Summary
Indarbejde en cyclopropene derivat af lysin i antistoffer tillader den lokationsspecifikke, hurtige og effektiv kobling af tetrazine-bærende molekyler til at generere antistof-drug konjugater.
Abstract
Antistof-drug konjugater (ADCs) anvendes i dag i klinisk praksis er blandinger af antistof molekyler knyttet til et varierende antal toksiner på forskellige positioner. Prækliniske undersøgelser har vist, at det terapeutiske indeks af disse traditionelle ADCs kan forbedres ved en lokationsspecifik sammenkædning af toksiner. Nuværende metoder til at producere homogene ADCs har dog flere begrænsninger, såsom lavt proteinindhold udtryk og langsom reaktion kinetik. I denne protokol beskriver vi, hvordan du opretter et udtryk til at medtage en cyclopropene derivat af lysin (CypK) i antistoffer ved hjælp af genetiske kode ekspansion. Denne minimale bioorthogonal håndtag giver mulighed for hurtig konjugering af tetrazine derivater gennem en invers-demand Diels-elletræ cycloaddition. Udtrykket systemet her rapporteret muliggør facile produktion og rensning af trastuzumab forsynet med CypK i hver af de tunge kæder. Vi forklare, hvordan at linke antistoffet til toksin mellem auristatin E og karakterisere immunoconjugate af hydrofobe interaktion kromatografi og massespektrometri. Endelig vil beskrive vi assays til at vurdere stabiliteten i humant serum af dihydropyridazine koblingen som følge af konjugering og teste den selektive cytotoksicitet af ADC for brystkræftceller med høje niveauer af HER2-receptoren.
Introduction
Antistof-drug konjugater (ADCs) kombinere af biotherapeutics selektivitet og styrken af små cytotoksiske molekyler. De fleste ADCs har til formål at mindske bivirkninger af traditionel kemoterapi ved at målrette medicin, der påvirker DNA eller mikrotubulus polymerisering til kræft celler1. Første generations ADCs godkendt af Food and Drug Administration (FDA) stole om ændring af lysines og cysteines, som genererer blandinger af molekyler ændret på forskellige positioner med nedsat farmakokinetiske egenskaber2. Derimod kan lokationsspecifikke konjugation af narkotika til antistofferne generere forbindelser med forbedret terapeutiske indeces3,4. Søger at løse producerer homogene ADCs, har flere selektive kemiske og enzymatiske ændringer været rapporteret1,5. Men nuværende metoder kan målrette kun bestemte holdning på antistoffet, lider af lavt proteinindhold udtryk, giver linkers med lav stabilitet, eller stole på langsomme og lav-eftergivende reaktioner.
Inddragelsen af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAA) gennem genetiske kode udvidelse muliggør lokationsspecifikke installation af en overflod af bioorthogonal reaktive grupper i proteiner, potentielt at overvinde begrænsningerne af andre metoder, der anvendes til at generere ADCs. Kodning ncAAs svar på en target (stop) codon er afhængig af aminoacyl-tRNA syntetase/tRNA-par, der er ortogonale i forhold til de endogene par, at indarbejde kanoniske aminosyrer6. Flere ncAAs er blevet indarbejdet i antistoffer til at generere ADCs. Dog mest lider forskellige forpligtelser for applikationer i terapeutiske drug konjugering. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 er ikke fuldt ud bioorthogonal, kræver lav pH (4,5) og lang reaktionstid (> 60 h), mens azider såsom p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11og en indeholder derivat af lysin (AzK)12,13 kan nedsættes i celle14, og kobber bruges til at katalysere Huisgen cycloadditioner kan fremkalde oxidative skader 15.
Selv om alternative ncAAs baseret på trans-cyclooctene (TCO), cyclooctyne (SCO) og bicyclo [6.1.0] none (BCN) har for nylig blevet kodet i et antistof til bio-imaging formål, udtryk system lider meget lave udbytter (0,5 mg/L)16. Desuden cyclooctenes og cyclooctynes er store og hydrofobe håndtag, der kan øge modtagelighed af ADC for sammenlægning -ADC nyttelast er traditionelt hydrofobe og de fysisk-kemiske egenskaber af linker har vist for stærkt virkningen farmakokinetik og terapeutisk indeks17. 1,3-disubstitued cyclopropenes er derimod lille reaktive grupper, der burde aktivere minimal ændring i protein struktur og physichochemical egenskaber18. Cyclopropenes reagere selektivt og hurtigt med tetrazines via en invers elektron-demand Diels-elletræ cycloaddition19. I denne protokol gør vi brug af et derivat af lysin (CypK, figur 1b) forsynet med en methyl-cyclopropene, der er mindre påvirket af sterisk hindring end større anstrengt umættede cyklusser og har en reaktion konstant i størrelsesordenen 1-30 M-1s -1 i vandige medier18,20.
