Summary
Innlemme en cyclopropene derivat av lysin i antistoffer kan områdespesifikke, rask og effektiv sammenhengen av tetrazine-bærende molekyler å generere antistoff-stoff conjugates.
Abstract
Antistoff-stoff conjugates (ADFS) brukes i dag i klinisk praksis er en blanding av antistoff molekyler forbundet til varierende antall giftstoffer forskjellige posisjoner. Prekliniske studier har vist at terapeutisk indeks av disse tradisjonelle ADCs kan forbedres ved områdespesifikke sammenhengen av giftstoffer. Gjeldende metoder å produsere homogen ADFS har imidlertid flere begrensninger, som lav protein uttrykk og treg reaksjon kinetics. I denne protokollen beskriver vi hvordan du setter opp et uttrykk system å innlemme en cyclopropene derivat av lysin (CypK) i antistoffer bruker genetisk kode ekspansjon. Dette minimale bioorthogonal håndtaket gir rask Bøyning tetrazine derivater gjennom en invers etterspurte Diels-or cycloaddition. Uttrykket systemet her rapportert aktiverer lettvinte produksjon og rensing av trastuzumab bærer CypK i hver av de tunge kjedene. Vi forklarer hvordan du kobler antistoffer til gift monomethyl auristatin E og karakteriserer immunoconjugate hydrofobe samhandling kromatografi og massespektrometri. Til slutt, vi beskrive analyser å vurdere stabiliteten i humant serum av dihydropyridazine koblingen som følge av bøyning og teste den selektive cytotoksisitet av ADC for brystkreft celler med høye nivåer av HER2 reseptor.
Introduction
Antistoff-stoff conjugates (ADFS) kombinerer selektivitet av biotherapeutics og styrken på små cytotoksiske molekyler. De fleste ADFS mål å redusere bivirkninger av tradisjonelle kjemoterapi ved målretting medikamenter som påvirker DNA eller microtubule polymerisasjon kreft celler1. Første generasjon ADFS godkjent av Food and Drug Administration (FDA) er avhengige av endring av lysines og cysteinene, som genererer blandinger av molekyler endret til forskjellige posisjoner med redusert farmakokinetiske egenskapene2. Derimot kan områdespesifikke Bøyning narkotika antistoffer generere forbindelser med forbedret terapeutiske indeces3,4. Søker å ta utfordringen med å produsere homogen ADFS, er flere selektiv kjemiske og enzymatiske endringer rapportert1,5. Men kan dagens metoder målrette bare viss posisjon på antistoffer, lider av lav protein uttrykk, gi linkers lav stabilitet eller stole på treg og lave gir reaksjoner.
Innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAA) gjennom genetiske koden utvidelse muliggjør områdespesifikke installasjon av en overflod av bioorthogonal reaktive grupper i proteiner, potensielt overvinne begrensningene til andre metoder for å generere ADFS. Koding ncAAs svar på et mål (stopp) codon er avhengig av aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA par som ortogonale til endogene parene som innlemme kanoniske aminosyrer6. Flere ncAAs har blitt innlemmet i antistoffer til å generere ADFS. Men mest lider av ulike gjeld for programmer i terapeutisk medikament Bøyning. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 er ikke fullt bioorthogonal, krever lav pH (4.5) og lang reaksjonstid (> 60 h), mens azides som p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11og en azide derivat lysin (AzK)12,13 reduseres i cellen14, og kobber brukes til å katalysere Huisgen sykloaddisjoner kan indusere oksidative skader 15.
Selv om alternative ncAAs basert på trans-cyclooctene (TCO), cyclooctyne (SCO) og bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) har nylig blitt kodet i et antistoff for bio-imaging formål, uttrykk systemet lider av svært lav avkastning (0,5 mg/L)16. Videre cyclooctenes og cyclooctynes er store og hydrofobe håndtak som kan øke mottakelighet av ADC for aggregering -ADC nyttelast er tradisjonelt hydrofobe og mekanisk-egenskapene for linker har blitt vist å sterkt påvirke farmakokinetikken og terapeutisk indeks17. Derimot er 1,3-disubstitued cyclopropenes lite reaktive grupper som skal gi minimal endring i protein struktur og physichochemical egenskaper18. Cyclopropenes reagere selektivt og raskt med tetrazines via en omvendt elektron-demand Diels-or cycloaddition19. I denne protokollen vi gjøre bruk av et derivat av lysin (CypK, figur 1b) bærer en metyl-cyclopropene som er mindre påvirket av steric hindring enn større anstrengt umettede sykluser og har en reaksjon hastighet konstant i 1-30 M-1s -1 i vandige media18,20.
