha eletrônica apenas para estudos de histologia não podem exigir conexão elétrica e a gravação, caso em que eles podem pular essas etapas. Depois de familiarizar-se com este protocolo, os investigadores devem ter todo o conhecimento necessário para usar malha eletrônica em suas próprias experiências.

Protocol

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Todos os procedimentos realizados em assuntos de animais vertebrados foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Harvard e institucional Cuidado Animal.

1. fabricação de malha eletrônica

Nota: O procedimento descrito nesta seção se destina para uso dentro de uma instalação de sala limpa Universidade padrão, tais como o centro para sistemas nanoescala (CNS), na Universidade de Harvard. Esta facilidade, bem como instalações similares são acessíveis para os usuários externos ao redor dos EUA, por exemplo, como parte do nacional nanotecnologia infra-estrutura de rede (NNIN) suportado pela National Science Foundation (NSF). Nestas facilidades, muitas das ferramentas, equipamentos e materiais descritos nesta seção são fornecidas juntamente com acesso para as instalações de sala limpa em não exigiria compra separada.

Atenção: Muitos dos produtos químicos utilizados na fabricação de malha eletrônica são perigosos, incluindo resiste, CD-26, removedor de PG, SU-8 desenvolvedor e Ni gravura solução. Consultar as fichas de dados de segurança de materiais (MSDS) para estes produtos químicos antes de utilizar e implementar e seguir as medidas de segurança adequadas em todos os momentos.

  1. Termicamente evaporar a 100 nm de Ni em um wafer de Si a limpo.
    Nota: Os parâmetros de deposição típica são base pressão de 5 x 10-7 T e taxa de 1 – 2 Å/s. A fina camada de Ni serve como uma camada de sacrifício que será posteriormente dissolvida a versão eletrônica da malha de wafer.
  2. Use a primeira máscara de PL (PL máscara-1) para definir o fundo passivating camada de malha eletrônica com SU-8 fotorresiste negativo (Figura 2A).
    Nota: O PL é uma técnica de microfabrication padrão em que a luz ultravioleta (UV) é brilhou em uma máscara realizada sobre um substrato fotossensível. Luz também torna insolúvel (resiste negativo) ou solúvel (positivo resiste) as áreas expostas sobre o substrato. As máscaras são desenhadas em software de desenho (CAD) assistido por computador e então ordenou que normalmente de um fornecedor. Um alinhador de máscara é usada para alinhar máscaras para padrões existentes em um substrato e expô-los à luz UV. Fabricação de malha eletrônica requer quatro máscaras diferentes (PL 1-máscara a máscara do PL-4). Nossos projetos de máscara estão disponíveis por solicitação ou do local do recurso, meshelectronics.org.
    1. Rotação-casaco SU-8 2000.5 fotorresiste negativo sobre a bolacha em 4.000 rpm para uma espessura aproximada de SU-8 de 400-500 nm.
    2. Macio, asse a hóstia em uma placa quente por 1 min a 65 ° C, seguido de 1 min a 95 ° C.
    3. Carrega a bolacha em um alinhador de máscara para expor o SU-8 com PL máscara-1 correspondente a camada inferior de malha SU-8. Expor a uma dose de i-linha (comprimento de onda 365 nm) de 100 mJ/cm2.
    4. Post asse a hóstia em uma placa quente por 1 min a 65 ° C, seguido de 1 min a 95 ° C.
    5. Mergulhe a bolacha em uma bandeja de desenvolvedor de SU-8. Suavemente agite a solução por 2 min até que o padrão de rede no SU-8 foi totalmente desenvolvido. Enxaguar em uma bandeja de álcool isopropílico para 1 min e secagem.
    6. Duro asse a hóstia em uma placa quente a 180 ° C por 1h.
      Nota: SU-8 é normalmente difícil cozido entre 150 ° C e 250 ° C, após o desenvolvimento. O difícil Asse anneals qualquer superfície rachaduras que possam formar durante o desenvolvimento e novas ligações cruzadas a SU-8 para garantir estabilidade mecânica. Cozimento duro a 180 ° C para a camada inferior de SU-8 e 190 ° C, para a parte superior SU-8 camada dá bons resultados para a malha eletrônica.
  3. Máscara de uso PL-2 para definir metal interconexões e almofadas de I/O (Figura 2B).
    1. LOR3A de rotação-casaco para a hóstia a 4000 rpm para uma espessura aproximada de 300 nm.
      Nota: LOR3A é um polydimethylglutarimide com base em resistir a quais velocidades subcotação durante o processo de metalização subsequentes.
    2. Asse a hóstia em uma placa quente a 180 ° C por 5 min.
    3. Rotação-casaco S1805 fotorresiste positivo a 4000 rpm para uma espessura aproximada de 500 nm.
    4. Asse a bolacha sobre uma chapa de fogão a 115 ° C por 1 min.
    5. Carrega a bolacha em um alinhador de máscara para expor o S1805 com máscara de PL-2 correspondente ao metal interconexões e almofadas de I/O. Expor na dose de 40 mJ/cm2h-linha (comprimento de onda 405 nm).
    6. Mergulhe a bolacha em uma bandeja do CD-26 fotorresiste desenvolvedor. Suavemente agite a solução por 1 min, até que o metal interconexões padrão tem sido totalmente desenvolvido. Enxaguar em uma bandeja de água deionizada (DI) por 1 min e secagem.
    7. Termicamente evaporar 3 nm de Cr seguido por 80 nm de Au.
      Nota: Uma pressão base no máximo 5 x 10-7 T e taxa de deposição de 1 Å/s normalmente rendem a melhor qualidade do filme.
    8. Mergulhe a bolacha para um copo liso de removedor PG para aproximadamente 3 h até que o metal tem totalmente inferiores, deixando o metal apenas nas regiões de almofada I/O de malha eletrônica e interconexão desejado. Lavar em álcool isopropílico e secagem.
  4. Use máscara de PL-3 para definir Pt eletrodos (Figura 2).
    1. Repita as etapas 1.3.1 através de 1.3.4.
    2. Carrega a bolacha para o alinhador de máscara para expor o S1805 com PL máscara-3 correspondente para os eléctrodos de Pt. Expor na dose h-linha de 40 mJ/cm2.
    3. Mergulhe a bolacha em uma bandeja do CD-26 fotorresiste desenvolvedor. Suavemente agite a solução durante 1 min até que o padrão de eletrodos de Pt foi totalmente desenvolvido. Enxaguar em uma bandeja de DI para 1 min e secagem.
    4. Use um evaporador de feixe de elétrons para depósito 3 nm de Cr seguido por 50 nm do Pt.
      Nota: Parâmetros típicos de deposição são uma pressão base de 5 x 10-7 T e taxa de 2 Å / s.
    5. Mergulhe a bolacha para um copo liso de removedor PG para aproximadamente 3 h até que o metal tem totalmente inferiores, deixando o Pt apenas em sites de eletrodo desejado da malha eletrônica. Lavar em álcool isopropílico e secagem.
  5. Use máscara de PL-4 para definir o top passivating camada de malha eletrônica com SU-8 fotorresiste negativo (Figura 2D).
    1. Repita as etapas 1.2.1 através de 1.2.5, exceto expondo com máscara de PL-4 correspondente para a camada superior de malha passivating do SU-8.
    2. Duro asse a bolacha sobre uma chapa de fogão a 190 ° C por 1h.
      Nota: Esta temperatura é 10 ° C maior do que para o difícil Asse de fundo SU-8 (etapa 1.2.6). Esta elevada temperatura ligeiramente reflui fundo SU-8, fazendo-o mesclar com a camada superior de SU-8 e assim formar uma estrutura de SU-8 única, contínua.
  6. Eletrônica de malha são agora completa (Figura 2E e Figura 3); libertá-los do wafer Si dissolvendo a camada sacrificial de Ni.
    1. Trate a bolacha com plasma de oxigênio em 50 W por 1 min. Este oxida a superfície do SU-8, tornando-se hidrofílico e permitindo que a malha ser prontamente suspenso em solução aquosa.
    2. Em um copo liso, combinar o ácido clorídrico, cloreto férrico e DI na proporção volumétrica de 1:1:20, respectivamente, para fazer uma solução de ácido de Ni.
    3. Mergulhe a bolacha matraz plana da solução etchant Ni para aproximadamente 3h até a malha eletrônica completamente foram lançada do wafer Si.
    4. Utilize uma pipeta Pasteur para transferir a malha lançada eletrônica sondas de Ni etchant para um copo de 100 mL de DI. Transfira a malha eletrônica para um copo fresco de DI pelo menos 3 vezes para assegurar a lavagem.
    5. Usar uma pipeta Pasteur para transferência eletrônica a malha para uma solução de água/etanol 70% / 30% para a desinfecção e, em seguida, usar a pipeta para transferir a malha eletrônica para água estéril para enxaguar.
      Nota: Após a esterilização, a electrónica de malha pode ser transferida para outras soluções para functionalization. Por exemplo, para promover a adesão celular, a electrónica de malha pode ser transferida para uma solução aquosa de poli-D-lisina (1 mg/mL) por 24 h.
    6. Utilização de uma pipeta Pasteur para transferência eletrônica o engranzamento sondas para um copo de 100 mL de fosfato estéril 1x tampão salino (PBS) antes da injeção em vivo.