Vi har for nylig rapporteret hvordan at indarbejde antistoffer til at generere ADCs ved at reagere denne minimale bioorthogonal håndtag med tetrazine-bærende molekyler21CypK. Her beskriver vi ADC forberedelse procedure mere detaljeret med vægt på de mest udfordrende skridt. Indarbejdelse af CypK er rettet ved hjælp af en pyrrolysyl-tRNA syntetase (PylRS) / tRNACUA(PylT) pair som svar på en rav codon indført i antistof tunge kæde (HC)22. Her bruger vi to plasmider for forbigående Transfektion (figur 1a), en kodning den tunge kæde af antistoffet og andre et kodning lys kæden (LC), begge indeholdende PylRS/PylT-kassette. Alternativt kan en stabil cellelinie, der giver mulighed for højere antistof udbytter genereres gennem en mere omstændelig procedure21.
De ovennævnte udtryk systemer kan producere terapeutiske anti-HER2 immunoglobulin 1 (IgG1) trastuzumab med CypK på nogenlunde samme niveau til det vilde type antistof. Vi valgte den første position af domænet CH1 på den tunge kæde at indkode ncAA (HC-118TAG). Dette er den mest almindeligt modificerede site i ADCs23 og er kendt som HC-118 (EU nummerering) men er også blevet refereret til som HC-121 (sekvens holdning) og HC-114 (Kabat nummerering)24. Da denne stilling er bevaret gennem alle IgG1s, bør disse udtryk systemer være genstand for mest terapeutisk antistoffer.
Vi viser trastuzumab(CypK)2 kan nemt renses af protein en efterfulgt af hurtig protein væskekromatografi med en hydrofob vekselvirkning kolonne (FPLC-HIC). Efterfølgende er antistoffet kovalent knyttet inden for 3 h til mikrotubulus polymerisering hæmmer mellem auristatin E (MMAE), som bruges i FDA-godkendt ADC Adcetris. Her bruger vi en benzyl-tetrazine afledning af MMAE (tetrazine-vcMMAE) med en linker bestående af en glutarate spacer og en valin-citrullin protease-labil komponent efterfulgt af en p- aminobenzylalcohol self-immolative enhed; denne linker er kløvet af Cathepsin B i lysosomet ved internalisering af ADC resulterer i traceless udgivelsen af toksin25. For at vise den brede anvendelsesområde reaktion, antistoffet er også knyttet til fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA). Vi forklare, hvordan til at bekræfte identiteten af konjugationen af væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) og til at beregne stof til antistof-ratio (DAR) ved hjælp af højtryksvæskekromatografi med en hydrofob vekselvirkning kolonne (HPLC-HIC) .
Som en del af karakterisering af antistof ydeevne beskriver vi, hvordan at teste stabilitet af dihydropyridazine kobling i humant serum. Denne parameter er lettere vurderet i trastuzumab-TAMRA, fordi det kan kvantificeres ved hjælp af en simpel ELISA og fortolkningen af resultaterne er ikke kompliceret af protease labile komponent i trastuzumab(MMAE)2. Endelig vurderes selektivitet og styrken af trastuzumab(MMAE)2 ved at sammenligne ADC cytoxicity på tværs af cellelinjer udtrykke forskellige niveauer af HER2. Denne analyse giver også en funktionel bevis af ADC stabilitet når udført efter inkubation immunoconjugate i humant serum.
Protocol
1. producere og karakterisere antistoffet
- Udtrykke antistoffet
- Optø et hætteglas af HEK suspension celler i en 250 mL målekolbe indeholdende 50 mL udtryk medium suppleret med 100 enheder/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 250 ng/mL amphotericin B. hold celler ved 37 ° C med 8% CO2 i fugtet væksthuse udstyret med en shaker på 125 rpm. Opdel celler til 0,3-0,5 x 106 celler/mL (hver 2-3 dage) mindst 2 gange inden transfecting.
- Når en massefylde på 2,5 x 106 celler/mL er nået (2-3 dage efter opdeling), forberede en frisk løsning på 100 mM CypK. Til dette formål, 64 mg af CypK afvejes, tilsættes 2,5 mL af 0,1 natriumhydroxid, vortex, spin ned at inddrive alle uopløst partikler og Læg instrumenterne i ultralydsbad.
- Tilsættes 2,5 mL af CypK (100 mM i 0,1 M NaOH) 42,5 mL udtryk medium suppleret med antibiotika. Bland godt, tilsæt 250 µL af 0,1 M HCl og sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm filter.
- Fortyndet 50 µg HC og LC pKym1 plasmider21 2,5 mL med nedsat serum medium. I en separat rør, fortyndes 135 µL Transfektion reagens til 2,5 mL med nedsat serum medium.
- Fem minutter efter at forberede løsninger, bland plasmider og Transfektion reagens løsning og Ruger i 20 min. så dannelsen af komplekser mellem DNA og Transfektion reagens.