Nylig rapporterte vi hvordan å innlemme CypK i antistoffer å generere ADFS ved reagerer dette minimale bioorthogonal håndtaket med tetrazine-bærende molekyler21. Her beskriver vi ADC forberedelse prosedyren nærmere med vekt på de mest utfordrende trinnene. Innlemmelse av CypK er rettet med en pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) / tRNACUA(PylT) par svar på et gult codon introdusert i den tunge kjeden antistoff (HC)22. Her bruker vi to plasmider forbigående transfection (figur 1a), en koding tunge kjeden av antistoffer og den andre en koding lys kjeden (Langbane), begge inneholder PylRS/PylT kassetten. Alternativt kan en stabil cellen linje som gir høyere antistoff gir genereres gjennom en mer arbeidskrevende prosedyre21.
De nevnte uttrykk systemene kan produsere terapeutiske anti-HER2 immunglobulin 1 (IgG1) trastuzumab med CypK på lignende nivåer til vill type antistoff. Vi valgte den første plasseringen av CH1 domenet på den tunge kjeden å kode ncAA (HC-118TAG). Dette er vanligvis endret området i ADFS23 og er kjent som HC-118 (EU nummerering) men har også blitt omtalt som HC-121 (sekvens posisjon) og HC-114 (Kabat nummerering)24. Siden denne posisjonen er bevart gjennom alle IgG1s, burde systemene uttrykk være mottakelig for mest terapeutiske antistoffer.
Vi viser trastuzumab(CypK)2 kan enkelt renses protein en etterfulgt av rask protein flytende kromatografi hydrofobe samhandling kolonnen (FPLC-her over). Antistoffer kobles deretter covalently i 3 h å microtubule polymerisasjon hemmer monomethyl auristatin E (MMAE), som brukes i FDA-godkjent ADC Adcetris. Her bruker vi et benzyl-tetrazine derivat av MMAE (tetrazine-vcMMAE) med et linker som består av en glutarate for avstand og en Valin-citrulline protease-labil komponent etterfulgt av en p- aminobenzylalcohol self-immolative enhet; Denne linker er kløyvde av katepsin B i lysosome på internalization ADC resulterer i traceless utgivelsen av giftstoffer25. For å vise det brede omfanget av reaksjonen, er antistoffer også knyttet til fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA). Vi forklare hvordan å bekrefte identiteten til konjugert av flytende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) og beregne narkotika til antistoff forholdet (DAR) bruker Væskekromatografi hydrofobe samhandling kolonnen (såkalt HPLC-her over) .
Som del av karakterisering av antistoff ytelsen beskriver vi hvordan å teste stabiliteten i dihydropyridazine sammenhengen i humant serum. Denne parameteren er lettere vurdert i trastuzumab-TAMRA fordi det kan kvantifiseres ved en enkel ELISA og tolkning av resultatene er ikke komplisert av komponenten protease labil av trastuzumab(MMAE)2. Til slutt, det selektivitet og styrken på trastuzumab(MMAE)2 vurderes ved å sammenligne cytoxicity av ADC over cellelinjer uttrykke ulike nivåer av HER2. Denne analysen gir også en funksjonell bevis for ADC stabilitet når utført etter rugende immunoconjugate i humant serum.
Protocol
1. produsere og karakterisere antistoffer
- Express antistoffer
- Tine ampuller med HEK fjæring celler i en 250 mL kolbe som inneholder 50 mL av uttrykket medium med 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 250 ng/mL amfotericin B. holde cellene på 37 ° C med 8% CO2 i fuktet inkubatorer utstyrt med en shaker på 125 rpm. Dele cellene 0,3 til 0.5 x 106 celler/mL (hver 2-3 dager) minst 2 ganger før transfecting.
- Når en tetthet på 2.5 x 106 celler/mL er nådd (2-3 dager etter deling), forberede en frisk løsning av 100 mM CypK. For dette formålet, veier 64 mg CypK, legge til 2,5 mL 0,1 natriumhydroksid, vortex, spinn ned å gjenopprette alt fra ikke partikler og sonicate.
- Legge til 2,5 mL av CypK (100 mM inne 0.1 M NaOH) 42,5 mL av uttrykket medium med antibiotika. Bland godt, Legg 250 µL av 0.1 M HCl, og sterilisere bruke filtere 0.22 µm.
- Fortynne 50 µg HC og LC pKym1 plasmider21 til 2,5 mL med redusert serum medium. I en separat tube, fortynne 135 µL av transfection reagensen til 2,5 mL med redusert serum medium.
- Fem minutter etter forbereder løsningene, bland plasmider og transfection reagens løsningen og ruge for 20 min å tillater dannelse av komplekser mellom DNA og transfection reagensen.
