Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo de sequenciamento de próxima geração para sequenciação de rRNA 16S, que permite a identificação e caracterização das comunidades microbianas na vetores. Este método envolve a extração de DNA, amplificação e código de barras das amostras através de PCR, sequenciamento em uma pilha de fluxo e bioinformática para combinar dados de sequência de informação filogenética.
Abstract
Nas últimas décadas, as doenças transmitidas por vetores têm ressurgiu e expandiu-se em alarmantes taxas, causando considerável morbidade e mortalidade em todo o mundo. Eficazes e amplamente disponíveis vacinas estão faltando para a maioria destas doenças, necessitando o desenvolvimento de estratégias de mitigação da doença romance. Para este efeito, uma avenida promissora de controle da doença envolve alvejar o vetor microbiome, a comunidade de micróbios que habitam o vetor. O vetor microbiome desempenha um papel fundamental na dinâmica do patógeno, e manipulações da microbiome conduziram a vector reduzida abundância ou patógeno de transmissão por um punhado de doenças transmitidas por vetores. No entanto, traduzir esses achados em aplicações de controle da doença requer uma compreensão completa da ecologia microbiana do vetor, historicamente limitada pela tecnologia insuficiente neste campo. O advento da próxima geração de sequenciamento abordagens permitiu arranjar em sequência rápida, altamente paralela de diversas comunidades microbianas. Direcionamento do gene de rRNA 16S altamente conservada tem facilitado caracterizações de micróbios presentes dentro vetores sob diferentes condições ecológicas e experimentais. Esta técnica envolve a amplificação do gene 16S rRNA, barcoding amostra através do PCR, amostras de carregamento para uma célula de fluxo para sequenciamento, e se aproxima de Bioinformática para combinar dados de sequência com informação filogenética. Espécie ou identificação de gênero-nível para um elevado número de repetições normalmente pode ser alcançada através desta abordagem, evadir-se, assim, desafios de baixa detecção, resolução e saída de cultivo tradicional, microscopia ou coloração histológica técnicas. Portanto, esse método é well-suited para caracterizar o vector micróbios sob diversas condições, mas atualmente não pode fornecer informações sobre função microbiana, localização dentro do vetor, ou a resposta ao tratamento com antibióticos. Em geral, 16S sequenciamento de próxima geração é uma técnica poderosa para compreender melhor a identidade e o papel dos micróbios vetor na dinâmica da doença.
Introduction
O ressurgimento e a propagação de doenças transmitidas por vetores nas últimas décadas representam uma séria ameaça para a saúde global de humanos e animais selvagens. Vacinas eficazes estão faltando para a maioria dessas doenças, e os esforços de controle são prejudicados pela natureza biológica complexa de vetores e interações vetor-hospedeiro. Compreender o papel das interações microbianas dentro de um vetor na transmissão do patógeno pode permitir o desenvolvimento de novas estratégias que contornar estes desafios. Em particular, as interações entre os comensais microbianas associada a vector, simbiontes e patógenos, referidos como o microbiome, podem ter consequências importantes para a transmissão de agentes patogénicos. Evidência esmagadora agora oferece suporte a essa afirmação, com exemplos que demonstram uma ligação entre o vetor microbiome e competência para doenças como malária, vírus Zika e doença de Lyme1,2,3. No entanto, traduzir esses resultados em estratégias de controle de doenças requer uma compreensão mais detalhada da estrutura, função e origem do vetor microbiomes. Identificação e caracterização da comunidade microbiana vetor sob diferentes condições ecológicas e experimentais constituem um caminho importante para a frente neste campo.
Um procedimento para identificar os moradores microbianos de um vetor do patógeno é fornecido aqui, utilizando o Western nigripes carrapato, Ixodes pacificus, uma espécie de vetor do patógeno doença de Lyme Borrelia burgdorferi. Enquanto carrapatos abrigam mais tipos de patógenos humanos do que qualquer outros artrópodes, relativamente pouco é conhecido sobre a ecologia biologia e comunidade de carrapato microbiomes4. É evidente que os carrapatos abrigam um diversificado leque de vírus, bactérias, fungos e protozoários, que incluem comensais e endossimbiontes residentes microbiana transitória5,4. Trabalho prévio demonstrou fortes variações em Ixodes microbiomes associado com geografia, espécie, sexo, fase de vida e refeição de sangue fonte6,7,8. No entanto, os mecanismos subjacentes a esta variação permanecem desconhecidos e garantem que mais detalhadas investigações sobre a origem e o conjunto destas comunidades microbianas. Carrapatos podem adquirir micróbios através de transmissão vertical, contato com hosts e captação do ambiente através de espiráculos, boca e anal poro9. Compreender os fatores moldar a formação inicial e desenvolvimento de microbiome o carrapato, especificamente a contribuição relativa da transmissão vertical e ambiental, é importante para compreender os padrões naturais e variações na escala Microbiome diversidade e como essas comunidades interagem durante a transmissão do patógeno, com possíveis aplicações para controle de doença ou vetor.