2. carregamento da malha eletrônica em agulhas

  1. O titular de pipeta como-comprado está aberto a fluir em ambas as extremidades. Sele a extremidade oposta do fixador parafuso circular com epóxi, então não há nenhum escapamento durante a injeção (Figura 4A). Deixe o epóxi endureça antes de prosseguir.
  2. Introduza uma agulha de vidro capilar no suporte de pipeta. Prenda-a no lugar usando o parafuso de aperto circular e a arruela de cone (Figura 4B). Uma agulha 400 µm diâmetro interno (diâmetro exterior de 650 µm) vidro capilar foi usado para este protocolo. Outros materiais de agulha capilar (EG., metal) e diâmetros podem ser usados, mas podem exigir alterações para o projeto da malha eletrônica para assegurar Injectabilidade.
    Nota: Agulhas capilar que variam de 150 µm de diâmetro interno de 1,17 mm (250 µm de diâmetro externo de 1,5 mm) têm sido utilizadas em nosso laboratório. Injeção por meio de agulhas menores pode ser promovida tornando o ângulo de interseção entre os elementos SU-8 transversais e longitudinais de malha mais agudos, diminuindo a largura dos elementos SU-8 malha, usando SU-8 mais fino, e uma mais grosseira (i. e., maior célula unitária) estrutura de malha. Máscaras para malhas projetadas para menores capilares agulhas estão disponíveis por solicitação ou do local do recurso, meshelectronics.org. Agulhas capilares de vidro com diâmetro interno de 400 µm de diâmetro exterior de 550 µm também estão disponíveis comercialmente. Estes reduzem o dano de tecido aguda causado por injeção enquanto mantém a compatibilidade com malhas que exigem um diâmetro interno de 400 µm, mas eles não foram utilizados para os estudos descritos aqui.
  3. Conecte uma seringa de 1 mL à saída do lado do titular da pipeta usando um comprimento de 2-4 cm de tubo capilar.
  4. Insira a agulha de vidro capilar o copo de 100 mL de PBS contendo a malha eletrônica. Posicione a extremidade da agulha perto as almofadas de I/O de uma malha eletrônica probe e retrair manualmente a seringa para atrair uma sonda eletrônica de malha para a agulha (Figura 5 e 1 de vídeo suplementar).
    Nota: As almofadas de I/O, região de interconexão de haste e região de dispositivo de malha são facilmente identificáveis a olho nu quando as sondas de eletrônica de malha são suspensas em solução. Isto permite um carregamento inequívoco da malha eletrônica nas agulhas com a orientação correta.
  5. Empurrar/puxar o êmbolo da seringa enquanto ainda imersos em solução salina para ajustar a posição da malha eletrônica dentro da agulha.
    Nota: O posicionamento Ideal é com a região de dispositivo de malha super flexível como perto da extremidade da agulha quanto possível. Esta configuração minimiza o volume de fluido que será injetado no cérebro ao mesmo tempo garantindo que a região do dispositivo é injectada primeiro e as almofadas de I/O última.
  6. Retire cuidadosamente o tubo capilar de saída do lado do titular da pipeta. Desconectá-lo lentamente para evitar a criação de uma força de sucção que pode alterar a posição da malha eletrônica dentro da agulha.