- I mellomtiden sentrifuge 125 millioner celler på målet tettheten for 5 min på 500 x g, resuspend med uttrykk mediet som inneholder CypK og Legg DNA-transfection reagens blandingen. CypK kan kjøpes eller syntetisert som rapportert tidligere18.
- Etter rugende celler for 20 h, Legg 250 µL av transfection reagens enhancers følger med i pakken.
- Høste antistoffer fra supernatant 6-7 dager etter CypK (ingen endring av medium er nødvendig under uttrykk).
* Eventuelt for å få høyere og mer konsekvent dekkevne, kan en stabil celle-linje genereres som beskrevet i Oller-Salvia et al. 201821. I dette tilfellet er trastuzumab(CypK)2 uttrykt ved tillegg av CypK 5 mM i uttrykket medium.
- Rense antistoffer
- Sentrifuge cellene i 15 min 3000 x g.
- Filtrere nedbryting med en 0.45 eller filtere 0.22 µm. Hvis filteret blir okkludert, erstatte den for en ny og fortsetter filtrering. Hvis dette skjer etter bare noen ml, sentrifuge nedbryting for en ekstra 15 min 7000 x g.
- Legg til protein A harpiks (2 mL/100 mL nedbryting) i en tom polypropylen kromatografi kolonne og equilibrate harpiksen med minst 5 mengder perle vaskebuffer (0.1 M natrium fosfat, 150 mM NaCl).
- Delt nedbryting i to 50 mL konisk rør og legge 5 x perle vaskebuffer (0,5 M natrium fosfat, 150 mM NaCl) etterfulgt av pre equilibrated protein A harpiks. Plass konisk røret på rull for 3t ved romtemperatur å trekke ned antistoffer i nedbryting.
Alternativt: Legg nedbryting på kolonnen med minst dobbel anbefalte volumet av harpiks og la strømme gjennom. Kontroller at det ikke er en betydelig mengde antistoff igjen i nedbryting av SDS-side. Hvis det er, elute nedbryting gjennom harpiks igjen. - Overføre protein A harpiks med nedbryting i en kolonne, og at væsken å strømme gjennom.
- Legge til 25 mL vaske bufferen (eller minst 10 harpiks volumer) og la strømme gjennom.
- Elute antistoffer med 4 mL 0.1 M natriumsitrat, pH 3 på 1 mL 1 M fosfatbuffer, 150 mM NaCl.
- Fortynne antistoffer med 10 mL PBS, konsentrere seg til 0,5-1 mL av sentrifugal filtrering og exchange buffer tre ganger med PBS.
- Rense prøvene av FPLC med en butyl HIC kolonne med en flyt av 0,5 mL/min og en 0-100% forløpningen i 30 min med lav-salt buffer (50 mM natrium fosfat pH 7.0, 20% isopropanol) i høy-salt buffer (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM natrium fosfat pH 7.0 5% isopropanol). Samle alle fraksjoner og overvåke tilsettes på 280 nm. Små mengder (< 1 mg) kan renses med HPLC-HIC under forholdene beskrevet i 2.4 å maksimere avkastning og renhet.
- Basseng fraksjoner som inneholder antistoff, fortynne dem til minst 4 mL med PBS, konsentrer dem av sentrifugal filtrering og exchange buffer tre ganger med PBS.
- Kvantifisere antistoffer
- Få en omtrentlig konsentrasjon ved å måle absorbans ved 280 nm bruker et spektrofotometer mikro-volum.
- Hvis en nøyaktig måling, bruk en ELISA kit for å måle menneskelige IgGs. For et grovt anslag, bruk SDS-side med en Coomassie-baserte flekk som følger:
- Klargjør standarder ved å fortynne seks ganger todelt en trastuzumab standard kvantifisert ved ELISA på 1 mg/mL.
- Kok standarder og prøvene på ca 0,25 mg/mL å redusere lasting buffer.
- Kjøre dem i en 4-12% Bis-Tris SDS side bruker MES-SDS buffer og flekker med en Coomassie-baserte fargestoff. Endelig mål fargen tettheten av bandet tilsvarer lys eller tunge kjeden bruker ImageJ og interpolere signalet fra eksemplene i standardkurven.
- Lagre antistoffer på 4 ° C.
2. bøy antistoffer og karakterisere ADC
- Bøy antistoffer med tetrazine-bærende molekylet
- Fortynne 10 molar ekvivalenter av tetrazine-vcMMAE (4 µL, 3,4 mM dimethyl sulfoxide (DMSO)) med 20 µL av acetonitrile og 76 µL av PBS i en liten konisk tube (f.eksPCR rør).
- Legge 1 molar tilsvarer trastuzumab(CypK)2 (100 µL, 2 mg/mL i PBS), bland godt og la reagere for 3t ved romtemperatur (25 ° C) å danne trastuzumab(MMAE)2.
