يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

هندسة الأنسجة ظهارة صباغ الشبكية زرع مناسبة المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

7.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58216

⸱

سبتمبر 6, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 

في هذه المقالة

ملخص

يصف لنا طريقة لمهندس نسيج شبكية تتكون من الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية المستزرعة على رأس أغشية السلي البشرية وإعدادها للتطعيم في نماذج حيوانية.

الملخص

العديد من الحالات المرضية للعين يؤثر على الأداء الوظيفي و/أو بقاء ظهارة صباغ الشبكية (RPE). وتشمل هذه بعض أشكال التهاب الشبكية الصباغي (RP) والمتعلقة بالعمر البقعي (AMD). خلية العلاج واحدة من الاستراتيجيات العلاجية الواعدة المقترحة لعلاج هذه الأمراض، مع تشجيع الفعل النتائج الأولية في البشر. ومع ذلك، طريقة إعداد الاختلاس أثرا كبيرا على أن النتائج الفنية فيفو. والواقع أن الخلايا RPE المطعمة كتعليق خلية وظيفية أقل من نفس الخلايا التي زرعها كنسيج شبكية. هنا، نحن تصف طريقة بسيطة واستنساخه لمهندس RPE الأنسجة وإعداده لغرس في فيفو . هي المصنف RPE الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent على دعم بيولوجية، الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري (لحم الخنزير). بالمقارنة مع السقالات مصطنعة، هذا الدعم له ميزة وجود غشاء الطابق السفلي الذي يقع بالقرب من غشاء بروخ حيث يتم إرفاق الذاتية RPE الخلايا. ومع ذلك، ليس من السهل التلاعب بها، ووضعنا عدة استراتيجيات لاستزراع المناسبة لها، والتحضير لتطعيم فيفو.

المقدمة

RPE أمر حاسم للبقاء على قيد الحياة والتوازن من photoreceptors التي كان من أحكام المرتبطة بها1. تغيير الظروف المرضية عدة وظائف و/أو البقاء على قيد الحياة، بما في ذلك البرنامج العادي وأية أم دي.

RP هي مجموعة من الطفرات monogenic الموروثة التي تؤثر على وظائف خلايا RPE أو فوتوريسيبتورس أو كلاهما2،3. ومن المقدر أن الطفرات التي تؤثر على وجه التحديد RPE الخلايا 5 في المائة من البرنامج العادي2. أية أم دي شرط آخر حيث يتم تبديل طبقة RPE، فقدان الرؤية في نهاية المطاف إلى المركزية الرائدة. أية أم دي سببه التفاعلات المعقدة بين العوامل الوراثية والب....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

واستخدمت جميع المواد البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول وفقا للوائح الاتحاد الأوروبي. خط الخلية ES البشرية المستخدمة في هذه الدراسة مستقاة من جنينا فريدة من نوعها. أبلغت تماما الزوجين الذين تبرعت بالجنين وأعطت موافقتها لمنحه مجهول. كان خط خلية ES بشرية سريرية الصف المستمدة من هذه الأجنة وراهن والمؤهلين وموثقة بشكل صحيح قبل الخلايا روزلين (المملكة المتحدة). وتم شراء همس تحت ظروف معقمة أثناء قيصرية في الأمهات اللاتي وقعت موافقة واعية للتبرع المشيمة وفقا للمبادئ التوجيهية للمستشفى (أفب، مستشفى سانت لويس).

1-إعداد وسائل الإعلام الثقافة والكاشفات

  1. إعداد متوسطة الثقافة خلية RPE
    1. إعداد مستنبت الخلية RPE، إضافة ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

همس تحتوي على طبقة الظهارة التي ينبغي إزالتها قبل البذر RPE الخلايا. يتم تنفيذ علاج الأنزيمي للغشاء مع ثيرموليسين تحت تهتز. الترتيب إلا لعدم فقدان قطبية الغشاء (الظهارة على جانب واحد)، فثابتة على دعم التكوين التي يمكن أن تكون مختلفة اعتماداً على الموفر (الشكل 1A). فحص التصاق الغشاء لدعمه في هذه الخطوة وإضافة مقاطع إذا لزم الأمر. وقت التثبيت في إدراج الثقافة، العمل بعناية لتجنب أحداث فتحات في الغشاء والاحتفاظ به الأقطاب مع الغشاء مواجهة (ا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصفت لنا طريقة لاستزراع خلايا RPE على سقالة بيولوجية وإعداده لغرس في نماذج حيوانية. واحدة من الخطوات الحاسمة للبروتوكول هو الحفاظ على اتجاه هام على طول هذا الإجراء حتى إدراجه في الجيلاتين. في الواقع، تتم إزالة ظهارة الأصلي للغشاء وأن الغشاء يصبح عرضه9. الخلايا RPE يجب أن يكون المصنف على رأس هذا الغشاء. عند التحضير لتضمين الجيلاتين، من الأهمية بمكان للعمل مع جميع المنتجات عند درجة حرارة محددة. وفي الواقع، قد الجيلاتين الخاصية أن تكون جامدة في سائل في الجسم درجة الحرارة (37 درجة مئوية)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أوليفييه جورو هو المخترع في انتظار براءات الاختراع المتعلقة بتوليد خلايا الشبكية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية. ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلفين الآخرين.