3. estereotáxica injeção de malha eletrônica no cérebro de rato ao vivo

Nota: Os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal com uma mistura de 75 mg/kg de ketamina e 1 mg/kg dexdomitor. O grau de anestesia foi verificado com o método de pitada de dedo do pé antes de começar a cirurgia. Temperatura corporal manteve-se colocando o mouse sobre uma manta de homeotérmicos de 37 ° C sob anestesia. A técnica estéril apropriada foi implementada para a cirurgia, incluindo mas não limitado para esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos metálicos para 1 h antes da utilização, a utilização de luvas esterilizadas, usando um esterilizador de grânulo quente durante a cirurgia, a manutenção de um campo estéril em torno do sítio cirúrgico, a desinfecção de instrumentos de plástico com etanol a 70% e o couro cabeludo depilado pele foi preparada com Iodofor antes da incisão. Para cirurgias de sobrevivência, após a conclusão da cirurgia, antiobiotic pomada foi aplicada ao redor da ferida, e o rato foi retornado para uma gaiola equipada com 37 ° C almofada de aquecimento. Ratos não foram deixados sem supervisão até que eles tinham recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Ratos foram dadas buprenorfina analgesia através da injeção intraperitoneal, na dose de 0,05 mg/kg de peso corporal cada 12 h por até 72 h após a cirurgia. Os ratos foram isolados dos outros animais após a cirurgia. Os ratos foram sacrificados através de qualquer injeção intraperitoneal de pentobarbital na dose de 270 mg/kg de peso corporal ou através de perfusão transcardial (consulte a etapa 6.1). Os investigadores podem se referir a Geiger, et al Et al . 30, Kirby, 31e Gage, et al. 32 para obter detalhes sobre cirurgia estereotáxica do roedor.

  1. Anestesiar o mouse e corrigi-lo em uma armação estereotáxica.
  2. Aplique lubrificante ocular os olhos do rato para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  3. Use uma broca dental e armação estereotáxica para abrir uma craniotomia nas coordenadas desejadas no crânio. Abra uma craniotomia segunda longe do local da injeção para a inserção de um parafuso de aterramento de aço inoxidável ou arame.
  4. Consertar um substrato de fixação no crânio com cimento dental. Corte uma grande lacuna de aproximadamente 1 mm no substrato para melhorar a confiabilidade da etapa mais tarde no processo de dobramento.
    Nota: Um cabo plano flexível (FFC) corte de um obras "L" forma bem (Figura 7A), embora muitos materiais iria trabalhar, enquanto eles são da espessura correta para o 32-channel zero conector de força (ZIF) de inserção (projetado para cabos grossos de 0,05 mm ± 0,18).
  5. Monte o titular da pipeta com a agulha que contém malha eletrônica sobre a armação estereotáxica usando uma pinça de fim de ângulo reto (Figura 4 e figura 6A).
  6. Anexar a tomada do lado do titular da pipeta para uma seringa de 5 mL, prendida em uma seringa da bomba (Figura 6) usando um aproximadamente 0,5 – 1 m de comprimento do tubo capilar.
    Nota: Certifique-se existem sem bolhas no tubo capilar antes de conectá-lo ao titular da pipeta. Bolhas podem interromper o fluxo durante a injeção e evitar uma entrega suave e controlada de malha eletrônica.
  7. Use a armação estereotáxica para colocar a ponta da agulha no local desejado partido dentro do cérebro.
    Nota: As sondas de eletrônica de malha usadas aqui são projetadas com gravação eletrodos espalhados ao longo de um comprimento de aproximadamente 2 milímetros e com o primeiro eletrodo localizado ca. 0,5 mm da borda inicial da malha eletrônica (borda extrema esquerda na Figura 3A). Por esta razão, as coordenadas estereotáxicos devem ser selecionadas, tal que a localização inicial é 0,5 mm mais profundo do que a região do cérebro de interesse. A disseminação e a localização dos eletrodos gravação dentro de malha eletrônica podem ser selecionados livremente durante o processo de desenho de máscara e devem ser selecionados para que os eléctrodos de gravação abrangem a região ou regiões do cérebro de interesse, como eles são injetados ao longo de seus estereotáxica trajetória.
  8. Posição da câmera (Figura 6B) para exibir a parte superior da malha eletrônica sonda dentro da agulha de vidro. Algum software permite ao usuário desenhar uma linha na tela para marcar a posição original da malha eletrônica.
  9. Iniciem o fluxo definindo a bomba de seringa de baixa velocidade e pressionar Start. 10 mL/h é uma taxa de fluxo inicial típico para uma 400 µm diâmetro interno capilar a agulha. Se a sonda eletrônica de malha não se move dentro da agulha, Aumente lentamente a taxa de fluxo.
    Nota: É importante minimizar o volume de líquido injetado no cérebro como isto pode danificar o tecido ao redor do local da injeção. Melhores resultados são obtidos com volumes de injeção menor que 25 µ l por 1 mm de comprimento da malha injetado. Os valores ideais são menos da metade deste volume; em nosso laboratório, nós injetamos tipicamente 10-50 µ l por um comprimento de malha de 4mm injetado.
  10. Como a sonda eletrônica de malha começa a mover-se dentro da agulha, use a armação estereotáxica para retrair a agulha no mesmo ritmo com o qual está sendo injectada a sonda eletrônica de malha, usando a posição original marcada da malha eletrônica como um guia.
    Nota: Este procedimento, denominado o campo de visão (FoV) injeção método25, permite entrega precisa de malha eletrônica para uma região específica do cérebro sem amassar ou luxação. Muitas vezes a taxa de fluxo pode ser reduzida, uma vez que a sonda eletrônica de malha começa se deslocam no interior da agulha. Em nosso laboratório, vazões de 20 a 30 mL/h são muitas vezes necessárias para superar o atrito estático entre a malha e paredes capilares agulha, mas a taxa então pode ser reduzida a 10 mL/h, uma vez iniciado o processo de injeção. Vazões e volumes de injeção são geralmente menores para agulhas capilares de menor diâmetro.
  11. Continue fluindo salina e retracção da agulha até que a agulha foi encerrado o crânio. Pare o fluxo da bomba de seringa.

4. entrada/saída Interfacing

Nota: neste ponto, a malha eletrônica sonda tenha sido injetada do ponto de partida desejado dentro do cérebro ao longo da trajetória escolhida. A agulha tem sido recolhida e está logo acima a craniotomia com a malha eletrônica interconecta abrangendo do cérebro para a agulha e a e/s almofadas ainda dentro da agulha (Figura 7B). Esta seção usa uma placa de circuito impresso (PCB; Figura 7, Figura 8) para fazer interface com a sonda eletrônica de malha. O PCB se conecta a um conector ZIF para um conector de 32 canais amplificador padrão através de um substrato isolante que se torna a cabeça-estágio para experiências de gravação neural. O PCB é personalizável para acomodar várias configurações de cabeça-estágio. Nossos arquivos de projeto estão disponíveis por solicitação ou a partir do Web site do recurso, meshelectronics.org e pode ser usado para comprar PCBs barata de fornecedores de serviços de fabricação e montagem de PCB.