Merk: Andre molekyler slik som tetrazine-5-TAMRA kan knyttes til antistoffer i stedet for tetrazine-vcMMAE bruker denne protokollen.
- Rense ADC
- Pre equilibrate en størrelse utelukkelse spinn kolonne med PBS følge instruksjonene fra produsenten.
- Legge til hele volumet av reaksjonen på spin kolonne og sentrifuge 1500 x g for 1 min.
- Kvantifisere du ADC og analysere konjugert SDS-side
- Kvantifisere du ADC som beskrevet i 1.3.2. ved å måle farge tettheten av lys kjeden på en SDS-side ved hjelp av ingen-modifisert antistoffer for standardkurven.
- Den tunge kjeden bør ha litt forskjøvet viser en økning i molekylvekt på Bøyning.
Merk: Hvis antistoffer endres med en fluorophore som i trastuzumab(TAMRA)2, bare bandet tilsvarer den tunge kjeden skal vise i-gel fluorescens før farging.
- Analysere konjugert av HPLC-HIC
- Equilibrate kolonnen HPLC-HIC med 100% buffer A (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM natrium fosfat pH 7.0, 5% isopropanol) i 5 min.
- Mix-15 µL (67 pmol) i en 1 mg/mL løsning av trastuzumab (CypK) 2 med 15 µL av 2 x bufferen A i ampuller. Deretter programmet en 10 µL injeksjon i HPLC.
- Elute i en isocratic 1 mL/min flyt med 100% buffer A for 1 min etterfulgt av en 15 min gradering fra 100 til 0% av buffer A i B (50 mM natrium fosfat pH 7.0, 20% isopropanol). Overvåke tilsettes på 280 nm.
- Beregn på DAR ved å integrere topp tilsvarer hver art og bruker de resulterende områdene i denne formelen:
DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
Forventet oppbevaringsperioden for trastuzumab(CypK)2 er 7,5-8.0 min, for trastuzumab (CypK, MMAE) er 9.1-9.6 min, og for trastuzumab(MMAE)2 10.5-11.0 min.
- Analysere konjugert av LC-MS
- Deglycosylate 30 µL av 1 mg/mL ADC og uforandret antistoffer i ikke-reduserende forhold med 250 PNGase F enheter for minst 6 h 37 ° C.
- Elute antistoffer i masse spectrometer i en C4 1-5 µm 1.0 x 100 mm kolonne ved hjelp av en 20 min gradient 2% til 80% acetonitrile i vann. Hente data over en m/z rekke 350-4000 i positivt ion-modus med en kjegle spenning på 150v.
- Deconvolute rå data ved hjelp av riktig programvare. Beregne forskjellen i masse endret og uforandret antistoffer.
3. analysen stabilitet Dihydropyridazine sammenhengen i Trastuzumab(TAMRA)2 i Serum
- Filtrere serum bruke filtere 0.22 μm under sterile forhold. Du kan legge 100 enheter/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin.
- Fyll de eksterne brønnene av en 96-brønns plate med vann. I sentrale brønnene, bland i tre eksemplarer 90 µL av filtrerte serum med 10 µL av 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 i PBS på en siste konsentrasjon av 0,1 mg/mL. Plass platen i en inkubator mettet med luftfuktighet på 37 ° C og 4-5% CO2.
- Hver 24 h gjennom 5 dager, Pipetter hver vel grundig å blande, ta en 5 µL aliquot, flash-frys med flytende nitrogen, og lagre på-80 ° C.
- Når alle prøver er samlet, tine dele og analysere ved hjelp av en indirekte ELISA som tidligere rapportert12 med noen modifikasjoner:
- Coat en 96-brønns plate natten med 0,25 µg/mL HER2 på 4 ° C. Alle andre trinn utføres ved romtemperatur.
- På dagen Vask 5 ganger med PBS 0,05% tween (PBS-T) og blokkere med 1% bovin serum albumin 1t.
- Vask og ruge eksemplene på 1:10000 fortynning i PBS 2 h.
- Vask og Inkuber en anti-TAMRA antistoff i musen 1:2000 fortynning i PBS-T med 0,5% BSA 1t.
- Vask og Inkuber en anti-musen HRP konjugat 1:1000 i PBS-T med 0,5% BSA 1t.
- Legg TMB og kunne reagere 5-10 min.
- Stoppe reaksjon med 50 µL H2så4 1 M og måle absorbans ved 450 nm. Trekke fra bakgrunnen målt på 570 nm.
- Tilpasse en 4-parameteren logistisk regresjon kurve til standard fortynninger og interpolere målinger fra prøver.