- I mellemtiden, centrifugeres 125 millioner celler på target tæthed i 5 min på 500 x g, resuspend med udtryk medium indeholdende CypK og tilføje DNA – Transfektion reagens blanding. CypK kan købes eller syntetiseret som rapporteret tidligere18.
- Efter inkubation celler for 20 h, tilføje 250 µL af Transfektion reagens smagsforstærkere inkluderet i sættet.
- Høste antistoffer fra supernatanten 6-7 dage efter tilsætning af CypK (ingen ændring af mediet er påkrævet under udtryk).
* Alternativt, for at opnå højere og mere ensartet udbytte, en stabil cellelinie kan genereres som beskrevet i Oller-Salvia et al. 201821. I dette tilfælde udtrykkes trastuzumab(CypK)2 blot ved tilsætning af CypK 5 mM på mellemlang og udtryk.
- Rense antistoffet
- Der centrifugeres celler for 15 min på 3000 x g.
- Filtrer supernatanten med en 0,45 eller et 0,22 µm filter. Hvis filteret bliver tilstoppet, erstatte det for en ny og fortsætte filtrering. Hvis dette sker efter kun et par milliliter, centrifugeres supernatanten for en yderligere 15 min. ved 7000 x g.
- Tilføje protein A harpiks (2 mL/100 mL af supernatanten) i en tom polypropylen kromatografi kolonne og reagensglasset harpiks med mindst 5 bind af perle vaskebuffer (0,1 M natrium fosfat, 150 mM NaCl).
- Opdele supernatanten i to 50 mL koniske rør og tilføje 5 x perle vaskebuffer (0,5 M natrium fosfat, 150 mM NaCl) efterfulgt af pre afbalancerede protein A harpiks. Konisk røret anbringes på en valse i 3 timer ved stuetemperatur til at trække ned antistof i supernatanten.
Alternativt: Tilføje supernatanten på kolonnen med mindst det dobbelte den anbefalede mængde af resin og tillader gennemstrømning. Sørg for der ikke er en betydelig mængde antistof tilbage i supernatanten af SDS-PAGE. Hvis der er, elueres supernatanten gennem harpiks igen. - Overføre protein A harpiks med supernatanten i en kolonne og tillade væske til at flyde gennem.
- Tilsættes 25 mL af wash buffer (eller mindst 10 harpiks diskenheder) og gennemstrømning.
- Elueres antistof med 4 mL af 0,1 M natriumcitrat, pH 3, 1 ml 1 M fosfat buffer, 150 mM NaCl.
- Fortynd antistof med 10 mL PBS, koncentrat til 0,5-1 mL af centrifugal filtrering og exchange buffer tre gange med PBS.
- Rense prøver af FPLC ved hjælp af en butyl HIC kolonne med et flow af 0,5 mL/min og en 0-100% gradient i 30 min lav-salt buffer (50 mM natriumfosfat pH 7,0, 20% isopropanol) i høj-salt buffer (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM natriumfosfat pH 7,0 5% isopropanol). Indsamle alle fraktioner og overvåge eluering på 280 nm. Små mængder (< 1 mg) kan renses med HPLC-HIC på betingelser, der er beskrevet i punkt 2.4 til at maksimere udbyttet og renhed.
- Samle de fraktioner, der indeholder antistof, fortyndes dem til mindst 4 mL med PBS, koncentrere dem af centrifugal filtrering og exchange buffer tre gange med PBS.
- Kvantificere antistoffet
- Opnå en omtrentlige koncentration ved måling af absorbans ved 280 nm med en mikro-volumen Spektrofotometer.
- Hvis der kræves en nøjagtig måling, skal du bruge en ELISA kit til at måle menneskers IgGs. For et groft skøn, bruge SDS-PAGE med en Coomassie-baserede plet som følger:
- Udarbejde standarder ved at fortynde seks gange to-fold en trastuzumab standard kvantificeres ved ELISA på 1 mg/mL.
- Kog standarderne og prøver på ca. 0,25 mg/mL i at reducere loading bufferen.
- Køre dem i en 4-12% Bis-Tris SDS-side ved hjælp af MES-SDS buffer og pletten med en Coomassie-baserede farvestof. Endelig måle farve tæthed af bandet svarende til lys eller tunge kæden bruger ImageJ og interpolere signalet fra prøverne i standardkurven.
- Butik antistof ved 4 ° C.
2. konjugat antistoffet og karakterisere ADC
- Konjugerede antistoffer med tetrazine-bærende molekyle
- Fortyndet 10 kindtand ækvivalenter af tetrazine-vcMMAE (4 µL, 3,4 mM i dimethylsulfoxid (DMSO)) med 20 µL af acetonitril og 76 µL af PBS i en lille koniske rør (fxPCR rør).