  1. Usar o quadro estereotáxica cuidadosamente guiar a agulha para o FFC substrato de fixação e através da abertura, fluindo a solução com a bomba de seringa para gerar desconto em eletrônica a malha interliga (Figura 7).
  2. Uma vez que a agulha está acima do substrato de fixação e através da abertura, retome o fluxo em ritmo acelerado para ejetar a malha eletrônica almofadas de I/O sobre o substrato de fixação (Figura 7).
  3. Usando uma pinça e uma pipeta de DI, dobre as almofadas I/O para ca. ângulo de 90° como próximo o primeiro bloco de I/O possível.
    Nota: A dobra é necessária para permitir que as almofadas ser inserido no conector ZIF de um PCB em uma etapa posterior. O conector ZIF é exatamente a mesma largura que as 32 almofadas de I/O da malha eletrônica sonda, então dobre um imperfeito 90°, ou uma curva não ocorrendo bem antes do primeiro pad I/O, irão resultar em ter que cortar pastilhas de I/O (as pastilhas mais à esquerda na Figura 7E).
  4. Uma vez que as almofadas de I/O estão alinhadas, desdobrado e em um ângulo de 90° para a haste de malha, seca-los no lugar com suavemente flui ar comprimido.
    Nota: Malha eletrônica sondas com menos de 32 canais pode ser interfaceada com a mesma placa de interface de 32 canais. Por exemplo, nosso laboratório comumente usa malha 16 canais eletrônicos sondas com PCB de 32 canais. Isso proporciona espaço extra dentro do conector ZIF, tornando a interface mais fácil, e os canais isolados adicionais são facilmente identificados como circuitos abertos, por meio de impedância testes durante as sessões de gravação.
  5. Corte o substrato de fixação em uma borda reta aproximadamente 0,5 a 1 mm da borda das almofadas do I/O. Também corte partes estranhas do substrato aperto que dificultam a inserção no PCB-montado 32 canais ZIF conector (Figura 7F).
  6. Insira as almofadas de I/O no conector ZIF sobre o PCB e fechar a trava (Figura 7). Interface de utilização eletrônica de medição para medir a impedância entre os canais e o parafuso de terra para confirmar o sucesso. Se os valores de impedância são muito altos, soltar o conector ZIF, ajustar a inserção e teste novamente até a conexão bem sucedida é confirmada.
  7. Cobrir o conector ZIF e expostas malha eletrônica interconecta com cimento dental para proteção. Aleta do PCB na gap no substrato e consertar o PCB com cimento para o crânio de rato (Figura 7 H).
    Nota: Dobra o FFC na gap reduz a tensão mecânica que às vezes pode quebrar a malha eletrônica interconecta.
  8. Deixe o cimento endureça, transformando o PCB em um cabeça-palco compacto, robusto para interfaceamento durante as sessões de gravação subsequente (Figura 7I).

5. neural gravação experimentos

  1. Coloque o mouse em um tailveiner ou outros de retenção33. Insira o pré-amplificador PCB no conector amplificador padrão sobre o PCB de cabeça-estágio. Use um cabo separado para aterrar o parafuso de referência.
  2. Para gravações comedidas, deixe o mouse na retenção. Grave os dados usando o sistema de aquisição de dados para o período de tempo desejado (Figura 8A).
  3. Para mover-se livremente gravações, solte o mouse da retenção após inserir o pré-amplificador PCB e o parafuso de referência de ligação à terra. Registro para o comprimento desejado do tempo usando o sistema de aquisição de dados, enquanto o mouse se comporta livremente (Figura 8B).
  4. No final da sessão de gravação, leve o mouse para a retenção, se necessário. Remova o fio de aterramento e o pré-amplificador, em seguida, solte o mouse volta para sua jaula e devolvê-lo para as instalações de animais, até a próxima sessão de gravação.

6. histológicas, corte, coloração e de imagem

  1. Esperar até a injeção de pós de tempo desejado, em seguida anestesiar o mouse e transcardially perfundir com formaldeído. Remover, congelamento e cryosection do cérebro em 10 µm de espessura. Um protocolo detalhado na imuno-histoquímica e cryosectioning do tecido cerebral de roedores pode ser encontrado em Evilsizor, et al. 34.
    Nota: Tecido cerebral contendo malha eletrônica pode ser fixo e seccionado normalmente, mesmo que a monitoração eletrônica é deixada dentro. Este é um recurso exclusivo em comparação com sondas neurais convencionais, que deve ser removidas antes de corte e, portanto, podem modificar o tecido ou dificultar a analisar a interface sonda-tecido.
  2. Enxague as seções de tecido de cérebro congelado 3 vezes em 1X PBS.
  3. Bloquear as seções em uma solução de 0,3% Triton X-100 e 5% cabra soro em 1X PBS. Deixe descansar em temperatura ambiente por 1h.
  4. Incube as seções com a solução de anticorpos primários. As soluções de anticorpo primário usadas aqui eram de coelho anti-NeuN (diluição de 1: 200), antirato Neurofilamento de (diluição de 1: 400) e rato anti-GFAP (diluição 1: 500) com soro de cabra 0.3% Triton X-100 e 3%. Incubar durante uma noite a 4 ° C.
  5. Enxague as seções 9 vezes para um total de 40 min com PBS 1x.
  6. Incube as seções do cérebro com a solução de anticorpos secundários. As soluções de anticorpo secundário usadas aqui eram Alexa Fluor 488 de cabra anticoelho (diluição de 1: 200), Alexa Fluor 568 cabra anti-mouse (diluição de 1: 200) e Alexa Fluor 647 anticabra rato de (diluição de 1: 200). Incube as seções por 1h à temperatura ambiente.
  7. Enxague as seções 9 vezes para um total de 30 min com PBS 1x.
  8. Monte as seções nas corrediças de vidro com lamelas usando antidesgaste para montagem. Deixe os slides no escuro pelo menos 24 h antes de imagem.
  9. As lâminas de imagem com um microscópio confocal usando 488 nm, 561 nm e 633 nm lasers como as fontes de excitação para Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 647, respectivamente. Use o contraste de interferência diferencial (DIC) para a malha eletrônica de imagem no mesmo microscópio para posterior sobreposição das imagens e análise.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resultados irão variar com base nas espécies animais em estudo, a região do cérebro específica, o tempo decorrido desde a injeção, a quantidade de agudos danos infligidos durante a injeção e o sucesso da e/s interface de procedimento, entre outros fatores. Atividade de cravação unitárias pode não aparecer até 1 dia (no caso de agulhas de diâmetro interno 150 µm) em 1 semana após as injeção e spike amplitudes podem variar até 4 – 6 semanas. A Figura 9 mostra dados eletrofisiológicos representativos de uma sonda eletrônica de 32 canais malha injetado no hipocampo e córtex somatossensorial primário de um rato masculino adulto de C57BL/6J. Aproximadamente de potenciais de campo local de amplitude de 300-µV (LFPs) foram registrados em todos os 32 canais e atividade de cravação unitárias foi gravada em 26 canais. O LFPs e picos isolados permaneceram semelhantes entre 2 e 4 meses, sugerindo uma interface altamente estável entre gravação eletrônica e neurônios ao longo deste período de tempo prolongado. A Figura 10 mostra resultados representativos de corte histológico e imunocoloração de tecido cerebral contendo malha eletrônica 1 ano após a injeção. Coloração para NeuN, um marcador para somata neural e Neurofilamento, um marcador para axônios neurais, não revela pouca ou nenhuma perda de densidade do tecido no local da injeção, implicando a perfeita interface entre o tecido de malha eletrônica e cérebro. Coloração para GFAP (um marcador para astrócitos) mais revela níveis de perto-fundo de astrócitos em torno de malha eletrônica, indicando que sua presença provoca resposta imune pouco crônica.

