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Artículo de método

Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

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DOI:

10.3791/58041

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3 de agosto de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Miller School of Medicine, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation (Yantai University), Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

En este artículo

Resumen

Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios biológicos celulares basado en la proyección de imagen de la fluorescencia de la agregación de la proteína y autofagia flujo en sistema nervioso central de Drosophila modelos de neurodegeneración.

Resumen

Con la creciente prevalencia de enfermedades neurodegenerativas, es cada vez más importante comprender la fisiopatología subyacente que conduce a la pérdida y disfunción neuronal. Tecnologías y herramientas de imágenes basadas en fluorescencia permiten análisis sin precedentes de los procesos neurobiológicos subcelulares, pero todavía hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes . Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes basados en fluorescencia usando modelos de Drosophila de la neurodegeneración. Específicamente, se describe un enfoque fácil de seguir, semiautomático con Fiji/ImageJ para analizar dos procesos celulares: en primer lugar, cuantificar el contenido total de proteína y perfil en el lóbulo óptico de Drosophila mediante etiquetado fluorescente mutante proteínas huntingtina; y en segundo lugar, evaluar flujo de autofagia-lisosoma en el sistema visual de Drosophila con cuantificación basada en radiométrica de un reportero fluorescente de tándem de la autofagia. Importante, el protocolo descrito aquí incluye un paso de segmentación semiautomática para asegurar que todas las estructuras fluorescentes se analizan para reducir al mínimo el sesgo de selección y para aumentar la resolución de comparaciones sutiles. Este enfoque puede ser extendido para el análisis de otras estructuras biológicas de la célula y procesos implicados en la neurodegeneración, como proteico puncta (gránulos de estrés y complejos sinápticos), compartimentos, así como unida a la membrana (mitocondrias y vesículas tráfico de membrana). Este método proporciona un estándar, pero adaptable punto de referencia para análisis de imagen y cuantificación y podría facilitar la confiabilidad y reproducibilidad a través del campo y en última instancia, mejorar la comprensión mecanicista de la neurodegeneración.

Introducción

Las enfermedades neurodegenerativas afectan a millones de personas cada año y la incidencia está aumentando con un envejecimiento población1. Mientras que cada enfermedad neurodegenerativa tiene una etiología única, agregación de proteínas mal plegadas y avería de la red proteostasis son características distintivas patológicas común de muchas de estas enfermedades. Dilucidar cómo la interrupción de estos procesos fundamentales e interrelacionados va mal contribuir a la muerte neuronal de la célula y disfunción es fundamental para entender las enfermedades neurodegenerativas, así como orientar las intervenciones terapéuticas. La proyección de imagen basada en la fluorescencia permite la investigación de estos procesos complejos y dinámicos en las neuronas y ha contribuido enormemente a nuestra comprensión de la biología de la célula neuronal. Análisis de fluorescencia de etiquetado proteínas es un reto, sobre todo cuando los experimentos se llevan a cabo en vivo, altamente compacta los tejidos, tipos de células diversas y heterogeneidad morfológica. Cuantificación manual asistida es asequible y sencillo, pero es a menudo desperdiciadora de tiempo y sujeto a sesgo humano. Por lo tanto, hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes.

Hemos esbozado un flujo de trabajo simple y adaptable con Fiji/ImageJ, un software2,3, de procesamiento de imágenes poderosas y libremente accesibles para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes de fluorescencia en modelos experimentales de neurodegeneración con Drosophila. Siguiendo este protocolo para cuantificar la agregación proteica y autofagia flujo — dos celulares características biológicas que son altamente relevantes para la patología de enfermedades neurodegenerativas, demostró la sensibilidad y la reproducibilidad de este enfoque. Análisis de fluorescencia de etiquetado huntingtina (Htt) de proteínas en el lóbulo óptico de Drosophila revelaron el número, tamaño e intensidad de agregados de proteína. Visualizamos un reportero fluorescente del tándem de autofagia flujo dentro del sistema visual de Drosophila , que muestra señales de emisión diferentes dependiendo de la compartimentación medio ambiente4. Análisis del reportero tándem radiométrica permitió una visión cuantitativa y global del flujo de la autofagia-lisosoma de autophagosome formación, maduración y transporte a la degradación en el lisosoma y además destacó vulnerable compartimientos en enfermedades neurodegenerativas. Lo importante, en ambos análisis hemos implementado pasos umbralización y segmentación semiautomáticos en nuestro protocolo para minimizar el sesgo inconsciente, aumentar el poder de toma de muestras y proporcionar un estándar para facilitar las comparaciones entre estudios similares. El flujo de trabajo sencillo pretende hacer poderosos plugins de Fiji/ImageJ (desarrollado por científicos de la computación basados en algoritmos matemáticos) más accesible a los neurobiólogos y la comunidad de Ciencias de la vida en general.