- Tilføj 1 molar svarer til trastuzumab(CypK)2 (100 µL, 2 mg/mL i PBS), blandes grundigt, og giver mulighed for at reagere i 3 timer ved stuetemperatur (25 ° C) til at danne trastuzumab(MMAE)2.
Bemærk: Andre molekyler såsom tetrazine-5-TAMRA kan knyttes til antistof i stedet for tetrazine-vcMMAE ved hjælp af denne protokol.
- Rense ADC
- Pre reagensglasset en størrelse udstødelse spin kolonne med PBS efter fabrikantens anvisninger.
- Tilføje hele mængden af reaktionen på spin kolonnen og centrifugeres ved 1500 x g i 1 min.
- Kvantificere ADC og analysere konjugat af SDS-PAGE
- Kvantificere ADC, som beskrevet i 1.3.2. ved at måle den farve tæthed af den lette kæde på en SDS-PAGE ved hjælp af den ikke-modificerede antistof til standardkurven.
- Den tunge kæde bør har flyttet lidt viser en stigning i molekylvægt på konjugering.
Bemærk: Hvis antistoffet er modificeret med en fluorophore som i trastuzumab(TAMRA)2, kun bandet svarende til den tunge kæde skal vise i-gel fluorescens før farvning.
- Analysere konjugat af HPLC-HIC
- Blandingen henstår kolonnen HPLC-HIC med 100% buffer A (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM natriumfosfat pH 7,0, 5% isopropanol) i 5 min.
- Mix 15 µL (67 pmol) i en 1 mg/mL opløsning af trastuzumab (CypK) 2 med 15 µL af 2 x buffer A i et hætteglas. Så program en 10 µL injektion i HPLC.
- Elueres i en isocratic 1 mL/min. flow med 100% buffer A for 1 min efterfulgt af en 15 min gradient fra 100 til 0% af buffer A i B (50 mM natriumfosfat pH 7,0, 20% isopropanol). Overvåge eluering på 280 nm.
- Beregne DAR ved at integrere peak svarende til hver art og ved hjælp af de resulterende områder i følgende ligning:
DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
Forventede retentionstiden for trastuzumab(CypK)2 er 7.5-8.0 min, for trastuzumab (CypK, MMAE) er 9.1-9.6 min, og for trastuzumab(MMAE)2 er 10,5-11,0 min.
- Analysere konjugat af LC-MS
- Deglycosylate 30 µL af 1 mg/mL ADC og de uændrede antistof i ikke-reducerende forhold ved hjælp af 250 PNGase F enheder i mindst 6 timer ved 37 ° C.
- Elueres antistof i massespektrometer i en C4 1-5 µm 1,0 x 100 mm kolonne ved hjælp af en 20 min forløb af 2-80% acetonitril i vand. Erhverve data over en m/z række 350-4000 i positiv ion mode med en kegle spænding på 150v.
- Deconvolute de rå data ved hjælp af passende software. Beregne forskellen i massen mellem den modificerede og umodificeret antistoffer.
3. assay stabilitet af Dihydropyridazine kobling i Trastuzumab(TAMRA)2 i Serum
- Filtrer serum ved hjælp af et 0,22 μm filter under sterile forhold. Du kan tilføje 100 enheder/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin.
- Fyld de eksterne wells af en 96-brønd plade med vand. I de centrale wells, blandes i tredobbelt 90 µL af filtrerede serum med 10 µL af 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 i PBS i en endelig koncentration på 0,1 mg/mL. Pladen anbringes i en inkubator, mættet med fugtighed på 37 ° C og 4-5% CO2.
- Hver 24 h i hele 5 dage, afpipetteres hver godt grundigt at blande, tage en 5 µL alikvot, flash-freeze med flydende kvælstof, og opbevares ved-80 ° C.
- Når alle prøver er blevet indsamlet, optø delprøver og analysere ved hjælp af en indirekte ELISA som tidligere rapporteret12 med visse ændringer:
- Coat en 96-brønd plade natten med 0,25 µg/mL HER2 ved 4 ° C. Alle andre trin udføres ved stuetemperatur.
- Den følgende dag, skylles 5 gange med PBS 0,05% tween (PBS-T) og blokere med 1% bovint serumalbumin for 1 h.
- Vask og inkuberes prøver på 1: 10000 fortynding i PBS for 2 h.
- Vask og inkuberes en anti-TAMRA antistof rejst i musen på 1: 2000 fortynding i PBS-T med 0,5% BSA i 1 time.
- Vask og inkuberes en anti-mus HRP konjugerede 1:1000 i PBS-T med 0,5% BSA i 1 time.
- Tilføje TMB og giver mulighed for at reagere 5-10 min.
- Stop reaktion med 50 µL H2så4 1 M og foranstaltning absorbans ved 450 nm. Subtrahere baggrund målt ved 570 nm.