figure-results-1
Figura 1: etapas em uma seringa injetável malha eletrônica experiência. Este protocolo descreve todas as etapas-chave em um experimento de gravação neural roedor típico usando malha eletrônica. Experiências geralmente implica, em ordem de execução, (1) fabricação de malha eletrônica, (2) um carregamento de malha eletrônica em agulhas capilares, (3) estereotáxica injeção de malha eletrônica para o cérebro, I/O (4) elétrica interfaceamento para malha eletrônica, gravações contidas ou livremente móveis (5) e (6) malha/tecido, corte e coloração para a histologia. Em alguns estudos, apenas dados de histologia podem ser desejados, caso em que os passos (4) e (5) pode ser ignorada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: diagrama esquemático mostrando o processo de fabricação de malha plug-and-play eletrônica na região de dispositivo super flexível (linha superior), haste interconexões (linha média) e região I/O (linha inferior). (A) SU-8 fotorresiste negativo (vermelho) é modelado com máscara de PL-1 para definir o fundo passivating camada de cada sonda electrónica do engranzamento plug-and-play. (B) a padronização com máscara-2 PL, evaporação térmica e decolagem metal definir Au interconexões e almofadas de I/O (ouro). (C) padronização com máscara-3 PL, evaporação por feixe de elétrons e decolagem metal definir eletrodos de Pt (azul). (D) SU-8 fotorresiste negativo (vermelho) é modelado com máscara de PL-4 para definir a camada passivating superior. Aberturas no SU-8 são deixadas em cada eletrodo Pt e almofada I/O. (E) A conclusão de malha sonda eletrônica com caixas tracejadas indicando os locais ampliados no topo, meio e linhas de fundo. Arquivos de projeto Fotomáscara estão disponíveis mediante pedido dos autores ou do local do recurso, meshelectronics.org. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: fotografias e imagens de microscópio ótico de plug-and-play de malha eletrônica. (A) lado a lado imagens de microscópio óptico de uma sonda eletrônica de seringa injetável malha com plug-and-play e/s. A sonda foi fotografada após a conclusão da fabricação etapas na Figura 2 , mas antes do lançamento do substrato Ni-revestida. Caixas tracejadas correspondem da esquerda para a direita para as seções da região de dispositivo super flexível, haste e região I/O ampliada em C, D e E, respectivamente. Barra de escala = 1 mm. (B) fotografia de uma bolacha de 3 polegadas Si contendo 20 completou malha eletrônica sondas. Barra de escala = 20 mm. (C) imagem de microscópio óptico de 20 µm de diâmetro Pt gravação os eléctrodos na região de dispositivo super flexível. Barra de escala = 100 µm. (D) imagem de microscópio óptico de alta densidade Au interconexões na região do tronco. Cada interligação Au é eletricamente isolada e se conecta a um único eletrodo Pt para um único bloco de I/O. Barra de escala = 100 µm. (E) óptica imagem de microscópio almofadas de I/O. Cada bloco consiste em uma região de malha dobrável e uma região contínua de filme fino localizado na haste. Non-realizando SU-8 fitas conectar as porções de malha das almofadas juntos para ajudar a manter o alinhamento. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: montagem do aparato para a realização de agulhas capilares durante a injeção. (A) fotografia dos componentes do aparelho. Os componentes incluem (1) uma agulha de vidro capilar, (2) um titular da pipeta, (3) um elemento de fixação do parafuso circular para o titular de uma pipeta e (4) uma arruela de cone para o titular de uma pipeta. Itens (2) a (4) são incluídas com a compra de um titular da pipeta. A seta marca a saída do titular da pipeta que deve ser colada fechada com epóxi. (B) fotografia do titular pipeta após a montagem e a inserção de uma agulha de vidro capilar. O epóxi adicionado é visível na saída superior do titular da pipeta (marcado pela seta) e tubo capilar conecta o titular de uma pipeta de uma seringa (não mostrada). (C) fotografia do titular a pipeta e a agulha capilar após a fixação ao quadro estereotáxica com uma pinça de ângulo reto final. Barras de escala são 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: carregar da malha eletrônica em agulhas de vidro. (A) ilustração esquemática do processo de carregamento para a eletrônica do engranzamento plug-and-play. Uma agulha de vidro está posicionada perto do fim de I/O de uma sonda eletrônica de malha, enquanto ele está suspenso em solução. O êmbolo da seringa é então manualmente retraído para desenhar a malha eletrônica sonda. Posicionamento ideal é com a região de super flexível dispositivo apenas dentro da extremidade da agulha. Fotografias (B) correspondente a (A) de uma sonda eletrônica de malha sendo carregada em uma agulha de vidro. Escala de barras = 2 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: esquemático da estação de cirurgia estereotáxica. Uma armação estereotáxica motorizada (A) com titular da pipeta anexado é usada para posicionar a agulha para a região do cérebro desejado. A posição da agulha e carregado de malha eletrônica são monitorados com uma lente objetiva e anexado a câmera (B) e exibido em um computador (C). Uma bomba de seringa (D) flui precisos volumes de solução salina através da agulha, permitindo a injeção precisa, controlada de malha eletrônica na região do cérebro desejado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: I/O Plug-and-play, interfaceando procedimento. (A) An FFC substrato de fixação é fixado com cimento dental adjacente a craniotomia. (B) Plug-and-play malha eletrônica stereotaxically é injetadas na região do cérebro desejado usando o método de FoV. (C), a agulha, com as almofadas de I/O da malha eletrônica sonda ainda está lá dentro, é reposicionado sobre o FFC substrato de fixação. (D) fluxo é retomado através da agulha para ejetar as almofadas de I/O para o FFC substrato de fixação. (E) as almofadas de I/O são dobrados a 90 ° em relação à haste, se desenrolava com a maestro virados para cima e secos no lugar. Substrato (F) o FFC é cortado com uma tesoura para uma linha recta ca. 0,5 mm da borda das almofadas do I/O. Substrato em excesso é cortado para permitir a inserção em um conector ZIF de 32 canais. Almofadas (G) a e/s são inseridas em um conector ZIF de 32 canais montado em um PCB personalizado. O conector ZIF é trancado fechada para fazer contato com as almofadas de I/O. (H), a trava é cimentada fechado, o PCB é invertido para o crânio e o PCB é fixado com cimento dental. (eu) o PCB forma um headstage compacto com um conector padrão de amplificador para interfaceamento fácil durante as sessões de gravação. Barras de escala = 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: gravações comedidas e livremente movente. (A) fotografia de um rato C57BL/6J masculino em uma retenção durante uma sessão de gravação. Um pré-amplificador de 32 canais PCB foi inserido no conector amplificador padrão. (B) fotografia do mouse mesmo com pré-amplificador de 32 canais PCB durante um experimento de gravação livremente em movimento. Barras de escala = 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: resultados representativos de gravação neural. (A) representante LFP mapas de calor de 32 canais de malha sondas eletrônica injetadas o rato hipocampo e córtex somatossensorial. Dados foram gravados enquanto o mouse livremente explorado sua gaiola em 2 meses (topo) e pós-injeção de 4 meses (parte inferior). Amplitude LFP é codificados por cores de acordo com a barra de cores à direita. Vestígios de filtrado de passa-alta (preto) mostrando atividade cravação são sobrepostos no espectrograma para cada um dos 32 canais. (B) picos isolados após a classificação dos dados plotados no (A). Atividade de cravação unitárias foi detectada no 26 da 32 canais de ambos os 2 meses pós-injeção (topo) e injeção de pós 4 meses (parte inferior). Os números acima de cada cluster de picos correspondem aos números de canal no (A). Esta figura foi modificada de Fu, et al 28. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10: resultados representativos histologia. (A) esquema ilustrando a orientação da malha eletrônica dentro horizontal (painel central) e sagital fatias de cérebro (painel inferior). (B) imagem de microscópio de fluorescência de uma fatia de espessura cortical cerebral de 10 µm um ano após a injeção de uma sonda eletrônica de malha de 16 canais. A fatia tem sido immunostained por NeuN (verde). (C) a mesma fatia do cérebro immunostained para Neurofilamento (vermelho). (D) o mesmo cérebro fatia immunostained para GFAP (ciano). (E), A imagem composta (B) a (D) mostrando o malha eletrônica/tecido interface com rotulado NeuN (verde), Neurofilamento (vermelho), GFAP (ciano) e malha eletrônica (azul). Barras de escala = 100 µm. Esta figura foi modificada em Fu et al . 27. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Video 1: repetiu o carregamento e injeção de malha eletrônica na solução. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