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Protocolo

1. consideraciones y preparados para diseñar el experimento de análisis de imagen

  1. Predeterminar conveniente anatómico, celular, subcelulares marcadores o para servir como puntos de referencia para la estandarización de una región de interés (ROI) a través de diferentes muestras, por ejemplo 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), marcadores de membrana, localizada fluorescente proteína, etc.
  2. Seleccione un marcador fluorescente que puede delimitar puncta discreta más allá de los niveles de fondo de la estructura de interés.
    Nota: Este protocolo está optimizado para estructuras proteicos (por ejemplo, agregados de proteínas mal plegadas) y membrana-limitan organelles (p. ej., reportero de autofagia). Para visualizar la agregación de la proteína, un fragmento de la etiqueta RFP N-terminal de proteína Htt humana con un tracto de poliQ patógenos de 138 repeticiones (RFP-hHttQ138) fue utilizado5. La proteína Htt mutada forma citoplásmicos agregados cuando se expresan bajo controladores neuronales específicos como elav-GAL45,6. Para visualizar el flujo de autophagosome-lisosoma, La actinia-GAL4 fue utilizado para conducir ubicuo expresión del reportero tándem mCherry-GFP-Atg8a. puncta mCherry y GFP positivas indican autophagosomes, y el flujo se controla como la fluorescencia de GFP se apaga en el ambiente ácido del lisosoma, donde mCherry resistente al ácido permanece hasta que la proteína es degradada7. Radiométrica análisis, un solo canal que es un indicador consistente de la estructura puede ser utilizado para segmentación, o caso que una proyección de dos o más canales puede utilizarse para delinear las estructuras, aunque no explícitamente descrito en el presente Protocolo. En este ejemplo, mCherry se utiliza para la segmentación de las partículas de Atg8 positivo, ya que es resistente al ácido y permanecerá en el compartimiento a través de flujo a través de la vía.
  3. Descargar e instalar la plataforma open source de análisis imagen ImageJ o Fiji, la distribución preferida de ImageJ con incluye plugins2,3.
  4. Instalar el plugin para cuenca interactivo h maxima.
    Nota: Este protocolo usa Fiji; plugins adicionales puede ser necesario para ImageJ. El plug-in desarrollado por Benoit Lombardot para SCF-MPI-CBG está disponible en línea (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
  5. Vaya a "ayuda | Actualización", seleccione"Administrar sitios de actualización"de la"actualización de ImageJ", elegir el sitio de actualizaciones de SCF-MPI-CBG de la lista y luego cerrar y reiniciar Fiji.