Poderosas técnicas moleculares, tais como sequenciamento de próxima geração, agora existem para identificar comunidades microbianas e podem ser empregadas para caracterizar o vector microbiomes sob diversas condições ambientais ou experimentais. Antes do advento dessas abordagens de sequenciamento de alta produtividade, a identificação de micróbios baseou-se predominantemente na microscopia e cultura. Enquanto microscopia é uma técnica rápida e fácil, métodos morfológicos para a identificação de micróbios são inerentemente subjetivos e grosseiros e limitada pela baixa sensibilidade e deteção10. Métodos baseados em cultura são amplamente utilizados para identificação microbiana e podem ser usados para determinar a susceptibilidade de micróbios para tratamentos de drogas11. No entanto, esse método também sofre de baixa sensibilidade, como estima-se que menos de 2% dos micróbios ambientais podem ser cultivadas em um laboratório de configuração12. Abordagens de coloração histológicas também foi empregadas para detectar e localizar os micróbios específicos dentro de vetores, permitir investigações de várias distribuições de táxons dentro o carrapato e estudar hipóteses sobre as interações microbianas. No entanto, o conhecimento prévio da identidade microbiana é necessário para selecionando as manchas adequadas, fazendo com que esta abordagem inadequados para a identificação e caracterização microbiana. Além disso, a coloração histológica é um processo altamente demorada e trabalhoso e não se adapta bem para tamanhos de amostra grande. Abordagens moleculares tradicionais tais como Sanger sequenciamento da mesma forma são limitados em sua sensibilidade e a detecção de diversas comunidades microbianas.
Sequenciamento de última geração permite a identificação rápida de micróbios de um grande número de amostras. A presença de genes marcadores padrão e permite que mais de bancos de dados de referência avançada resolução taxonômica, frequentemente ao nível de gênero ou espécie. Pequena subunidade ribossomal RNAs são frequentemente usados para atingir esse objetivo, com 16S rRNA sendo os mais comuns devido à presença de regiões conservadas e variáveis dentro do gene, permitindo a criação de primers universais com amplicons exclusivo para cada bacteriana espécie de13,14. Este relatório detalha um procedimento para identificar táxons no carrapato microbiome através do sequenciamento de próxima geração do 16S rRNA. Em particular, este protocolo enfatiza as etapas envolvidas na preparação de amostras para sequenciamento. Mais generalizada de detalhes sobre o sequenciamento e bioinformática passos são fornecidos, como há uma variedade de plataformas de sequenciamento e análise programas atualmente disponíveis, cada um com extensa documentação existente. A viabilidade global desta abordagem de sequenciamento de nova geração é demonstrada por aplicá-lo a uma investigação do conjunto da comunidade microbiana dentro de um vetor de doença chave.
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Protocol
1. assinale a coleção e a esterilização de superfície
- Coletar carrapatos arrastando um pano2 branca de 1 m sobre um habitat carrapato associada, remoção de carrapatos anexado para espécies de hospedeiros, ou criação de carrapatos, no laboratório15,16. Use pinça fina para manipular carrapatos e armazená-los a-80 ° C.
- Coloque carrapatos em tubos de PCR individuais e remover contaminantes superficiais vortexing por 15 s sucessivamente com 500 μL de peróxido de hidrogênio (H2O2), 70% de etanol e ddH2O.
- Coloque os carrapatos em um novo tubo PCR e deixe-os secar ao ar livre.
- Neste tubo, mecanicamente romper tecidos carrapato, esmagando os carrapatos com um almofariz e um pilão (utilizado neste estudo), usando pequenos grânulos em um batedor do grânulo, ou cortar o carrapato com um bisturi.
2. purificação de DNA
- Purifica o DNA de carrapatos individuais, seguindo as instruções fornecidas em um kit de extração de DNA disponível comercialmente. Eluir para um volume final de 100 μL.