- Passer til en 4-parameter logistisk regression kurve til standard koncentrationer og interpolere målinger fra prøver.
Bemærk: Stabiliteten af trastuzumab(MMAE)2 kunne blive vurderet ved hjælp af den samme protokol ved at ændre analysen beskrevet i 3.3 for en kommerciel ELISA kit til at måle koncentrationen af ADC.
4. vurdere cytotoksicitet af ADC
Bemærk: Denne protokol er baseret på tidligere rapporteret assays23,26 med nogle ændringer.
- Tø SK-BR-3 og MCF-7 celler og tillade dem at bosætte sig i p25 kolber indeholdende komplet medium, dvs DMEM suppleret med 10% varme inaktiveret føtal bovint serum, 100 enheder/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin.
- Opdel celler på 80-90% confluence (hver 3-4 dage) mindst 2 gange før analysen.
- To dage før analysen, udfylde de ydre wells af en 96-brønd plade med vand. Derefter elevator celler med 0,05% trypsin i 0,5 mM EDTA, centrifuge 3 min. ved 250 x g, resuspend i nyt medie og frø 3000 celler i 100 µL pr. (tom) godt i 96-brønd plader.
- To dage efter såning celler, forberede 10 serielle fortyndinger af alle prøver i tre eksemplarer med 0,1% DMSO i komplet medium. Overvej følgende prøver og kontroller: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab vildtype, tetrazine-vcMMAE og MMAE.
- Tilføj 100 µL af hver prøve i hver brønd og Inkuber i 5 dage ved 37 ° C og 4-5% CO2.
- På dag 5, måling af cellers levedygtighed. Med henblik herpå, skal du bruge en kommerciel kit til lyse celler og måle ATP frigives. Afbilde procentdelen af signal med hensyn til kontrol celler behandles med 0,1% DMSO.
Bemærk: ADCs kan inkuberes i 5 dage i serum og analyseres for cytotoksicitet at bevise funktionelle stabilitet.
Forsigtig: MMAE er meget giftigt. Derfor bruge handsker og beskyttelsesbriller, når du håndterer MMAE derivater. Hvis du bruger umodificeret MMAE som en kontrol i dit eksperiment, når du forbereder stamopløsning i DMSO, håndtere den solide vare inde i et stinkskab.
Representative Results
De rapporterede forbigående ekspressionssystem (figur 1a) udbytter 22 ± 2 mg af trastuzumab(CypK)2 pr. liter af dyrkningsmediet, som udgør 2/3 af den vilde type antistof produceret under de samme betingelser (figur 1 c). Den stabile cellelinie kan øge dette udbytte op til 31 ± 2 mg/L21.
Trastuzumab(CypK)2 kan være konjugeret med tetrazine-vcMMAE, som udbytter kvasi homogene trastuzumab(MMAE)2 inden for 3 timer ved 25 ° C (figur 2). Den høje hydrophobicity af denne cytotoxin kræver tilsætning af 10% acetonitril når 5 eller flere kindtand ækvivalenter af toksin pr. CypK bruges. Alternativt, cycloaddition er også afsluttet senest 20 h ved hjælp af 2 ækvivalenter af tetrazine-vcMMAE uden acetonitril (figur 2 c). Trastuzumab(CypK)2 reagerer med tetrazine-TAMRA inden for 2 timer ved 25 ° C og 3-6 h er påkrævet, når temperaturen er faldet til 4 ° C (figur 3 c).
Den forventede DAR for trastuzumab(MMAE)2 målt ved HPLC-HIC er 1,9 (figur 2b). Peak i første omgang observeret i kromatogrammet på 8,0 min repræsenterer den ukonjugeret antistof (DAR 0) og bør være helt forsvundet når reaktionen er afsluttet. Arter med DAR 1 eluerer 9.1-9.6 min. og skulle have en området < 10% efter 3 h; og target produkt med DAR 2 har en retentionstid for 10,5-11,0 med en forventet område > 90%. Mobilitet Skift og fluorescens i SDS-PAGE geler bekræfter indarbejdelse af TAMRA (figur 3b) og identiteten af immunoconjugates er kontrolleret af LC-MS (figur 2d-e og figur 3d).
Inkubation af trastuzumab(TAMRA)2 i 5 dage i humant serum og efterfølgende analyse af ELISA bekræfter, at nyttelasten forbliver fastgjort til antistoffet (figur 4b). Hvad angår cytotoksicitet assay, trastuzumab(MMAE)2 viser høj potens i SK-BR-3 (HER2 høj) bryst kræftceller, med en halv maksimal effektiv koncentration (EF50) af 55 ± 10 pM (figur 4 d). Trastuzumab(MMAE)2 fastholder cytotoksicitet efter 5 dages inkubation i humant serum (fig. 4 c). Omvendt, når ADC er analyseret på MCF-7 (HER2 lav) EF50 er 200-fold lavere (figur 4 d). Vildtype antistof, trastuzumab(CypK)2 og tetrazine-vcMMAE viser ekstremt lav toksicitet (tal 4 d og 4e), hvorimod MMAE viser høj non-selektive cytotoksicitet i begge cellelinjer (figur 4e).