شكر وتقدير

الكتاب يود أن يشكر جيروم لارغيرو وفاليري فانو (مستشفى سانت لويس، باريس، فرنسا) لمساهمتها أثناء إقامة للطريقة الموضحة هنا.

أيد منح مقدمة من وكالة الاستخبارات الوطنية هذا العمل [جبيبس: ANR-2010--RFCS005؛ سايتريبير: وكالة الاستخبارات الوطنية-16-CE17-008-02]، لوس أنجليس من أجل مؤسسة "بحوث ميديكال" [برنامج الهندسة الحيوية-DBS20140930777] ومن "أحياء لابيكس" [ANR-10-لابكس-73] "أوليفييه جورو" ومونفيل Christelle. أيده نيوراتريس، بحوث متعدية بنية أساسية (يشرف دعفينير) بيوثيرابيس في علوم الأعصاب [ANR-11-إينبس-0011] وإينجيستيم، البنية التحتية الوطنية (يشرف دعفينير) الشركة الهندسية ل pluripotent و المتمايزة الخلايا الجذعية [ANR-11-إينبس-000] إلى مونفيل ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خزانة السلامة الحيوية المعقمةTechGen Internationalغير قابلة للتطبيق
نظام التخلص من النفايات السائلة للشفطVacuubrandBVC 21
CO2< / sub>-controlled +37  ° حاضنة الخلايا CThermo Electron CorporationBVC 21 NT
200 & nbsp; ومايكرو. ماصة L: P200GilsonF144565
1   ؛ ماصة مل: P1000GilsonF144566
Pipet aidDrummond75001
+4  ° ثلاجة CLiebherrغير قابلة للتطبيق
VibratomeLeicaVT1000S
مقص ناعمWPI501758
ملقط (x2)WPI555227F
حمام مائيمنحة subaqua proSUB6
ميزان دقيقSartoriusCP225D
جهاز طردمركزيEppendorff5804
مجهرأوليمبوسSC30
شاكر هزاز أفقيIKA-WERKEIKA MTS 214D
دوامةVWRمختبر راقصة S40
مشرط يمكن التخلصWPI500351
فيلم البارافين البلاستيكيVWRPM992
0.200 & م مرشح حقنة للاستخدام الفرديSARTORIUS16532
حقنة بدون إبرة 50 ملDutscher50012
زجاجات 250 ملDutscher28024
15 مل أنابيب صقر معقمةDutscher352097
50 مل أنابيب صقر معقمةDutscher352098
إدراج ثقافةScaffdexC00001N
60  ملم زراعة الخلايا: B6Dutscher353004
12 لوحة ثقافة خلية جيدةCorning3512
لوحات ثقافة 6 آبارCorning3506
شفرات الحلاقةTed Pella، Inc121-9
Cyanoacrylate glueCastorama3178040670105
PBS 1x (500   مل)SigmaD8537
ThermolysineRoche5339880001
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، GlutaMAXInvitrogen61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)Invitrogen12618-013
MEM-NEAA (100x)Invitrogen11140-035
b-mercaptoethanol (50 & nbsp; م)Invitrogen31350-010
البنسلين / الستربتومايسينInvitrogen15140122
CO2< / sub>-independent المتوسطةGIBCO18045-054
الجيلاتينMERCK104078
الغشاء الأمنيوسي البشريبنك الأنسجة مستشفى سانت لويس (باريس ، فرنسا)غيرقابل للتطبيق
منه

المراجع

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الغشاء السلوي البشريهندسة الأنسجةاستزراع الخلاياالتضمين بالجيلاتينالتقطيع بجهاز الفيبراتومالزرع في الجسم الحيتحضير أنسجة الشبكيةالعلاج بالخلايا الجذعية