Nota: Consulte a Figura 1 para obter uma visão geral das etapas 2.2-2.8. Métodos de extração alternativos incluem o fenol-clorofórmio extração17,18, etanol precipitação19ou extração com um quelante de material20,21. - Confirme o sucesso da purificação de DNA usando um dados ou Espectrofotômetro. Para fluorometry, use 10 μL de modelo de DNA em um ensaio de DNA dupla-hélice μL 190. O rendimento esperado é de 0,1-1,0 ng/μL22. Por espectrofotometria, use 1 μL do modelo de DNA em uma quantificação de ácido nucleico. A relação de A260/280 esperada é aproximadamente 1.823.
- Se não proceder imediatamente à amplificação, armazenar as amostras a-20 ° C.
3. 16S rRNA Gene amplificação
- Configurar o amplicon PCR, em uma reação de 27,5 μL contendo: 5 μL de cada primer em 1 μM; 12,5 μL de mistura PCR disponível comercialmente; e 5 μL de DNA extraído de carrapatos individuais em uma concentração de 5 ng/μL.
Nota: Use os seguintes primers para amplificação da região hipervariável V3-V4 do 16S rRNA gene13:
5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3',
5' - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3' - Mover os tubos para um thermocycler programado para: uma desnaturação inicial a 95 ° C por 3 min; 25 ciclos de 1) 95 ° C por 30 s, 2) 57 ° C por 30 s, 3) 72 ° C por 30 s; uma extensão final a 72 ° C por 5 min; e uma preensão final a 10 ° C.
- Uma vez que a PCR é feito, visualize o produto PCR por 4-6 μL/amostra em um gel de agarose 1,5% de carregamento. Procure por uma banda em 460 bp para confirmar a amplificação.
Nota: Produto Amplicon PCR pode não ser visível no gel se a concentração da amostra é muito baixa (< 10 ng). Presença de dímero da primeira demão é comum em amostras de baixa concentração. Se outras bandas não-alvo estão presentes, ajustar a temperatura do recozimento ou diminuir o número de ciclos. - Se não proceder imediatamente à purificação, armazenar as amostras em 4 ° C.
4. 16S Amplicon purificação
- Usando um novo tubo PCR para cada amostra, aliam ddH2O para obter total 60 μL do produto do PCR. Para amostras com baixas concentrações de DNA, execute amplicon PCR em triplicado para reduzir o viés de amplificação e piscina as amostras para se concentrar.
- Trazer contas paramagnéticos à temperatura ambiente e vórtice-los bem antes de usar.
- Adicionar 48 μL de grânulos paramagnéticos para 60 μL da amostra e incubar durante 5 min. do lugar os tubos em um rack magnético por 5 min até a solução torna-se claro. Remova o sobrenadante.
Nota: Esta concentração do grânulo destina-se a remoção do dímero da primeira demão (< 60 bp). Se necessário, ajuste a concentração de grânulo para remover outras bandas inespecíficas. - Com tubos em rack magnético, adicionar 500 μL de 80%, recém-preparado EtOH. Imediatamente após a adição de EtOH para todos os tubos, pipete para fora o líquido. Não remova os grânulos. Repeti a adição de EtOH e remoção mais uma vez.
- Secar as amostras para remover o excesso EtOH deixando os tubos aberto sobre o rack magnético por 5 min, ou até pequenas rachaduras são visíveis em grânulos.
- Adicionar 20 μL de tampão TE e incubar as amostras fora do ímã, à temperatura ambiente, durante 5-10 min.
- Coloque os tubos volta sobre o ímã. Uma vez que os grânulos e líquidos são separados, transfira o sobrenadante para um tubo fresco para obter o produto do PCR limpo.
- (Opcional) Visualize o produto para confirmar o sucesso amplicon purificação por 4-6 μL/amostra em um gel de 1,5% de carregamento. A banda de bp 460 deve ser visíveis, e não deve haver nenhum dímero da primeira demão.
- Se não avançar imediatamente para o índice do PCR, armazenar as amostras de 4 ° C.
5. código de barras e purificação da amostra
- Atribua combinações de primeira demão única para cada amostra, selecionando as primeiras demão ou avanço ou retrocesso, ou ambos, de um kit de índice de biblioteca disponíveis comercialmente.
Nota: Excepcionalmente etiquetar amostras permite a diferenciação após o sequenciamento. Kits normalmente fornecem suficiente cartilhas para sequenciar 96-384 amostras. - Anexe as primeiras demão duplas, ou índices, para amostras através da realização de PCR em uma reação de 25 μL contendo 2,5 μL de cada primer (N7xx e S5xx), 12,5 μL de comercialmente disponível mistura mestre PCR, 5 μL de DDQ2O e 2,5 μL de produto amplicons limpos.