Figur 1: forbigående ekspressionssystem. A. relevante regioner af plasmider bruges til forbigående Transfektion i HEK293 celler. CMV: cytomegalovirus promotor, WPRE: Woodchuck Hepatitis Virus posttranskriptionelle regulerende Element, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: specifikke promotor, PylRS: pyrrolysil tRNA syntetase, > og <: retning af transskription. B. Nielsenε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. udtryk udbytter af vildtype (WT) trastuzumab og trastuzumab(CypK)2 målt i en vestlig duppes efter protein en rensning. Fejllinjer udgør standardafvigelsen af biologiske tre. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Oller-Salvia et al. 201821. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Konjugering af trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-vcMMAE. A. Inverse elektron-demand Diels-elletræ cycloaddition mellem CypK resten i antistoffet og tetrazine afledning af MMAE. De krydsreagerende grupper er fremhævet med rødt, p- aminobenzylalcohol er afbildet i grøn og valin-citrullin dipeptid i blå. B. HPLC-HIC kromatogrammer viser forløbet af konjugation af antistof. C. graden af konvertering med hensyn til den maksimale DAR 1,9 ved hjælp af forskellige reagens koncentrationer. D-E. Deconvoluted massespektre af fuld-længde-antistof, før og efter konjugering. Trastuzumab(CypK)2 blev opnået ved hjælp af den stabile cellelinie. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Oller-Salvia et al. 201821. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Konjugering af trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-TAMRA. A. Inverse elektron-demand Diels-elletræ cycloaddition mellem CypK resten i antistoffet og tetrazine afledning af TAMRA. B. SDS-PAGE geler viser mobilitet Skift og i-gel fluorescens opstod ved konjugering af TAMRA. C. konjugation kinetik ved to forskellige temperaturer. D. Deconvoluted masse spektrum af trastuzumab(TAMRA)2. Trastuzumab(CypK)2 blev opnået ved hjælp af den stabile cellelinie. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Oller-Salvia et al. 201821. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: stabilitet i serum og cytotoksicitet af trastuzumab konjugater. A. tegneserie fremhæver de funktioner, der ønskes i en internalizing ADC. B. stabilitet af trastuzumab(TAMRA)2 i humant serum målt i ELISA. C. celle levedygtighed assay med trastuzumab(MMAE)2 efter 5 dage i humant serum (+ serum, sort). En kontrolprøve inkuberes i PBS i stedet for serum (-serum, rød) blev inkluderet i den samme analyse. D. celle levedygtighed assay med frisk fortyndet antistof prøver. E. celle levedygtighed assay med frisk fortyndet MMAE derivater. Fejllinjer udgør standardafvigelsen på middelværdien af 3 uafhængige forsøg. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Oller-Salvia et al. 201821. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
At producere trastuzumab(CypK)2 i denne protokol beskrevne forbigående udtryk procedure er enkel og giver mulighed for høj modularitet. De udbytter, der er opnået inden for dem, der forventes i en akademisk indstilling27 og stabil cellelinjer kan genereres for at yderligere øge produktionen udbytte21. Under udtryk lavere koncentrationer af CypK end 5 mM kan resultere i lavere ncAA inkorporering, og større mængder kan påvirke cellevækst og mindske antistof udbytter. CypK som en gratis aminosyre har lav vandopløselighed, således det skal først opløst på 100 mM i 0,1 M NaOH og derefter tilføjes til næringssubstratet. Efter fortynding CypK på mellemlang og før du føjer det til celler, er det kritisk at neutralisere medium med HCl og filter til at sterilisere. Efterfølgende, ved hjælp af Transfektion reagenser angivet i denne protokol og efter de af fabrikanten anbefalede inkuberingstider er vigtigt for en højtydende udtryk. Yderligere oplysninger om forbigående udtryk for humane antistoffer henvises læseren til andre publicerede protokoller31,32.
Når antistoffet er renset, der en høj overskud af protein A harpiks kræves angivet for at sikre fuld antistof pull ned fra supernatanten. For at undgå udfældning af trastuzumab under eluering, er det anbefalelsesværdigt at bruge en løsning med høj buffer kapacitet, fortyndes straks med PBS og udveksle bufferen at undgå overdreven koncentration. Altid holde antistoffet < 5 mg/mL.