Merk: Stabiliteten i trastuzumab(MMAE)2 kunne vurderes bruke samme protokoll ved å endre analysen beskrevet i 3.3 for en kommersiell ELISA kit for å måle konsentrasjonen av ADC.
4. vurdere cytotoksisitet av ADC
Merk: Denne protokollen er basert på tidligere rapportert analyser23,26 med noen modifikasjoner.
- Tine SK-BR-3 og MCF-7 celler og tillate dem å avgjøre i p25 flasker som inneholder fullstendig medium, i.e. DMEM med 10% varme inaktivert fosterets bovin serum, 100 enheter/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin.
- Dele cellene på 80-90% samløpet (hver 3-4 dager) minst 2 ganger før analysen.
- To dager før analysen, fylle de ytre brønnene av en 96-brønns plate med vann. Så løft celler med 0,05% trypsin i 0,5 mM EDTA, sentrifuger 3 min 250 x g, resuspend i nytt medium og frø 3000 celler i 100 µL per (tom) godt i 96-brønnen platene.
- To dager etter seeding cellene, forberede 10 føljetong fortynninger av alle prøvene i tre eksemplarer med 0,1% DMSO komplett medium. Vurder følgende eksempler og kontroller: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab villtype, tetrazine-vcMMAE og MMAE.
- Legg 100 µL av hvert utvalg i hver brønn og ruge 5 dager på 37 ° C og 4-5% CO2.
- På dag 5, måle celle levedyktighet. Dette kan du bruke en kommersiell kit til lyse cellene og måle ATP utgitt. Tegne inn prosentandelen av signal med hensyn til kontroll-cellene behandlet med 0,1% DMSO.
Merk: ADCs kan ruges i 5 dager i serum og assayed for cytotoksisitet bevise funksjonelle stabilitet.
FORSIKTIG: MMAE er svært giftig. Derfor bruke briller og hansker når du håndterer MMAE derivater. Hvis du bruker uforandret MMAE som en kontroll i eksperimentet, når du klargjør lager løsningen i DMSO, håndtere solid produktet i avtrekksvifte.
Representative Results
Rapportert forbigående uttrykk systemet (figur 1a) gir 22 ± 2 mg av trastuzumab(CypK)2 per liter kultur medium, som representerer 2/3 av det vill type antistoffet produsert under samme vilkår (figur 1 c). Stabil celle linjen kan øke dette gir opptil 31 ± 2 mg/L21.
Trastuzumab(CypK)2 kan være konjugert med tetrazine-vcMMAE, som gir kvasi homogen trastuzumab(MMAE)2 i 3t ved 25 ° C (figur 2). Den høye hydrophobicity av denne cytotoxin krever tillegg av 10% acetonitrile når 5 eller flere molar ekvivalenter av gift per CypK brukes. Alternativt er i cycloaddition også fullført innen 20 timer med 2 ekvivalenter av tetrazine-vcMMAE uten acetonitrile (figur 2 c). Trastuzumab(CypK)2 reagerer med tetrazine-TAMRA innen 2 timer ved 25 ° C og 3-6t kreves når temperaturen reduseres til 4 ° C (Figur 3 c).
Den forventede DAR trastuzumab(MMAE)2 målt ved HPLC-HIC er 1,9 (figur 2b). Toppen først observert i chromatogram på 8.0 min representerer unconjugated antistoffer (DAR 0) og bør har forsvunnet når reaksjonen er fullført. Arten DAR 1 elutes 9.1-9.6 minutter og bør ha en området < 10% etter 3 h; og målet produktet med DAR 2 har en tiden av 10.5-11.0 med en forventet område > 90%. Mobilitet Skift og fluorescens i SDS side gels bekrefter inkorporering av TAMRA (figur 3b) og identiteten til immunoconjugates er verifisert av LC-MS (figur 2d-e og figur 3d).
Inkubasjon av trastuzumab(TAMRA)2 i 5 dager i humant serum og påfølgende analyse av ELISA bekrefter at nyttelast fortsatt festet til antistoffer (figur 4b). Angående cytotoksisitet analysen, trastuzumab(MMAE)2 viser høy styrke i SK-BR-3 (HER2 høy) bryst kreftceller, med en halv maksimal effektiv konsentrasjon (EF50) 55 + 10 pM (Figur 4 d). Trastuzumab(MMAE)2 opprettholder cytotoksisitet etter 5 dager med inkubering i humant serum (Figur 4 c). Motsatt når du ADC er assayed MCF-7 (HER2 lav) EF50 er 200-fold lavere (Figur 4 d). Wild type antistoff, trastuzumab(CypK)2 og tetrazine-vcMMAE viser svært lav toksisitet (tall 4 d og 4e), mens MMAE viser høy ikke-selektive cytotoksisitet i begge linjer (figur 4e).