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Todas as etapas de fabricação e o uso de malha eletrônica são importantes, mas alguns são especialmente críticos. Antes de lançar a malha eletrônica da sua bolacha, é essencial para oxidar a superfície para fazer as malhas prontamente suspensas em solução aquosa (etapa 1.6.1). Se esta etapa será pulada, as malhas geralmente flutuam na superfície da água, tornando-os difíceis de carregar para as agulhas, e se podem ser carregados, furam para os lados da agulha de vidro, que requerem grandes volumes (> 100 µ l) para a injeção. Falha para oxidar a superfície antes de lançamento, portanto, normalmente significa que as malhas não podem ser usadas e a fabricação devem ser re-interpretadas desde o início. Outro passo crítico é dobrar a malha eletrônica "haste" para ~ 90° durante a i/o interface (passo 4.3). Se o ângulo for menor do que 90°, então todos os 32 blocos de I/O não vão caber no conector ZIF; Alguns terão que ser cortar a extremidade para permitir a inserção, reduzindo o número de eletrodos conectados. O processo também deve ser feito com cuidado para evitar que o tronco quebrado.

O projeto da malha eletrônica pode ser personalizado para várias aplicações modificando as máscaras e usando o mesmo procedimento de fabricação descrito na Figura 2. Por exemplo, enquanto as sondas de malha eletrônica usadas para gravar os dados na Figura 9 foram projetadas para ter 32 gravação eletrodos abrangem o rato hipocampo e córtex somatossensorial primário, a colocação do eletrodo dentro da malha super flexível pode ser selecionado para praticamente qualquer cérebro região (ões)-alvo, ou maiores eletrodos para estimulação podem ser incorporado27. O mesmo procedimento de estrutura e de fabricação de malha básica são retidos, mas a colocação do eletrodo e o design são ajustadas para atender às necessidades do estudo. Investigadores deve usar de cautela, no entanto e sempre teste desenhos modificados podem ser injetados facilmente através das agulhas pretendidas. Pequenas alterações à flexão mecânica da malha eletrônica podem ter efeitos substanciais sobre Injectabilidade. Um exemplo é que um ângulo de 45° entre fitas de SU-8 transversais e longitudinais produz uma sonda eletrônica de malha que pode ser injectada facilely mas um ângulo de 90° resulta em um que amassa e entope agulhas21.

Medir a impedância dos eletrodos gravação é útil para solução de problemas. Um eletrodo de Pt-20 µm de diâmetro circular deve ter uma magnitude de impedância perto 1 MΩ quando medido com uma frequência de 1 kHz no vivo ou em 1X PBS29. Uma impedância significativamente maior do que isto implica que o eletrodo não é exposto, como pode acontecer se está contaminado com resíduos de fotorresiste, ou não eletricamente conectado. Este último pode ocorrer se, por exemplo, poeira sobre a máscara de fotografia durante o PL que resulta em uma desconexão no Au interconexões, ou se uma das almofadas do I/O de malha não é contactada pelos pinos do conector ZIF durante o interface I/O. Uma magnitude de impedância cerca de metade do valor esperado sugere que o canal pode ser curto para o adjacente, criando um circuito de duas impedâncias de eletrodo paralelamente uns aos outros. Os valores de impedância medidos agir como um guia durante a resolução de problemas; combinado com microscopia óptica das sondas malha eletrônica, a origem do problema pode geralmente ser identificada e corrigida em conformidade na fabricação próxima executar ou tentativa de interface I/O.