- Mover os tubos para um thermocycler programado para: uma desnaturação inicial a 95 ° C por 3 min; 8-14 ciclos de 1) 95 ° C por 30 s, 2) 55 ° C por 30 s, 3) 72 ° C por 30 s; uma extensão final a 72 ° C por 5 min; e uma preensão final a 10 ° C.
- Uma vez que a PCR é feito, visualize o produto PCR por 4-6 μL/amostra em um gel de agarose 1,5% de carregamento. Procure por uma banda em 550 bp para confirmar a amplificação.
Nota: Use os resultados de visualização para informar condições de ciclismo índice do PCR. Diminuir a contagem de ciclo inespecificas de atenuar ou aumentar a contagem de ciclo para obter bandas visíveis para cada amostra. - Repita o procedimento de limpeza listado na etapa 4. Para evitar a diluição durante a limpeza, executar índice PCR em duplicado e piscina do produto aqui.
- Se não proceder imediatamente à quantificação da biblioteca e normalização, armazenar as amostras em 4 ° C.
6. normalização e quantificação de biblioteca
- Estimar a concentração de cada produto purificado, do código de barras da etapa 5.5 usando um dados ou espectrofotômetro (consulte a etapa 2.2). Dilua as amostras no buffer de TE para obter concentrações de aproximadamente 13:00.
Nota: A quantificação da biblioteca é necessária para atingir a amostra concentração recomendada para a plataforma de sequenciamento de carregamento. Quantificação de biblioteca é conseguida através de qPCR, mas estimar a concentração da amostra antes da qPCR economiza tempo e reagentes. A concentração de 13:00 é recomendada para aumentar a precisão de quantificação de biblioteca, pois esta é a concentração média dos padrões de qPCR fornecidos no kit quantificação24. - Execute qPCR em uma reação de 10 μL contendo 6,0 μL de mistura de mestre qPCR (do kit de quantificação de biblioteca) e 2.0 μL de DDQ2O 2.0 μL da amostra ou padrão. Execute cada amostra e padrão em triplicado para maior precisão e rigor. Executar cada amostra em três ou mais níveis de diluição (ex., 12:01, 1 pm e 22:00 para as concentrações inicial estimadas) para garantir a exata quantificação.
Nota: Informações detalhadas sobre as normas e as primeiras demão fornecidas irá variar com baseadas no kit quantificação usado e estão disponíveis na folha de dados técnicos de produtos. Consulte a Tabela de materiais para o kit de quantificação utilizado neste estudo. - Mover a placa qPCR ou tubos para um instrumento PCR em tempo real programado para: uma desnaturação inicial de 95 ° C por 5 min; 35 ciclos de 1) 95 ° C por 30 s e 2) 60 ° C durante 45 s; e um passo de dissociação de 1) 95 ° C por 15 s, 2) 60 ° C por 30 s e 3) 95 ° C por 15 s.
- Calcule a média começa a concentração para cada amostra, usando os valores de quantificação obtidos a partir dos resultados de qPCR e os níveis de diluição de amostra utilizados.
Nota: por exemplo, uma concentração média de 14:00 para uma amostra diluída 1: 100.000 produz uma concentração inicial original de 200 nM. Se nenhum dos níveis de diluição para uma determinada amostra cai dentro do intervalo das curvas padrão, resultados de quantificação podem não ser precisos; Nesse caso, ajustar os níveis de diluição e re-executar qPCR. - Diluir cada amostra de código de barras purificada, a 4 nM no buffer de TE, com base nas concentrações médias calculadas no passo 7.5.
Nota: por exemplo, para uma concentração da amostra média de 200 nM, diluir a amostra 01:50 em TE buffer para obter uma concentração de nM a 4. A concentração de amostra precisa pode variar com base no kit de sistema e reagente de sequenciamento usado. Consulte o guia de usuário de sistema de sequenciamento para a concentração recomendada. - Crie a biblioteca combinada adicionando volumes iguais (tipicamente 5-10 μL) de todas as bibliotecas individuais em um único tubo.
Nota: como todas as amostras devem ser em uma concentração de nM 4, adicionar volumes iguais alcança uma concentração igual de todas as amostras na biblioteca em pool. - Repita as etapas de 6.2-6.4 na biblioteca combinada para confirmar a concentração de nM a 4.
