Method Article

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

DOI:

10.3791/58194

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Cancer Blood Disease Institute, Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos os protocolos de validação genética e química de c-Fos e Dusp1 como um destino de droga em leucemia utilizando modelos in vitro e in vivo do mouse genética e humanizado. Esse método pode ser aplicado para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A demonstração de inibidores de tirosina quinase (TKIs) no tratamento da leucemia mieloide crônica (LMC) tem anunciava uma nova era na terapêutica do câncer. No entanto, uma pequena população de células não responde ao tratamento de TKI, resultando em doença residual mínima (MRD); mesmo o mais potente TKIs falha para erradicar estas células. Estas células MRD servem como um reservatório de desenvolver resistência à terapia. Não é conhecido por tratamento de TKI é ineficaz contra células MRD. Fator de crescimento de sinalização está implicado no apoio a sobrevivência das células MRD durante o tratamento de TKI, mas está faltando uma compreensão mecanicista. Estudos recentes demonstraram que uma elevada c-Fos e Dusp1 expressão como resultado convergente oncogênicos e fator de crescimento de sinalização em células MRD mediam resistência TKI. A inibição genética e química de c-Fos e Dusp1 processa CML requintadamente sensível para TKIs e cura LMC em ambos os modelos genéticos e humanizado do mouse. Nós identificamos estes genes alvo usando microarrays múltiplas de células resistentes e - TKI-sensíveis. Aqui, nós fornecemos métodos de validação de destino utilizando modelos in vitro e in vivo de rato. Esses métodos podem ser facilmente aplicados para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atividade da quinase de tirosina constitutiva do oncogene de fusão BCR-ABL1 faz com que a CML, que fornece uma base racional para direcionar a atividade da quinase por inibidores de pequenas moléculas. O sucesso de TKIs no tratamento de pacientes com LMC revolucionou o conceito de terapia-alvo1,2. Posteriormente, a terapia antiquinase como medicina de precisão foi desenvolvida para várias outras malignidades, incluindo tumores sólidos. Até agora, mais de trinta inibidores da quinase foram aprovados pelo FDA Estado Unidos para o tratamento de várias neoplasias malignas. TKI tratamento é muito eficaz em suprimir....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as diretrizes do cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) em Cincinnati infantil Hospital Medical Center (CCHMC). Espécimes humanos (BM Normal e que a partir de CML (p210-BCR-ABL +) Leucemia) foram obtidos através de protocolos aprovados institucional Review Board (Conselho de revisão institucional: Hospital Medical Center Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati infantil) e consentimento informado doador de CCHMC e da Universidade de Cincinnati.