Figur 1: Transient uttrykk systemet. A. relevante regioner i plasmider brukes til midlertidig transfection i HEK293 celler. CMV: cytomegalovirus promoter, WPRE: hakkespett hepatitt Virus Posttranscriptional regulatorisk Element, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: bestemt promoter, PylRS: pyrrolysil tRNA synthetase, > og <: retning transkripsjon. B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. uttrykk gir av vill-type (WT) trastuzumab og trastuzumab(CypK)2 målt i en western blot etter protein en renselse. Feilfelt representerer standardavviket for biologiske triplicates. Dette tallet er endret med tillatelse fra Oller-Salvia et al. 201821. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Bøyning av trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-vcMMAE. A. Inverse elektron-demand Diels-or cycloaddition mellom CypK rester i antistoffer og den tetrazine deriverte av MMAE. Reagere gruppene er uthevet i rødt, p- aminobenzylalcohol er avbildet i grønt og Valin-citrulline-dipeptide i blått. B. HPLC-HIC chromatograms viser fremdriften til Bøyning av antistoff. C. grad av konvertering med hensyn til den maksimale DAR 1,9 bruker forskjellige reagens konsentrasjoner. D-E. Deconvoluted masse spektra av full lengde antistoffer før og etter Bøyning. Trastuzumab(CypK)2 ble oppnådd ved hjelp av stabil celle-linjen. Dette tallet er endret med tillatelse fra Oller-Salvia et al. 201821. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bøyning av trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-TAMRA. A. Inverse elektron-demand Diels-or cycloaddition mellom CypK rester i antistoffer og den tetrazine deriverte av TAMRA. B. SDS side gels viser mobilitet Skift og i-gel fluorescens stammer fra Bøyning av TAMRA. C. Bøyning kinetics ved to forskjellige temperaturer. D. Deconvoluted masse spekteret av trastuzumab(TAMRA)2. Trastuzumab(CypK)2 ble oppnådd ved hjelp av stabil celle-linjen. Dette tallet er endret med tillatelse fra Oller-Salvia et al. 201821. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: stabilitet i serum og cytotoksisitet av trastuzumab conjugates. A. tegneserie uthevingen funksjoner ønsket i en internalizing ADC. B. stabilitet av trastuzumab(TAMRA)2 i humant serum målt i ELISA. C. celle levedyktighet analysen med trastuzumab(MMAE)2 etter 5 dager i humant serum (+ serum, svart). En kontroll prøven ruges i PBS i stedet for serum (-serum, rød) ble inkludert i den samme analysen. D. celle levedyktighet analysen med fersk utvannet antistoff prøver. E. celle levedyktighet analysen med fersk utvannet MMAE derivater. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt 3 uavhengige eksperimenter. Dette tallet er endret med tillatelse fra Oller-Salvia et al. 201821. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Forbigående uttrykk prosedyren for å produsere trastuzumab(CypK)2 beskrevet i denne protokollen er enkel, og gir høy fleksibilitet. Avkastningen oppnådd er de i en akademisk innstillingen27 og stabil cellelinjer kan genereres for å ytterligere øke produksjonen yield21. Under uttrykk lavere konsentrasjoner av CypK enn 5 mM kan resultere i lavere ncAA innlemmelse, og større mengder kan påvirke cellevekst og redusere antistoff avkastning. CypK som en gratis aminosyre har lav vannløselighet, dermed bør være første oppløses 100 mM inne 0.1 M NaOH og deretter lagt til kultur medium. Etter fortynne CypK i medium, og før det legges til celler, er det avgjørende å nøytralisere mediet med HCl og filter å sterilisere. Deretter bruker transfection reagensene angitt i denne protokollen og etter inkubasjon ganger anbefalt av produsenten er viktig for et høytytende uttrykk. For ytterligere informasjon om forbigående uttrykk for menneskelige antistoffer kalles leseren andre publiserte protokoller31,32.
Når antistoffer er renset, er en høy overskudd av protein A harpiks nødvendig som vist for å sikre full antistoff trekke ned fra nedbryting. For å hindre nedbør av trastuzumab under elueringsrør, anbefales det å bruke en løsning med høy bufring kapasitet, fortynnet umiddelbart med PBS og utveksle bufferen unngå overdreven konsentrasjon. Alltid holde antistoffer < 5 mg/mL.