2. disección y tinción de inmunofluorescencia del cerebro

  1. Hacer silicona platos disección revestimiento de elastómero.
    1. Vierta la silicona componentes de elastómero en un vaso de precipitados según lo indicado por el fabricante y remover bien hasta que se mezcle bien.
    2. Utilice una pipeta para llenar 5 cm llena de platos de cultivo de tejidos un tercio a la mitad (aproximadamente 10 mL de mezcla de elastómeros). Deje que las burbujas ascienden a la superficie y quitar suavemente con papel de seda. Cubrir los platos y colocarlos sobre una superficie plana para curar por 48 – 72 h a temperatura ambiente (RT).
  2. Diseccionar el cerebro de la Drosophila y sistema visual si es necesario.
    1. Realizar la disección del cerebro de Drosophila como se describió anteriormente8,9. Realizar la disección en platos de disección revestimiento de elastómero, con un fondo de elastómero para estabilizar el cerebro para evitar dañar tejidos o fórceps.
    2. Para mantener la lámina intacto durante la disección, Deslice dos pinzas debajo de la retina y rasgar suavemente a través del centro del ojo para eliminar la retina. Tire cualquier tejido retiniano fijado a la lámina con fórceps a cabo paralelo a la superficie de la lámina.
      Nota: Pigmento Residual se lava en los siguientes pasos y generalmente no interfiere con el anticuerpo de la coloración y la proyección de imagen.
    3. Diluir el 37% de formaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una concentración final de 3,7% fresco antes de usarlo en un tubo de microcentrífuga de 500 μl. Transferir el cerebro disecado a tubo de microcentrífuga con solución fix e incubar durante 15 min a temperatura ambiente con el suave balanceo.
      Nota: El formaldehído tiene una natural tendencia a ser oxidado, produciendo ácido fórmico. Por lo tanto, se sugirió al formaldehído de alícuota del 37% para el almacenamiento y diluir hasta 3,7% recién antes de cada uso. Excesiva fijación o fijación insuficiente afectará la integridad del tejido y la fluorescencia10.
    4. Lavar 3 veces con PBTx (PBS con 0,4% Tritón X-100) durante 15 minutos.
  3. Realizar inmunohistoquímica y montar las muestras.
    1. Si anticuerpos es necesario, quitar PBTx, añadir anticuerpo primario diluido en PBTx con 5% de suero normal de cabra e incube de una alícuota de mezcla durante la noche a 4 ° C.
    2. Anticuerpo primario de quitar y lavar 3 veces con PBTx durante 15 minutos. Añadir el anticuerpo secundario diluido en PBTx con 5% de suero normal de cabra e incubar durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Lavar 3 veces con PBTx durante 15 minutos.
    3. Si se necesita tinción DAPI, quitar PBTx, añadir solución de DAPI (solución de stock: 5 mg/mL, diluir a una concentración de trabajo de 15 μg/mL en PBTx) e incubar 10 min a RT. Wash 3 veces con PBTx durante 15 minutos.
    4. Para eliminar el tejido, coloque una gota de medio de montaje en el centro de un portaobjetos de microscopía con un espaciador de una capa de cinta transparente en ambos lados. Transferir el cerebro en la gota de medio de montaje y esperar 1-2 min hasta que el cerebro se vuelve transparente. Retire con cuidado el medio de montaje con una pipeta.
    5. Para el montaje, aplique una gota fresca de medio de montaje sobre los cerebros en la diapositiva. Cuidadosamente el recubrimiento un cristal evitando burbujas. Sellar los bordes con cemento de goma y deje secar al aire a temperatura ambiente por 20 minutos proceder a la adquisición de la imagen para obtener mejores resultados.

3. adquisición de la imagen

  1. Optimizar parámetros de adquisición de microscopio, incluyendo la resolución espacial, objetivo, zoom, velocidad de escaneo y paso de tamaño, para maximizar la resolución de las estructuras de interés para facilitar la segmentación semiautomática durante el análisis de la imagen.
    Nota: Puede ser útil capturar una imagen de muestra y probar segmentación semiautomática (en el paso 5 del presente Protocolo) antes de todas las muestras experimentales de la proyección de imagen. De esta manera el usuario puede ajustar la configuración de imágenes para que herramientas analíticas pueden fácilmente discernir la estructura biológica de interés.
  2. Ajuste de controles de imagen detector para captar la más alta relación señal a ruido y rango dinámico más alto de la muestra.
    1. Utilice una LUT (mire para arriba de la mesa) que indica la saturación de píxeles (exposición demasiado alto) o undersaturation (offset demasiado baja) mientras ajustes (figura 3B, rojo indica saturación de pixel por una LUT de Hi/Low).
    2. Verificar ajustes de ganancia y offset son apropiados para todos los grupos experimentales, como las manipulaciones experimentales probablemente alteran la estructura de interés.
      Nota: Es imperativo que se utilizan los mismos ajustes para todos los grupos hacer comparaciones cuantitativas.
  3. Imagen a través del tejido para capturar todos los datos.
    Nota: Se recomienda para capturar todos los datos disponibles durante una sesión de imágenes y para definir un área más preciso durante la selección de ROI en el paso 4 si es necesario.
  4. Guarda la imagen como el tipo de archivo soportado por el software de imágenes para preservar los metadatos como parámetros de adquisición y calibración espacial. Guardar la imagen con un nombre de archivo incluyendo experimental fecha, antecedentes genéticos y Reporteros fluorescentes, anticuerpos o tintes correspondiente a canales escaneados como [nombre de Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _Ch1. [fluoróforo-blanco /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], etc.