1. em tempo real qPCR análise

  1. Isole o RNA total de células BaF3, crescendo em RPMI suplementado com 10% FBS e....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vício do oncogene tem sido implicado na eficácia terapêutica dos TKIs. No entanto, os mecanismos de condução a dependência do oncogene não são compreendidos. Foram realizadas várias análises de expressão de gene imparcial para identificar o componente genético envolvido em orquestrar o vício. Essas análises revelaram o upregulation de três genes, c-Fos, Dusp1 e Zfp36, em células de câncer que não são dependentes oncogênica sinalizando para a sobrevivência e, assim, são insensíveis ao trat.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para a maior parte das células cancerosas, a resposta terapêutica para TKI é mediada por um bloqueio de tirosina-quinase-oncoproteína sinais de que o tumor é viciado. No entanto, relativamente pouco é conhecido sobre como uma minoria das células cancerosas, contribuindo para MRD escape o oncogene dependência e terapia4. Estudos recentes revelaram que a sinalização de fator de crescimento Medeia resistência a drogas em leucemia e tumores de órgãos sólidos. Isto sugere que vários mecanismos molecula.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores são gratos a G. Q. Daley para fornecer as células BaF3 e WEHI e T. Reya para o MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP constrói. Os autores agradecem ao M. Carroll pelo fornecimento das amostras de blástica da LMC. Este estudo foi suportado por subsídios para M.A. da Fundação V, leucemia Research Foundation e a ICN (1RO1CA155091) e do NHLBI (R21HL114074-01).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiais biológicos
RPMICellgro (corning)15-040-CV
DMEMCellgro (corning)15-013-CV
IMDMCellgro (corning)15-016-CVR
RetroNectin Fragmento de fibronectina humana recombinanteTakaraT100B
MethoCult GF M3434 (Metilcelulose para UFC de Camundongo)Célula-tronco3434
MethoCult H4434 Classic (Metilcelulose para UFC Humana)Célula-tronco4434
4-HidroxitamoxifenoSigmaH6278
Recombinante Murino SCFProspecCYT-275
Murino Recombinante Flt3-LiganteProspecCYT-340
Recombinante Murine IL-6ProspecCYT-350
Murine Recombinante IL-7Peprotech217-17
DFCLKT Laboratories Inc.D3420
BCIChemzon ScientificNZ-06-195
ImatinibLC LaboratórioI-5508
CurcuminaSigma458-37-7
NDGASigma500-38-9
Penn / StrepCellgro (corning)30-002-CI
FBSAtlanta biológicoS11150
Tripsina EDTA 1xCellgro (corning)25-052-CI
1x PBSCellgro (corning)21-040-CV
L-GlutaminaCellgro (corning)25-005-CL5 mg/mL estoque em água
PuromicinaGibco (tecnologias de vida)A11138-03
HEPESSigmaH7006
Na2HPO4.7H2OSigmaS9390
Sulfato de protaminaSigmaP33695 mg/mL estoque em água
Solução de azul de tripano (0,4%)SigmaT8154
DMSOCellgro (corning)25-950-CQC
WST-1Roche11644807001
0,45 μ Filtro de disco acro MPALL2016-10
70 μ m estrela de células de nylonBecton Dickinson352350
FICOL (Histopaque 1083) (polissacarose)Simga1083
PBSCorning21040CV
LS ColunasMiltenyi130-042-401
Coquetel Inibidor de ProteaseRocheCO-RO
Coquetel Inibidor de Fosfatase 2SigmaP5762
1620115Membrana NitroculluloseBio-Rad
SuperSignal West (substrato de quimioluminescência)Thermo Scientific34075
CD5eBioscience13-0051-82
CD11beBioscience13-0112-75
CD45R (B220)BD biosciences553092
CD45.1-FITCeBioscience11-0453-85
CD45.2-PEeBioscience12-0454-83
hCD45-FITCBD Biosciences555482
Anti-Biotina-FITCMiltenyi130-090-857 
Anti-7-4eBioscienceMA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)eBioscience13-5931-82
Anti-Ter-119eBioscience13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7BD 
CD117 APC BD 
BD Pharm LyseBD 
BD Cytofix/Cytoperm (Solução de fixação e permeabilização)BD 
BD Perm/Lavagem  (permeabilização e solução de lavagem para fluxo de fosfo)BD 
phospho p38Cell Signaling Technologies4511S
total p38Cell Signaling Technologies9212
Controle de IgG de mouseBD 
Alexa Farinha 488 conjugada InvitrogenA-11034
Cloreto de CálcioInvitrogenK278001
2x HBSInvitrogenK278002
EDTAAmbionAM9261
BSASigmaA7906
Tubos Capilares de SangueFisher22-260-950
Tubo de Coleta de SangueGiene Bio-One450480
soro recém-nascidoAtlanta biológicoS11295
EritropoieínaAmgen5513-267-10
humano SCFProspecCYT-255
IL-3 humanoProspecCYT-210
G-SCFProspecCYT-220
GM-CSFProspecCYT-221
MyeloCult (mídia para ensaio LTCIC)Stem Cell Technologies5100
Hidrocortisona Hemisuccinato de SódioStem Cell Technologies7904
MEM alphaGibco12561-056
Seringa de insulina Lo-Dose u-100 de 1/2 cc 28 G1/2Becton Dickinson329461
Mortor pilãoCoor tek 60316 e 60317
Isoflorano (Isothesia TM)Butler Schien29405
SOCNew England BiolabsB90920s
AmpicilinaSigmaA0166100 mg / mL estoque em água
Ágar Bacto (ágar)Difco214050
Caldo fantásticoBecton Dickinson243820
AgaroseGenemateE-3119-500
Doxiciclina chowTestDiet.com52662RMH1500 modificado, Autoclavável 5LK8  com 0.0625% Doxiciclina 
TamoxifenoSigmaT5648
Cloreto de IodonitrotetrazoliumSigmaI10406
Kits
Dneasy Kit de sangue e tecidoQiagen69506
GoTaq Green (taq polimerase com corante verde)PromegaM1722
miRNeasy Mini Kit  (Kit de isolamento de RNA)Qiagen217084
DNA Free Dnase Kit (tratamento DNAse para RT PCR)Ambion, Life TechnologiesAM1906
Superscript III First Strand Synthesis (transcriptase reversa para síntese de cDNA)Invitrogen18080051
SYBR Green (mistura de taq polimerase com corante intercalante verde para qPCR)Bio-Rad1725270
CD117 MicroBead KitMiltenyi130-091-224
Ensaio Celular Humano de Longo Prazo Iniciando Ensaio CelularStemp Cell Technologies
Instrumentos
NAPCO série 8000 WJ CO2 incubadoraThermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810REppendorf
TC-10 contador de células automatizadoBio-RAD
C-1000 TermocicladorBio-RAD
Mastercycler Real Plex 2Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (sistema de imagem para géis e western blots)Bio-RAD17001401
Hemavet (contador de boold)Drew-Scientific
LSR II (analisador FACS)BD 
Fortessa I (analisador FACS)BD 
FACSAriaII (Classificador FACS)BD 
Suporte MagnéticoMiltenyi
Irradiator J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CAMark I Modelo 68Afonte Cs 137
Mice
ROSACreERT2Jackson Laboratory
Scl-tTA Dra. Claudia Huettner' s laboratório
BoyJ instalação de núcleo de camundongo no CCHMC
C57Bl/6 Instalação
no CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- Feito em casa
ROSACreERT2/c-Fosfl/flFeito em casa
Cells
BaF3Presente de George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHIPresente de George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ e célulasCD34+ normaisHospital Universitário, Universidade de Cincinnati
Substrato de Duração Prolongada Dur Ocidental 558612553356555899554714554723554121 central de camundongos NSGS do Laboratório Jackson

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
  2. Druker, B. J., et al. E....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oncogene Dependencec Fos Dusp1Tyrosine Kinase InhibitorsChronic Myeloid LeukemiaMinimal Residual DiseaseBone Marrow IsolationMagnetic Activated Cell SortingRetroviral TransductionColony Forming Unit AssayRT qPCR Western Blot

Related Articles