Bøyning av trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-vcMMAE er raskere enn de fleste reaksjoner rapportert med andre bioorthogonal håndtak for ADFS. Videre, dette cycladdition oppstår under svært mild forhold: romtemperatur eller lavere og Fysiologiske pH. Det er viktig å fortynne DMSO lager løsninger av reaktantene med acetonitrile før PBS og antistoffer; ellers vil tetrazine derivater utløse. Acetonitrile kreves bare på grunn av den høye hydrophobicity av MMAE og TAMRA, men mindre hydrofobe molekyler kan ikke trenger i tillegg et co løsemiddel. Tetrazine-vcMMAE kan også bli bøyd på uten acetonitrile og bare 2 molar ekvivalenter av tetrazine-vcMMAE i 20 h. Denne liten mengde gift kan omfatte en betydelig reduksjon i produksjonskostnadene for ADC sammenlignet med gjeldende ncAA-baserte teknologier. Trastuzumab(CypK)2 er fullt reaktive for minst 4 måneder når bevart på 4 ° C.
HPLC-HIC gjør en nøyaktig bestemmelse av DAR siden MMAE er svært hydrofobe og gir en utmerket løsning av toppene tilsvarer antistoff conjugates med 0, 1 og 2 giftstoffer. Ureagert tetrazine-vcMMAE elutes rundt 13,7 min og oppdages på 280 nm. Denne teknikken krever en starter materiale med høy renhetsgrad. Dessuten, det er ikke tilrådelig å slukke reaksjon med andre tetrazine-reaktive molekyler som BCN-OH siden de kan endre til tid og form av toppene. Det er viktig at salt konsentrasjonen av prøvene passer den i mobile fase i starten av graderingen for å få en god separasjon, spesielt hvis mer enn 10-20 µL er injisert.
Angående LC-MS analysen er deglycosylation av antistoff prøvene nødvendig for å hente en enkelt topp på deconvolution av rå spekteret. Nøyaktigheten av den totale antistoff og ADC massene kan variere avhengig av callibration av maskinen. Derfor, for å beregne massen for ombygging, trekk massen innhentet for uforandret antistoffer fra den innhentet for ADC. Moderne høyoppløselig masse spektrometre bør gi en relativ feil under 1:10000. Selv om LC-MS kan også brukes til å beregne forholdet mellom de ulike artene, er denne verdien vanligvis en overvurdering fordi endringen kan påvirke ionisering kapasiteten av arten generert og registreres ikke lave mengder urenheter.
Stabiliteten av linker i ADFS er kritisk fordi tidlig utgivelsen av stoffet resulterer i høyere toksisitet og lavere effekt; den gratis cytotoxin skade sunt vev og naken antistoffer konkurrerer med den væpnede for bindingen målområdene på syke celler. En utgivelse under 5%, som er i variasjon av stabilitet analysen, bør forventes.
Til slutt, selektiviteten av en ADC målretting HER2 som trastuzumab(MMAE)2 kan vurderes ved å sammenligne cytotoksisitet i SK-BR-3 celler (HER2 høy) og MCF-7 celler (HER2 lav) siden sistnevnte uttrykke 15-fold mindre HER2 reseptorer enn tidligere28 . Immunoconjugate forventes å resultere i en celle levedyktighet minst 2 størrelsesordener lavere i SK-BR-3 sammenlignet med MCF-7. EF50 i SK-BR-3 bør være et tosifret nanomolar gjenspeiler den høye styrken på denne ADC29,30. Uforandret antistoffer, trastuzumab(MMAE)2 eller trastuzumab, skal vise ingen toksisitet i denne analysen. Tetrazine-vcMMAE bør ha en effekt 3 størrelsesordener lavere enn du ADC siden linker fjerner aktiviteten til peptidomimetic giften. Fordi MMAE kan trenge gjennom cellemembranen30, bør det derimot har en lignende toksisitet for ADC men viser ingen diskriminering mellom HER2 høy og HER2 lav linjer. Videre, hvis denne analysen utføres etter en 5 dagers inkubasjonstiden for ADC i serum, den kan brukes til en funksjonell beviser stabiliteten av kobleren: en versjon av giften vil resultere i enten en nedgang i ADC effektivitet i SK-BR-3 Hvis MMAE ble utgitt med p kunsten å linker eller en nedgang i selektivitet hvis linker var kløyvde i traceless mote.