- Calcular a concentração de biblioteca combinada e diluir ou reconstituir a biblioteca final, agrupada usando tampão Tris conforme necessário para conseguir 4 nM.
- Se não proceder imediatamente à carga de amostra, armazenar as amostras a-20 ° C. Realize o sequenciamento executado logo após quantificação para minimizar a perda ou alterações de concentração de DNA durante o armazenamento.
7. Biblioteca desnaturação e diluição e sequenciamento execute (executar no mesmo dia)
- Desnature a 4 nM biblioteca combinada da etapa 6,9 com NaOH.
Nota: Estas etapas de preparação final biblioteca variam para cada sistema de sequenciamento. Consulte o guia de usuário do sistema de sequenciamento para protocolos mais detalhados e atualizados. Novos usuários provavelmente precisará ser treinados sobre o uso da plataforma de sequenciamento, ou podem enviar suas bibliotecas para uma facilidade de sequenciamento do núcleo. - Dilua a biblioteca desnaturada para a concentração desejada de carregamento usando o buffer fornecido no kit de reagente de sequenciamento (Tabela de materiais).
Nota: Concentrações de carregamento ideal variam de acordo com o sistema de sequenciamento e, normalmente, variam de 1-250 pM25. - Desnaturar e diluir o controle de sequenciamento.
Nota: Adicionar um controle de sequenciamento corrige para questões de sequenciamento decorrentes das bibliotecas de baixa diversidade. Desnaturar o controle de sequenciamento utilizando NaOH e diluir a mesma concentração que a biblioteca. - Combine a biblioteca e o controle de sequenciamento.
Nota: A relação do controle de sequenciamento para biblioteca combinada dependerá a diversidade da biblioteca e sistema de sequenciamento usado, mas é normalmente de 1:126. - Carrega a biblioteca combinada e mistura de controle de sequenciamento para a célula de fluxo de sequenciamento.
8. análise de sequência Amplicon
- Avalie o sucesso global da execução examinando as métricas de execução sobre o ambiente de computação de nuvem correspondente para o sistema de sequenciamento usado.
Nota: As métricas de execução, tais como o número de leituras de sequenciamento, irão variar com base no sequenciamento kit plataforma e reagente utilizado. Valores-alvo para sistemas comuns de sequenciação estão listados na tabela 1. - Baixar os dados brutos de sequenciamento e bioinformática desejada software open source, quantitativos Insights sobre ecologia microbiana (QIIME)27 ou Mothur28.
Nota: Os dois QIIME e Mothur são código-fonte aberto e livre para fazer o download. Instruções detalhadas sobre como usar esses programas podem ser encontradas on-line em são suficientemente detalhadas para usuários de primeira viagem. As etapas a seguir fornecem uma visão ampla de um pipeline de bioinformática, realizado em QIIME. Familiaridade com o python não é necessária, mas irá facilitar a implementação dos seguintes scripts - Criar e validar o arquivo de mapeamento usando o script "validate_mapping_file.py" no QIIME.
Nota: O arquivo de mapeamento contém todos os metadados necessários para realizar a análise de dados, incluindo identificação de amostra, sequências de amplicons da primeira demão e descrição da amostra. A etapa de validação verifica que todos os dados necessários tenham sido inscritos no formato adequado. - Demultiplex e filtrar sequências usando o script "split_libraries.py" (Figura 1).
Nota: Este script atribui leituras de código de barras para amostras com base em combinações de primeira demão o índice e IDs de amostra de entrada no arquivo de mapeamento. Ele também realiza qualidade várias medidas para controle do sequenciamento do erro baseado em definido pelo usuário de madeira cortada para Pontuação de qualidade mínima, comprimentos de sequência e final-aparamento de filtragem. - Atribua unidades taxonômicas operacionais (OTUs) sequências usando o script "pick_open_references_otus.py".
Nota: Nesta etapa, as sequências são agrupadas contra uma coleção de sequência de referência com base em um limite de identidade (normalmente 97%). Leituras que não coincidem com a coleção de sequência de referência são agrupadas um contra o outro. De novo e fechado-referência OTU escolher opções também estão disponíveis, mas abrir-referência colheita recomenda-se pelos desenvolvedores do QIIME. - Normalize a tabela OTU usando o script "alpha_rarefaction.py" ou "normalize_table.py".