4. Fiji/ImageJ imagen importación y selección de ROI

  1. Abra una imagen en Fiji. Utilice el cuadro de diálogo "Opciones de importación de formatos de Bio", elegir "pila vista con: Hyperstack" y "modo de Color: escala de grises".
    Nota: Se recomienda abrir el tipo de archivo de microscopio, como metadatos tales como calibración espacial puede ser leído por Fiji.
  2. Identificar un área de un solo plano z o una proyección basada en el canal de marcador que puede ser utilizado como un ROI estandarizado a través de las muestras (figura 1, selección de retorno de la inversión).
    1. Utilice la barra de desplazamiento de "C" para ver los canales que utiliza para capturar el marcador señalado en el paso 1.1.
    2. Utilice la barra de desplazamiento de "Z" para mover a través de los planos focales. Elegir una sola rebanada o crear una proyección de rebanadas múltiples haciendo clic en "imagen | Pilas | Proyecto Z"y sistema"Start slice"y"Parada de slice"para abarcar el ROI.
      Nota: Ajuste de los ''proyección tipo "a"Máxima intensidad"en el"proyecto Z"cuadro de diálogo es a menudo más adecuado para acentuar las estructuras para la segmentación en la sección 5, aunque esto puede no ser apropiado para todas las aplicaciones. Si otro tipo de proyección es necesaria para el análisis, tenga cuidado de guardar y documentar este archivo como tal para la extracción de la característica en la sección 6 o 7.
    3. Generar una nueva imagen que contiene los canales y plane(s) focal de interés para simplificar los siguientes pasos en el protocolo de análisis de imagen. Seleccione "imagen | Duplicados,"el deseado"canales"(c) y"Rodajas"(z) y cambiar el nombre del archivo para reflejar la selección (por ejemplo, [nombre del Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) el experimento.
  3. Utilice uno de las "herramientas de selección" en la barra de herramientas de Fiji para seleccionar manualmente un ROI estandarizado basado en los criterios de selección determinados en el paso 4.2.
  4. Añadir el retorno de la inversión a cargo de ROI haciendo clic en "analizar | Herramientas | ROI Manager "y haga clic en"Agregar"en el menú de ROI Manager. Guarde el ROI en el ROI Manager menú haciendo clic en "más | Guardar"y luego el nombre al archivo para reflejar el retorno de la inversión (por ejemplo, [nombre del Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _ [canales] _ [z-plane(s)] _ [Descripción de ROI]).
    Nota: Esto puede ser reabierto en Fiji para posteriores análisis o se puede aplicar a otros canales o imágenes como en la sección 5.3.

5. procesamiento y segmentación con solapas h-maxima

  1. Realizar procesamiento previo en el canal utilizado para capturar las estructuras de interés.
    1. Si el archivo de imagen consta de múltiples canales, separar los canales haciendo clic en "imagen | Color | Dividir canales"para aislar el canal de interés.
    2. Aplicar un filtro como el filtro de mediana para reducir el ruido y Desenfoque gaussiano para suavizar haciendo clic en "proceso | Filtros | Filtro tipo"(p. ej.,"Median Filter"o"Desenfoque gaussiano").
      1. Muestra diferentes filtros y filtro de parámetros en las imágenes de cada grupo experimental. Proceda al paso 6.2 con un ejemplo representativo de cada grupo para comprobar el funcionamiento de la segmentación. Seleccione el filtro y ajustes que facilitan la segmentación de las estructuras de interés.
    3. Configuración y registro del filtro. Aplicar estos parámetros a través de grupos experimentales.
    4. Guardar una copia de la imagen como un archivo tiff incluyendo el filtro aplicado para referencia. Utilice un nombre detallado como [nombre de Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _ [Channel] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parámetros].
  2. Realizar segmentación de estructuras de interés con la herramienta de cuencas h-maxima interactiva en la imagen preprocesada generado y guardado en el paso 5.1.
    1. Con la imagen preprocesada en Fiji, iniciar la herramienta de h-maxima cuenca interactivo haciendo clic en "SCF | Etiquetado | H_Watershed interactivo".
      Nota: Este plugin primero calcula la cuenca y luego le permite explorar los efectos de máximos locales y opciones de umbral en la segmentación a través de una imagen de salida actualizados al instante.
    2. Desde el panel de control, ajustar la dinámica de semilla (h), umbral de intensidad (T) y pico de inundación (%) para optimizar la segmentación.
      Nota: Consulte siempre la imagen raw antes de preprocesamiento de sección 4.2 inspeccionar manualmente el rendimiento de la segmentación de las estructuras de interés.
    3. Cuando esté satisfecho con los resultados de la segmentación, seleccione "Exportar máscara de regiones" y elegir "Exportar". Esto genera una imagen binaria de los resultados de la cuenca (figura 1, segmentación).
    4. Registrar los parámetros de segmentación; Estos parámetros deben ser aplicadas a través de grupos experimentales para comparaciones cuantitativas. Guardar la mascarilla de resultados binarios, si lo desea para la referencia con los parámetros de segmentación en el nombre como [nombre de Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _ [canales] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parámetros] _ [H_Watershed parámetros].
  3. Extracto de las estructuras de interés de los resultados de la cuenca.
    1. Abra el ROI guardado de paso 4.4, en el administrador de ROI. Con la máscara de regiones binarias de paso 5.2.4 activo, seleccione el ROI desde el administrador de ROI para aplicar a la imagen para limitar la extracción de la característica para el ROI estandarizado.
    2. Con el retorno de la inversión activa la máscara binaria cuenca, elegir "analizar | Analizar las partículas"con"Añadir al administrador"seleccionado en el cuadro de diálogo extraer características.
      Nota: Esto agregará un identificador de partícula para cada estructura delineado durante la segmentación para el ROI Manager. Opciones están disponibles en este menú excluir características basadas en el tamaño o circularidad si es necesario para refinar estructuras incluidas en el análisis.
    3. Guardar las partículas haciendo clic en "más | Guardar"en el menú de administrador de ROI. Asegúrese de que identificadores son deseleccionados y todas las partículas todo se guardará en un archivo zip. Utilice un nombre detallado como [nombre de Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _ [canales] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parámetros] _ [H_Watershed parámetros] _ [estructuras].