Konjugering af trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-vcMMAE er hurtigere end de fleste reaktioner rapporteret med andre bioorthogonal håndtag til ADCs. Desuden, denne cycladdition opstår meget milde betingelser: stuetemperatur eller lavere og fysiologisk pH. Det er vigtigt at fortynde DMSO stamopløsninger af reaktanter med acetonitril før tilsætning af PBS og antistof; ellers vil tetrazine derivater bundfald. Acetonitril kræves kun på grund af den høje hydrophobicity af MMAE og TAMRA, men mindre hydrofobe molekyler muligvis ikke tilføjelsen af en co opløsningsmiddel. Alternativt, tetrazine-vcMMAE kan være konjugeret uden acetonitril og kun 2 kindtand ækvivalenter af tetrazine-vcMMAE i 20 h. Dette lille beløb af toksin medføre et betydeligt fald i produktionsomkostningerne for ADC sammenlignet med nuværende ncAA-baserede teknologier. Trastuzumab(CypK)2 er fuldt reaktiv i mindst 4 måneder når bevaret ved 4 ° C.
HPLC-HIC muliggør en nøjagtig bestemmelse af DAR, da MMAE er meget hydrofobe og giver en fremragende opløsning af toppene svarende til antistof konjugater med 0, 1 og 2 toksiner. Ureageret tetrazine-vcMMAE eluerer omkring 13,7 min og er registreret på 280 nm. Denne teknik kræver en råvare med høj renhed. Derudover er det ikke anbefalelsesværdigt at slukke reaktion med andre tetrazine-reaktiv molekyler såsom BCN-OH, da de kan ændre retentionstiderne og formen af toppene. Det er vigtigt at saltkoncentration af prøverne matcher den ene i den mobile fase i starten af forløbet for at opnå en god adskillelse, især hvis mere end 10-20 µL injiceres.
LC-MS analyse er deglycosylation af antistof prøver forpligtet til at opnå en enkelt peak ved deconvolution af rå spektret. Nøjagtigheden af de samlede antistof og ADC masserne kan variere afhængigt af callibration af instrumentet. Derfor, for at beregne massen for ændringen, subtrahere massen opnået for de umodificerede antistoffer fra den opnåede ADC. Moderne høj opløsning massespektrometre bør give en relativ fejl under 1: 10000. Selv om LC-MS kan også bruges til at beregne forholdet mellem de forskellige arter, er denne værdi normalt en overvurdering fordi ændringen kan påvirke ionisering kapaciteten af de arter, der er genereret og lavt beløb af urenheder kan ikke påvises.
Stabiliteten i linker i ADCs er kritisk, fordi den for tidlig frigivelse af narkotika resulterer i højere toksicitet og lavere effektivitet; den gratis cytotoxin skader sunde væv og de nøgne antistof konkurrerer med den væbnede for bindende målwebsteder på syge celler. En udgivelse under 5%, som er inden for variabiliteten af stabilitet analysen, bør forventes.
Endelig en ADC målretning HER2 som trastuzumab(MMAE)2 kan vurderes ved at sammenligne cytotoksicitet i SK-BR-3 celler (HER2 høj) og MCF-7 celler (HER2 lav) siden den sidstnævnte express 15-fold mindre HER2-receptorer end tidligere28 selektivitet . Immunoconjugate forventes at resultere i en celle levedygtighed mindst 2 størrelsesordener lavere i SK-BR-3 i forhold til MCF-7. EF50 i SK-BR-3 bør være i tocifrede nanomolar intervallet afspejler den høj potens af denne ADC29,30. Den umodificerede antistof, enten trastuzumab(MMAE)2 eller trastuzumab, skal vise nogen toksicitet i denne analyse. Tetrazine-vcMMAE skal have en virkning 3 størrelsesordener lavere end ADC, da linker fjerner aktivitet af peptidomimetic toksin. Omvendt, fordi MMAE er i stand til at præge cellemembranen30, bør det har en lignende toksicitet for ADC men viser ingen forskelsbehandling mellem HER2 høj og HER2 lav cellelinjer. Desuden, hvis denne analyse er udført efter en 5-dages inkubation af ADC i serum, det kan bruges til at give en funktionel bevis for stabiliteten i linker: en frigørelse af toksin ville resultere i enten en nedgang i ADC effektivitet i SK-BR-3, hvis MMAE blev udgivet sammen med p kunst af linker eller et fald i selektivitet hvis linker blev kløvet i en traceless mode.