A utilização da seringa injetável malha eletrônica para estudos agudas é limitada em que a atividade de cravação unitárias geralmente não é observada até 1 semana pós injeção27, embora trabalhos recentes (não publicado) mostram que esta questão é facilmente superada. Determinantes do tempo necessário para ver o pico de atividade são a malha de design, o volume de líquido injetado no cérebro juntamente com malha eletrônica e o diâmetro da agulha usada para a injeção, como estas afetam o grau de danos no tecido durante o injeção e a taxa de cura. Volumes de injeção grande podem ser necessários se a malha eletrônica não é tratada com plasma de oxigênio antes do lançamento em Ni etchant; ou seja, se a malha não é hidrofílica, pode aderir na agulha de vidro. Ocasionalmente, as malhas têm defeitos que levam à flexão mecânica que os tornam difícil injetar. Durante o carregamento da malha eletrônica, é importante verificar que malhas são deslocam facilmente e suavemente a agulha (como mostrado no vídeo complementar 1). Se não, uma sonda eletrônica de malha diferente deve ser usada. Melhores resultados de interface neural sem emenda serão alcançados com os volumes de injeção ideal de 10-50 µ l por 4 mm de comprimento da malha injetado. Resultados mais recentes com sondas de eletrônica de malha mais finas injetada e/ou menor diâmetro capilar as agulhas (tão pequenas quanto 150 µm diâmetro interno, diâmetro externo de 250 µm) mostram aquela única unidade cravação pode ser observada desde logo após a injeção (medições agudas) através de tempos mais longos. Arquivos de projeto de máscara para essas estruturas mais finas de malha estão disponíveis por solicitação ou do site do recurso, meshelectronics.org. Estimamos que o rendimento global dos nossos na vivo malha injeção procedimentos usando 400 µm agulhas de (diâmetro externo de 650 µm) de diâmetro interno para cerca de 70%, embora o rendimento é mais perto de 80-90% para o nosso trabalho mais recente com 150 µm de diâmetro interno (250 µm diâmetro exterior ) agulhas. As razões mais comuns de falhas são (1) que a malha não injectar suavemente, resultando em edema cerebral de volumes de injeção inesperadamente grande no cérebro, ruptura de malha (2) durante a manipulação manual exigida na e/s interface de procedimento e (3) sangramento de danificar um vaso sanguíneo durante a injeção. Danificar um vaso sanguíneo durante a injeção é raro (a causa de menos de 10% de falhas) e poderia ser reduzido ainda mais usando a cirurgia guiada por imagem. Constatamos também que o dano dos vasos sanguíneos é uma limitação comum de todos os procedimentos que envolvem a penetração do tecido cerebral, incluindo injeção de partículas virais para transfeccao, implantação de sondas de cérebro rígida e injeção da malha eletrônica.

Malha eletrônica sondas são capazes de estàvel gravar e rastrear os mesmos neurônios individuais pelo menos meses para escalas de tempo ano e não evocam quase nenhuma resposta imune crônica, conforme demonstrado na Figura 9 e Figura 10, respectivamente. Isto representa uma vantagem significativa em comparação com eletrodos de profundidade de Convenção, que geralmente sofrem diminuindo pico amplitudes, sinais instáveis e inflamação crônica ao longo do longo prazo gravação experimentos14, 15. Além disso, a malha eletrônica têm a vantagem que eles podem ser deixados no tecido durante o corte histológico, coloração, e imagem latente, em contraste com sondas convencionais, que são demasiado rígida e, portanto, deve ser removida antes da histologia análises. Daí, malha eletrônica permite a capacidade única de usar a análise imuno-histoquímica para estudar precisamente o ambiente celular em torno de cada local de gravação.