6. cantidad, área y cuantificación de la intensidad y el análisis

  1. Abra la imagen raw generado y guardado en el paso 4.2. Desplácese hasta el canal utilizado para la captura de las estructuras de interés.
    Nota: Es fundamental tomar medidas de intensidad de la imagen raw (antes de preprocesamiento) como aplicación de filtros en los cambios de paso 5.1 los valores de píxel.
  2. Abra las partículas obtenidas de la extracción de la característica en el paso 5.3 y seleccionar "Mostrar todo" desde el administrador de ROI.
    Nota: Esta acción superposición de un esquema de cada partícula en el "ROI Manager" en la imagen y debe coincidir con los bordes de las estructuras de interés (figura 1, la extracción de la característica).
  3. Establecer las mediciones deseadas haciendo clic en "analizar | Set de mediciones".
    Nota: El área, intensidad y densidad de las partículas pueden medirse eligiendo "área" y "densidad integrada". Cuando se selecciona densidad integrado, Fiji produce dos valores: 'Densidad integrado' calcula como el producto de la zona y valor de gris medio y 'Primas integración densidad' medido como la suma de los valores de píxeles. Densidad de la proteína fluorescente en las partículas se calcula como la suma de los valores de píxeles dividida por el área. El número de las partículas generadas en el paso 5.3 indica la cantidad de partículas dentro del tejido del que retorno de la inversión definido en el paso 4.4.
  4. En el menú de ROI Manager elija "Medida". Los resultados se expresan en unidades calibradas como las mediciones de archivos derivados en Fiji desde el software de imágenes. Copiar los resultados de la ventana de resultados y pegue en software de hoja de cálculo para la compilación y cálculos posteriores.

7. radiométrica cuantificación y análisis de datos

  1. Siga los pasos 6.1 y 6.2 para abrir identificadores de la partícula en el primer canal prima de interés.
  2. Establecer las mediciones deseadas haciendo clic en "analizar | Set de mediciones".
    Nota: La intensidad media por partícula se puede medir por elección "Significa valor de gris".
  3. Desde el ROI Manager seleccione "Medida". Copiar datos desde la ventana de resultados y pegue en software de hoja de cálculo.
  4. Mover la barra de desplazamiento de "C" para el segundo canal de la materia prima de interés, GFP en este ejemplo (Figura 4A) y repita los pasos 7.2. y 7.3.
    Nota: Las partículas que se guardó en el paso 5.3 por defecto en el canal y la rebanada de la cual se generó. Tenga cuidado para asegurar que las partículas se aplican al canal correcto de interés.
  5. Calcular el cociente de la intensidad de la segunda para cada partícula en el software de hoja de cálculo de la intensidad de un canal.
  6. Utilice un diagrama de dispersión para visualizar y cuantificar datos radiométrica de fluoróforos que exhiben cambios individuales de los procesos biológicos subyacentes.
    1. Generar un diagrama de dispersión en el software de gráfica.
      Nota: Cada punto de datos representa una estructura de interés donde la intensidad del primer fluoróforo de interés es el valor de"x" y la intensidad del segundo fluoróforo es el "valor y" medido de cada partícula.
    2. Establecer umbrales para cada fluoróforo definir los cuadrantes que bloquean.
  7. Usar Perfil de línea para visualizar fluoróforo intensidad a través de una estructura de interés.
    1. Seleccione un ROI generado en el paso 5.3 y utilice la herramienta de línea recta en la barra de herramientas para dibujar una línea recta a través del retorno de la inversión. Agregue la línea de retorno de la inversión para el ROI Manager.
    2. Para cada canal de interés, con la línea de retorno de la inversión activa, seleccione "analizar | Parcela de perfil".
      Nota: La función de Perfil de terreno va a generar una trama de histograma y una tabla de los valores de la intensidad a lo largo de la línea. Copiar resultados medidos de cada canal y pegar en el software de hoja de cálculo para generar un diagrama que muestra ambos canales a lo largo de la línea.