Nota: Este passo corrige para variação em somas de coluna, ou total sequência lê por amostra, que resultam de tecnologias modernas de sequenciamento. Normalização pode ser executada usando a rarefação tradicional, ou através de métodos alternativos tais como dimensionamento de soma cumulativa. - Execute várias diversidade alfa, beta-diversidade e análises de diversidade de composição taxonômica de uma vez usando o script "core_diversity_analysis.py".
Nota: Em alternativa, estas análises podem ser executadas separadamente usando os scripts individuais (por exemplo, "alpha_diversity.py").
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Representative Results
Um total de 42 tiques de ovo separado três embreagens e dois períodos de exposição ambiental, 0 e 2 semanas no solo, foram processados para microbiome sequenciamento. Cada grupo de tratamento, considerado uma única vez de embreagem e exposição, contida 6-8 Replicar amostras de carrapato. Estes extratos de carrapato processados foram carregados de um sequenciador de última geração e renderam 12,885,713 leituras emparelhado-fim, passando o filtro. Incluído neste prazo foram 3 controles negativos da etapa de extração, rendendo um total de 211.214 leituras (incluído na contagem anterior). Ainda mais, métricas de qualidade de execução, juntamente com os valores ideais para cada métrica são detalhadas na tabela 2. Curvas de rarefação, que relacionam número de OTUs, por exemplo, indicado que uma profundidade de sequenciamento, ou o número de sequência única lê por exemplo, de 2.129 leituras seria suficiente para capturar adequadamente a diversidade da comunidade microbiana (esforço de sequenciamento A Figura 2). Níveis de rarefação irão variar com baseados no tipo de amostra e devem ser determinados individualmente para cada sequência de executar. Depois rarefação nesta profundidade, 1.714 OTUs foram identificados através de todas as amostras com uma média de 93,3 OTUs ± 4.3 por amostra. Para evitar a jusante análise questões decorrentes de matrizes esparsas e remover contaminantes potenciais, todos OTUs não encontrados pelo menos uma amostra em ≥ 1% de abundância foram agrupados em uma categoria geral rara. Além disso, o pacote decontam em R foi utilizado para identificar o OTUs sobre-representados em controles negativos em relação a amostras reais, e estes OTUs foram retirados da análise a jusante.
Análises de ecologia de Comunidade foram realizadas usando o fluxo de trabalho análises de diversidade QIIME para demonstrar os tipos de diversidade alfa, beta diversidade e saída de diversidade de composição taxonomia gerada usando um pipeline de Bioinformática simples. Por exemplo, ponderadas e não ponderadas Unifrac coordenadas principais análises foram produzidas usando o script "core_diversity_analyses.py", e eles revelaram aglomeração espacial de tiques larvas, com base na identidade de embreagem (Figura 3). Boxplots de OTU conta em diferentes exposição ambiental vezes também foram gerados através deste script, demonstrando diferenças na riqueza de espécies de microbiome ao longo do tempo (Figura 4). Essas análises de diversidade alfa e beta são executadas com base nas categorias definidas pelo usuário listadas no arquivo de mapeamento, mas números e estatísticas sobre informação taxonômica geral também são geradas para todas as amostras (Figura 5).
Figura 1 : Fluxo de trabalho de sequenciamento Microbiome. Principais etapas do fluxo de trabalho de sequenciamento de microbiome são exibidas com call-outs para as etapas de análise de preparação e sequenciamento de biblioteca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Curvas de rarefação para sequência contam normalização. Curvas de rarefação, mostradas para cada coorte de tiques, relacionam observadas contagens OTU esforço de amostragem. Barras de erro estão presentes devido a amostras presentes dentro de cada embreagem, e eles indicam um desvio padrão. Uma profundidade de sequenciamento deve ser selecionada em ou para além do ponto onde a curva torna-se estável para capturar adequadamente a diversidade cheia de OTUs. Aqui, uma profundidade de sequenciamento de 2.000 leituras afigura-se adequada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Diretor coordenar análise por embreagem. Não ponderada Unifrac análise coordenada principal (PCoA) mostra a variação na composição de microbiome entre carrapatos larvas diferentes garras e dos adultos. Cada ponto de dados denota um carrapato individual. Esta figura é gerada automaticamente através do script de "core_diversity_analyses.py" de QIIME. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Boxplots de diversidade alfa pelo tempo de exposição. Boxplots retratando OTU conta para exposição ambiental Grupos mostrar variação na diversidade microbiana ao longo do tempo. Esta figura é gerada automaticamente através do script de "core_diversity_analyses.py" de QIIME. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Identificação microbiana de filo-nível para embreagem um. Composição de Microbiome para amostras individuais carrapato de embreagem um é mostrada no nível de filo. Esta figura, bem como informações de resumo em níveis taxonômicos inferiores, é gerado automaticamente através do script de "core_diversity_analyses.py" de QIIME. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Métrica | Definição | Nossos resultados (MiSeq V3) | Ideal para MiSeq V3 | Ideal para o modo de HiSeq rápida | |
| Lê PF | Número de sequenciamento lê passando o filtro de castidade. Uma leitura passa filtro, se não mais do que 1 chamada base tem um valor de castidade abaixo de 0,6 nos primeiros 25 ciclos | 12,885,713 | 14 milhões | 600 milhões | |
| Taxa de erro | Porcentagem de pares de base chamado incorretamente durante um ciclo, com base em leituras alinhado ao controle PhiX | ±0.10 3.28 | * Depende de valores para outras métricas | * Depende de valores para outras métricas | |
| % ≥Q30 | Percentagem das bases com um Q escore ≥ 30, indicando uma base chamada precisão de 99,9% | 68,94 | > 70% | > 80% | |
| Cluster de PF (%) | Percentagem de clusters passando o filtro de castidade. | ±0.81 85.61 | 90% | 90% | |
| Densidade | Densidade de clusters na célula de vazão - uma métrica chave para a qualidade de dados e saída | aglomerado de ± 35 552/mm ^ 2 | aglomerado de 1200-1400/mm ^ 2 | 850-1000 cluster/mm ^ 2 | |
Tabela 1: Chave de parâmetros de desempenho para a saída NGS. Valores de dados e destino do usuário informou com base sobre o kit de sequenciamento plataforma e reagente utilizado no presente estudo (Tabela de materiais) e uma adição de controle de sequenciamento de 25%.
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Discussion
Próxima geração sequenciamento de 16S rRNA tem tornar-se uma abordagem padrão para identificação microbiana e permitiu o estudo de como vetor microbiomes afetar a transmissão do patógeno. O protocolo descrito aqui detalha o uso desse método para investigar o conjunto da comunidade microbiana em I. pacificus, uma espécie de vetor para a doença de Lyme; no entanto, pode facilmente ser aplicado para estudar outras espécies de carrapato ou espécies de artrópodes vetores.
Com efeito, sequenciação de rRNA 16S para análise microbiome tem sido usada amplamente para estudar a microbiomes de vetores incluindo psilídeos, mosquitos e moscas tsé-tsé29,30,31. Outros métodos disponíveis para identificação microbiana dentro vetores incluem microscopia, cultivo e coloração histológica. Estes métodos podem ser mais apropriados do que se o objetivo é identificar e descrever um micróbio romance (microscopia), avaliar o efeito de drogas antimicrobianas (cultura) ou localizar micróbios específicos e conhecidos dentro do vetor (coloração histológica) de sequenciamento. No entanto, estes métodos sofrem de escalabilidade, detecção e baixa especificidade e, portanto, são menos apropriados para identificar toda a comunidade de micróbios dentro de um vetor ou caracterizando o vetor microbiome sob diferentes ecológica e experimental condições. Por outro lado, elevado-throughput sequenciamento do gene 16S rRNA permite a identificação de bactérias de baixa abundância e não-viáveis, fornece a alta resolução e deteção dado os bancos de dados de referência global e pode fornecer alta replicação dependendo nas necessidades de cobertura.
Enquanto a sequenciação de rRNA 16S agora é amplamente utilizada para identificação microbiana, essa técnica não é sem limitações. Principalmente, a contaminação microbiana pode obscurecer a interpretação dos resultados do sequenciamento e confundir significado biológico32. Além disso, dado o uso de primers bacterianas universais e sensibilidade para baixo a partir de concentrações que são inerentes ao sequenciamento de 16S rRNA, contaminação microbiana é comum32. Fontes de contaminação incluem reagentes da PCR, kits de extração de DNA, superfícies de laboratório e a pele e roupa de pesquisadores33,34,35. Os efeitos de contaminantes microbianos podem ser minimizados por trabalhar em um ambiente de laboratório estéril, usando controles negativos e repetições de técnicas, e manter um registro de todos os kits e reagentes utilizados36.