ADC teknologien beskrevet her kan effektiv og områdespesifikke inkorporering av en cyclopropene derivat av lysin i IgG1s. Etter en lettvinte rensing, antistoffer kan være raskt konjugert med tetrazine inneholder molekyler, gir homogen produkter. På grunn av liten størrelse og høy reaktivitet av cyclopropene minimal håndtaket, bør denne metoden aktivere Bøyning av sterically hindret nyttelast. De resulterende immunoconjugates er stabil i serum og svært potent og selektiv. Samlet muliggjør CypK en rask, områdespesifikke og stabile bioorthogonal kobling for antistoffer og andre protein conjugates som skal brukes i terapi eller diagnose.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av i Medical Research Council, UK. BO-S. har en EMBO fellesskap (ATLF 158-2016) og er takknemlig til H. Pelham og JW haken for støtte, og G. Kym, C. W. Morgan og O. Perisic for hjelp og råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
| Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
| 125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
| Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
| Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
| Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
| Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
| Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
| Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
| ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
| HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
| Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
| Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
| Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | - | Costum synthesized |
| Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
| UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
| Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
| PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
| NanoAcquity | Waters | ||
| C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
| 96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
| Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
| CO2 incubator | Panasonic | ||
| HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
| Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
| Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| TMB | BioLengend | 421101 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
| PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
| SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
| Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
| Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
| MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
| Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
| Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
| Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |
References
- Beck, A., Goetsch, L., Dumontet, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (5), 315-337 (2017).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Stan, A. C., Radu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T. -D. Antineoplastic Efficacy of Doxorubicin Enzymatically Assembled on Galactose Residues of a Monoclonal Antibody Specific for the Carcinoembryonic Antigen. Cancer Research. 59 (1), 115-121 (1999).
- Hamblett, K. J., et al. Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate. Clinical Cancer Research. 10 (20), 7063-7070 (2004).
- Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy. Angewandte Chemie International Edition. 53 (15), 3796-3827 (2014).
- Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code. Nature. 550 (7674), 53-60 (2017).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Unnatural Amino Acids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody Conjugates with Unnatural Amino Acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Tian, F., et al. A General Approach to Site-Specific Antibody Drug Conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 1766-1771 (2014).
- Kern, J. C., et al. Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates. Journal of the American Chemical Society. 138 (4), 1430-1445 (2016).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural Amino Acids in a Cell-Free Expression System. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- VanBrunt, M. P., et al. Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 26 (11), 2249-2260 (2015).
- Xiao, H., et al. Genetic Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells. Angewandte Chemie International Edition. 52 (52), 14080-14083 (2013).
- Milles, S., et al. Click Strategies for Single-Molecule Protein Fluorescence. Journal of the American Chemical Society. 134 (11), 5187-5195 (2012).
- Lallana, E., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide-Alkyne Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 50 (38), 8794-8804 (2011).
- Koehler, C., et al. Genetic Code Expansion for Multiprotein Complex Engineering. Nature Methods. 13 (12), 997-1000 (2016).
- Lyon, R. P., et al. Reducing Hydrophobicity of Homogeneous Antibody-Drug Conjugates Improves Pharmacokinetics and Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 33 (7), 733-735 (2015).
- Elliott, T. S., et al. Proteome Labeling and Protein Identification in Specific Tissues and at Specific Developmental Stages in an Animal. Nature Biotechnology. 32, 465-472 (2014).
- Ravasco, J. M. J. M., Monteiro, C. M., Trindade, A. F. Cyclopropenes: A New Tool for the Study of Biological Systems. Organic Chemistry Frontiers. 4 (6), 1167-1198 (2017).
- Yang, J., Šečkutė, J., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 124 (30), 7594-7597 (2012).
- Oller-Salvia, B., Kym, G., Chin, J. W. Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction. Angewandte Chemie International Edition. 57, 2831-2834 (2018).
- Schmied, W. H., Elsässer, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
- Junutula, J. R., et al. Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves the Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Junutula, J. R., et al. Rapid Identification of Reactive Cysteine Residues for Site-Specific Labeling of Antibody-Fabs. Journal of Immunological Methods. 332 (1), 41-52 (2008).
- Doronina, S. O., et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. 21 (7), 778-784 (2003).
- Shiraishi, Y., et al. Identification of Highly Reactive Cysteine Residues at Less Exposed Positions in the Fab Constant Region for Site-Specific Conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (6), 1032-1040 (2015).
- Sabourin, M., et al. Increasing Antibody Yield and Modulating Final Product Quality using the Freedom(TM). CHO-S(TM) Production Platform. BMC Proceedings. 5 (8), 102 (2011).
- Xiao, Y., Gao, X., Maragh, S., Telford, W. G., Tona, A. Cell Lines as Candidate Reference Materials for Quality Control of ERBB2 Amplification and Expression Assays in Breast Cancer. Clinical Chemistry. 55 (7), 1307-1315 (2009).
- Shinmi, D., et al. One-Step Conjugation Method for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates through Reactive Cysteine-Engineered Antibodies. Bioconjugate Chemistry. 27 (5), 1324-1331 (2016).
- Badescu, G., et al. Bridging Disulfides for Stable and Defined Antibody Drug Conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (6), 1124-1136 (2014).
- Vazquez-Lombardi, R., et al. Transient expression of human antibodies in mammalian cells. Nature Protocols. 13 (1), 99-117 (2018).
- Baldi, L., Hacker, D. L., Meerschman, C., Wurm, F. M. Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols. Hartley, J. L. , Humana Press. 13-26 (2012).