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Resultados

Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de etiquetado agregados Htt mutantes en el lóbulo óptico de Drosophila , número y zona

Para investigar la agregación de proteínas mal plegadas en el sistema nervioso central de un modelo de Drosophila de la enfermedad de Huntington, etiquetado RFP mutante humano Htt con expansión patológica ( o no patológico (UAS-RFP-hHttQ15) UAS-RFP-hHttQ138) y me...

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Discusión

El protocolo descrito aquí puede utilizarse para robusta y reproducible cuantificar procesos biológicos celulares visualizados por la proyección de imagen basada en fluorescencia. Contexto biológico y limitaciones técnicas necesitan ser cuidadosamente considerados para orientar el diseño experimental. Marcadores fluorescentes de estructuras subcelulares de interés, si immunohistochemical, teñir-basada, o genético expresado deben ser distinguibles sobre fondo de morfología e intensidad. El sistema de GAL4/UAS es ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado por la Sheila y David Fuente neuropático dolor investigación programa de becas de pos-grado (a J.M.B.), los Lois Pope LIFE Fellows del programa (y C.L., Y.Z., J.M.B.), la Beca Predoctoral de la Fundación Robinson Snyder (a C.L.), el Dr. John T . Macdonald Fundación (C.L.), contratos, subvenciones de los institutos nacionales de salud (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 y R56NS095893 (a R.G.Z.) y proyecto de erudito de Taishan (provincia de Shandong, República Popular de China) (a R.G.Z.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
SYLGARD(R) 184 Kit de elastómero de siliconaDow Corning CorporationPF184250Plato de disección
Falcon 35 mm sin tratamiento TC Estilo de fácil agarre Placa de Petri bacteriológicaCorning351008Plato de disección
Dumont #5 Pinzas Dumont #5Fine Science Tools11251-20Herramienta de disección
Cloruro de sodioSigmaS3014Solución
PBSFosfato de sodio Dibásico SigmaS5136Solución PBS
Fosfato de potasio MonobásicoSigmaP5655Solución PBS
Triton  X-100SigmaT9284Solución de lavado e incubación de anticuerpos.
Formaldehído al 37%VWR10790-710
Tubos de microcentrífuga desechables de fijación (0,5 ml, azul)VWR89000-022Fijación, lavado e incubación de anticuerpos.
Micro portaobjetos lisos y esmerilados (25 veces; 75mm)VWR48312-004Portaobjetos para imagen confocal
Micro Cover Glasses, rectangulares (22 veces; 40mm)VWR48393-172Portaobjetos para imágenes confocales
Caucho CementoSlime1051-AMontaje
VECTASHIELD Antifade MontajeVector Laboratories, Inc.H-1000Montaje
Scotch Magic 810 Cinta Invisible (19mm× 25.4m)3M Company810Montaje
suero de cabra normalThermo Fisher ScientificPCN5000 incubadora
de anticuerpos DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato) Thermo Fisher ScientificD1306Tinción de ácidos nucleicos. Disolver en agua desionizada para hacer una solución madre de 5 mg/mL y almacenar a -80 °C. Diluir hasta una concentración de trabajo de 10 a 20 °C; g/mL en PBTx.
Microscopio industrial de inspección con zoom estéreo 3.5X-90X AmScopeSM-1BNZVisor de disección. Equipado con 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ / FijiNIHv1.51uCon SCF_MPI_CBG complementos (versión 1.1.2)
FV1000-IX81 Microscopio de escaneo láser confocalOlympus
Recombinant ConstructBloomington Drosophila Stock CenterBL37749
Medio de

Referencias

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