O protocolo apresentado aqui, abre-se emocionante novas oportunidades em neurociência. O método de entrega minimamente invasiva e perfeita integração da malha eletrônica com tecido cerebral minimiza interrupções nos circuitos neurais e evita a resposta imune crônica, que poderia beneficiar a maioria dos tipos de experimentos de gravação neural crônica. A capacidade da malha eletrônica para gravar e rastrear os neurônios único mesmos para longos períodos de tempo especial será de interesse para os investigadores procuram correlacionar atividade cravação de milissegundo-escala com processos mês ano e longo como o envelhecimento, a patogênese da doença do cérebro, ou cérebro desenvolvimento16,18. Além disso, existem oportunidades substanciais para estender e personalizar este protocolo, como a adição de eletrônica ativa ao PCB cabeça-palco para implementar a funcionalidade como digital, multiplexação de8,35, sem fio comunicação,35,36,37e35, co, injetando células-tronco ou polímeros com a malha eletrônica para auxiliar no tecido regeneração18,38, de processamento de sinal 39e incorporando nanofio campo – transistores de efeito (NW-FETs) em malha eletrônica para altamente localizadas e cérebro multifuncional sondas24,29,40,41 ,,42.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.M.L. reconhece apoio deste trabalho, o escritório da força aérea de investigação científica (FA9550-14-1-0136), um prêmio de ciências físicas da Universidade de Harvard e acelerador engenharia e um institutos de saúde diretor nacional do Pioneer Award ( 1DP1EB025835-01). T.G.S. reconhece apoio pelo departamento de defesa (DoD) através do programa National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. reconhece apoio de comunhão da American Heart Association (16POST27250219) e o caminho para independência Award (pai K99/R00) do Instituto Nacional do envelhecimento dos institutos nacionais de saúde. Este trabalho foi realizado em parte no centro da Universidade de Harvard para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob NSF ECCS Award no. 1541959.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Quadro estereotáxico motorizadoWorld Precision InstrumentsMTM-3Para cirurgia estereotáxica de rato
Controlador de gravação de 512 canaisIntan TechnologiesC3004Um componente do sistema de gravação neural
RHD2132 placa amplificadoraIntan TechnologiesC3314Um componente do sistema de gravação neural
RHD2000 cabode interface SPI ultrafino de 3 pésIntan TechnologiesC3213Um componente do sistema de gravação neural
Mouse resrestringirBraintree ScientificTV-150  Padrão STDDiâmetro interno de 1,25 polegadas; usado para conter o mouse durante sessões de gravação restritas.
Bolachasde Si Nova Electronic Materials3" P < 100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μ m Bolachas de Si SSP de Grau Primário Thick
com 2 Semi-Std. Sapatilhas &
6.000 A° ± 5% de Óxido Térmico Úmido em ambos os lados.
Fotomáscaras (cromo sobre vidro sodo-cálcico)Reproduções avançadas AAdvance Reproductions e outros fornecedores fabricam fotomáscaras a partir de arquivos de design fornecidos. Nossos arquivos de design de máscara fotográfica estão disponíveis mediante solicitação ou no site de recursos, meshelectronics.org. Como alternativa, algumas salas limpas universitárias têm escritores de máscaras para fazer fotomáscaras no local.
Software AutoCADAutodesk Inc.Software de design para desenhar fotomáscaras. Uma alternativa gratuita é o LayoutEditor. Nossos arquivos de design de máscara fotográfica estão disponíveis mediante solicitação ou no site de recursos, meshelectronics.org.
Evaporador térmicoSharon VacuumUsado para evaporar Ni, Cr e Au em eletrônicos de malha durante a fabricação. Muitas salas limpas universitárias têm essa ferramenta ou uma ferramenta semelhante.
SU-8 2000.5 fotorresistente negativoMicroChem Corp.Fotorresistente negativo usado para definir as camadas passivantes inferior e superior da eletrônica de malha.
Alinhador de máscara MA6Karl Suss Microtec AGUsado para alinhar cada fotomáscara ao padrão no wafer e expor o wafer à luz UV. A maioria das salas limpas universitárias tem esta ferramenta ou uma ferramenta semelhante.
Desenvolvedor do SU-8MicroChem Corp.Usado para desenvolver fotorresistente negativo SU-8 após exposição à luz UV.
LOR3A resistente à decolagemMicroChem Corp.Usado com fotorresistente Shipley 1805 para promover o rebaixamento durante processos de elevação de metal
Shipley 1805 fotorresistente positivoMicroposit, The Dow Chemical CompanyFotorresistente positivo usado para definir interconexões de metal e eletrodos Pt em eletrônica de malha
Desenvolvedor de fotorresiste positivo MF-CD-26Microposit, The Dow Chemical CompanyPara desenvolver fotorresistente positivo S1805 após exposição em um alinhador de máscara. Muitas salas limpas universitárias estocam esse produto químico.
Revestidor de rotaçãoReynolds TechPara revestimento de wafers com resistências positivas e negativas. A maioria das salas limpas da universidade tem revestidores giratórios.
Sistema de tratamento de superfície a plasma PJAST Products, Inc.Usado para oxidar a superfície da eletrônica de malha antes de liberá-la em solução aquosa. A maioria das salas limpas universitárias tem esta ferramenta ou uma ferramenta semelhante.
Dentonevaporador do feixe de elétronsPara evaporar o Cr e o Pt durante a fabricação da eletrônica da malha. Muitas salas limpas universitárias têm essa ferramenta ou uma ferramenta semelhante.
Removedor PGMicroChem Corp.Usado para dissolver LOR3A e Shipley S1805 resiste durante a decolagem do metal
cloreto férricoMG Chemicals415-1LUm componente da solução de corrosão Ni
36% solução de ácido clorídricoKanto Corp.Um componente da solução de corrosão Ni
Agulhas capilares de vidroDrummond Scientific Co.Diâmetro interno 0,40 mm, diâmetro externo 0,65 mm. Outros diâmetros estão disponíveis.
Porta-micropipetas U-typeMolecular Devices, LLC1-HL-UUsado para segurar as agulhas capilares de vidro durante a injeção estereotáxica
Seringa de 1 mLNORM-JECT®, Henke Sass WolfUsado para carregamento manual de eletrônicos de malha em agulhas capilares Tubo de
cateter intradêmico de polietileno BectonDickinson and CompanyDiâmetro interno 1,19 mm, diâmetro externo 1,70 mm
Seringa de 5 mLBecton Dickinson and CompanyUsada na bomba de seringa para injeção de malha eletrônica in vivo
Câmera ocularThorlabs Inc.DCC1240CUsado para visualizar a eletrônica de malha dentro de agulhas capilares durante a injeção
Software de aquisição de imagem ThorCam uc480 para câmeras USBThorlabs Inc.Usado para visualizar a eletrônica de malha dentro de agulhas capilares durante a injeção
Bomba de seringaHarvard ApparatusPHD 2000Usado para fluir volumes precisos de solução através de agulhas capilares durante a injeção de eletrônica de malha
EXL-M40 broca odontológicaOsada3144-830Para perfurar a craniotomia
Broca de 0,9 mm FineScience Tools19007-09Para perfurar a craniotomia
Esterilizador de esferas quentes 14 cmFine Science Tools18000-50Usado para esterilizar instrumentos cirúrgicos
Instrumento de crioseccionamento CM1950Leica MicrosystemsUsado para cortar tecido congelado em seções. Muitas universidades têm esta ou uma ferramenta semelhante disponível em uma instalação compartilhada.
0,3% Triton x-100Life TechnologiesUsado para histologia
5% soro de cabraLife TechnologiesUsado para histologia
3% soro de cabraLife TechnologiesUsado para histologia
Coelho anti-NeuNAbcamab177487Usado para histologia
Mouse anti-NeurofilamentAbcamab8135Usado para histologia
Rato anti-GFAPThermo Fisher Scientific Inc.PA516291usado para histologia
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher Scientific Inc.P36930Usado para histologia
Poli-D-lisinaSigma-Aldrich Corp.P6407-5MGPeso molecular = 70-150 kDA
Braçadeira de extremidade de ângulo retoThorlabs Inc.RA180/MUsado para prender o porta-pipeta à estrutura estereotáxica
Placa de circuito impresso (PCB)Circuitos AvançadosUsado para fazer a interface entre a eletrônica de malha e a eletrônica de medição periférica, como o sistema de gravação Intan. A Advanced Circuits e outros fornecedores fabricam e montam PCBs com base nos arquivos de projeto fornecidos. Nossos arquivos de design de PCB estão disponíveis mediante solicitação ou no site de recursos meshelectronics.org
conector de amplificador padrão de 32 canaisOmnetics Connector Corp.A79024-001Componente montado no
cabo flexível plano de 32 canais (FFC) do PCBMolex, LLC152660339Usado como um substrato de fixação ao fazer interface com almofadas de E / S eletrônicas de malha com o conector ZIF montado em PCB
Conector de força de inserção zero de 32 canais (ZIF)Hirose Electric Co., LTDFH12A-32S-0.5SH (55)Componente montado no PCB
Vácuo de do Solução de

References

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