ADC-teknologi beskrevet heri giver mulighed for effektiv og lokationsspecifikke inkorporering af en cyclopropene derivat af lysin i IgG1s. Efter en letkøbt rensning, antistoffer kan hurtigt konjugeret med tetrazine-holdige molekyler, fremstilling af homogene produkter. På grund af den lille størrelse og høje reaktivitet af cyclopropene minimal håndtag, bør denne metode aktiverer konjugering af sterically hindres nyttelast. De resulterende immunoconjugates er stabil i serum og yderst potent og selektiv. Samlet set muliggør CypK en hurtig, lokationsspecifikke og stabil bioorthogonal kobling til antistof og andre protein konjugater skal bruges i terapi eller diagnose.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den medicinske Forskningsråd, UK. BO-S. holder en EMBO fellowship (ATLF 158-2016) og er taknemmelig H. Pelham og JW hage for støtte, og G. Kym, C. W. Morgan og O. Perisic for hjælp og rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
| Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
| 125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
| Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
| Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
| Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
| Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
| Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
| Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
| ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
| HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
| Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
| Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
| Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | - | Costum synthesized |
| Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
| UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
| Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
| PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
| NanoAcquity | Waters | ||
| C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
| 96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
| Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
| CO2 incubator | Panasonic | ||
| HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
| Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
| Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| TMB | BioLengend | 421101 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
| PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
| SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
| Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
| Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
| MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
| Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
| Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
| Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |
References
- Beck, A., Goetsch, L., Dumontet, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (5), 315-337 (2017).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Stan, A. C., Radu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T. -D. Antineoplastic Efficacy of Doxorubicin Enzymatically Assembled on Galactose Residues of a Monoclonal Antibody Specific for the Carcinoembryonic Antigen. Cancer Research. 59 (1), 115-121 (1999).
- Hamblett, K. J., et al. Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate. Clinical Cancer Research. 10 (20), 7063-7070 (2004).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy. Angewandte Chemie International Edition. 53 (15), 3796-3827 (2014).
- Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code. Nature. 550 (7674), 53-60 (2017).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Unnatural Amino Acids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody Conjugates with Unnatural Amino Acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Tian, F., et al. A General Approach to Site-Specific Antibody Drug Conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 1766-1771 (2014).
- Kern, J. C., et al. Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates. Journal of the American Chemical Society. 138 (4), 1430-1445 (2016).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural Amino Acids in a Cell-Free Expression System. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- VanBrunt, M. P., et al. Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 26 (11), 2249-2260 (2015).
- Xiao, H., et al. Genetic Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells. Angewandte Chemie International Edition. 52 (52), 14080-14083 (2013).
- Milles, S., et al. Click Strategies for Single-Molecule Protein Fluorescence. Journal of the American Chemical Society. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Lallana, E., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide-Alkyne Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 50 (38), 8794-8804 (2011).
- Koehler, C., et al. Genetic Code Expansion for Multiprotein Complex Engineering. Nature Methods. 13 (12), 997-1000 (2016).
- Lyon, R. P., et al. Reducing Hydrophobicity of Homogeneous Antibody-Drug Conjugates Improves Pharmacokinetics and Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 33 (7), 733-735 (2015).
- Elliott, T. S., et al. Proteome Labeling and Protein Identification in Specific Tissues and at Specific Developmental Stages in an Animal. Nature Biotechnology. 32, 465-472 (2014).
- Ravasco, J. M. J. M., Monteiro, C. M., Trindade, A. F. Cyclopropenes: A New Tool for the Study of Biological Systems. Organic Chemistry Frontiers. 4 (6), 1167-1198 (2017).
- Yang, J., Šečkutė, J., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 124 (30), 7594-7597 (2012).
- Oller-Salvia, B., Kym, G., Chin, J. W. Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction. Angewandte Chemie International Edition. 57, 2831-2834 (2018).
- Schmied, W. H., Elsässer, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
- Junutula, J. R., et al. Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves the Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Junutula, J. R., et al. Rapid Identification of Reactive Cysteine Residues for Site-Specific Labeling of Antibody-Fabs. Journal of Immunological Methods. 332 (1), 41-52 (2008).
- Doronina, S. O., et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. 21 (7), 778-784 (2003).
- Shiraishi, Y., et al. Identification of Highly Reactive Cysteine Residues at Less Exposed Positions in the Fab Constant Region for Site-Specific Conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (6), 1032-1040 (2015).
- Sabourin, M., et al. Increasing Antibody Yield and Modulating Final Product Quality using the Freedom(TM). CHO-S(TM) Production Platform. BMC Proceedings. 5 (8), 102 (2011).
- Xiao, Y., Gao, X., Maragh, S., Telford, W. G., Tona, A. Cell Lines as Candidate Reference Materials for Quality Control of ERBB2 Amplification and Expression Assays in Breast Cancer. Clinical Chemistry. 55 (7), 1307-1315 (2009).
- Shinmi, D., et al. One-Step Conjugation Method for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates through Reactive Cysteine-Engineered Antibodies. Bioconjugate Chemistry. 27 (5), 1324-1331 (2016).
- Badescu, G., et al. Bridging Disulfides for Stable and Defined Antibody Drug Conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (6), 1124-1136 (2014).
- Vazquez-Lombardi, R., et al. Transient expression of human antibodies in mammalian cells. Nature Protocols. 13 (1), 99-117 (2018).
- Baldi, L., Hacker, D. L., Meerschman, C., Wurm, F. M. Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols. Hartley, J. L. , Humana Press. 13-26 (2012).