Além de contaminação microbiana, saída de sequenciamento de baixa qualidade pode dificultar muito a usabilidade de microbiome dados de sequenciamento. Qualidade dos dados pode ser avaliada por um número de métricas execução, incluindo o número de leituras, passando de filtro, a percentagem de leituras acima Q-placar (uma medida da probabilidade de erro em chamada de base prevista) de 30 e a densidade do aglomerado. Valores para essas métricas irão variar com base no número de amostras a executar, o sistema de sequenciamento, o cartucho de reagente e a porcentagem de sequenciamento de controle usado, mas valores ótimos, com base nas condições de execução estão disponíveis online. Em particular, a densidade do aglomerado, o número de clusters de biblioteca em um dado plano da célula de fluxo antes de sequenciamento, é um parâmetro chave para otimizar o rendimento e a qualidade dos dados. Tanto sobre e sob-clustering podem reduzir a produção de dados e resultar em amostras sendo excluídas da análise devido à cobertura insuficiente. Densidade do aglomerado pobre muitas vezes reflete a quantificação de biblioteca imprecisas; assim, deve-se ter cuidado para realizar adequada DNA limpar, quantificação da amostra individual e quantificação de biblioteca inteira.
Supondo que o rendimento e dados de alta qualidade são alcançados, abordagens divergentes na análise de dados usada para superar desafios estatísticos de grandes conjuntos de dados representam outra limitação dessa abordagem. Por exemplo, vários métodos existem para variação de endereço em contagens de leitura entre as amostras. Rarefação, que envolve a sub amostragem leituras para alcançar uma profundidade de sequenciamento igual em todas as amostras, é frequentemente utilizada, mas tem sido objecto de crítica recentemente por desperdiçar grandes quantidades de dados e a seleção subjetiva de profundidade mínima de sequenciamento37 ,38,39. Soma cumulativa dimensionamento (CSS), que mantém todas as sequência lê mas pesa-los com base na soma cumulativa dos Condes dentro de um determinado percentil, desenvolveu-se como uma técnica alternativa. No entanto, CSS não foi amplamente adotada devido à sua relativa novidade e o utilitário confirmado de rarefação para Normalização antes da análise de presença/ausência.
Também são falta de procedimentos de análise de dados padrão para manipulação de sequência de leituras em controles negativos e distinguir estas de leituras de baixa abundância. Como mencionado, controles negativos gerados a partir da etapa de extração de DNA de sequenciamento é recomendada para ajudar a diferenciar residentes de microbiome verdadeiro vetor de contaminantes microbianos durante a análise. Ainda, uma abordagem padrão e estatisticamente rigorosa para identificar e filtrar contaminantes suspeitos está faltando. É uma abordagem comum para remover OTUs presentes nos controles negativos de todas as amostras. No entanto, esse método pode ser excessivamente conservadora, desde que muitos destes micróbios provavelmente se originam de amostras reais, ao invés de reagentes do kit40. Outra técnica comum envolve agrupamento micróbios presentes na < 1% em uma categoria "rara" sob a suposição de que contaminantes microbianos são raros em amostras reais8,41. No entanto, esse método pode remover micróbios verdadeiro vetor que estão presentes em baixas abundâncias, particularmente quando a microbiome é dominado por um endossibionte como visto em I. pacificus e I. holocyclus7,42. Nestes casos, detectar micróbios raros exigiria mais profundo sequenciamento, desenvolvendo as primeiras demão que inibem a amplificação da endossimbiose durante o amplicon PCR42ou computacionalmente, removendo a endossimbiose durante a análise da sequência 7. selecionando entre os diversos métodos para endereço raro e contaminante OTUs cria a oportunidade para a subjetividade e viés na análise de dados microbiome, que pode limitar a capacidade de comparar resultados através de estudos.
A escolha da base de referência, necessário para a atribuição de taxonomia e informação filogenética a sequência de leituras, apresenta outra oportunidade para divergência e subjetividade. Enquanto a tarefa de se relacionar sequência leituras de uma região variável gene um genoma identificados pai é inerentemente um desafio, um banco de dados confiável referência é crucial para atribuição filogenética exata. Vários bancos de dados surgiram para enfrentar esse desafio, como SILVA43, Greengenes44, RDP45e NCBI46. SILVA é a maior das taxonomias 16S-baseado, mas SILVA, bem como RDP, apenas fornece informação taxonômica até ao nível de gênero. Greengenes fornece informações de nível de espécies e está incluído nos pacotes de análises de metagenomic como QIIME, mas ele não foi atualizado em mais de quatro anos. NCBI, enquanto não uma fonte principal de informações taxonômicas, fornece classificações atualizadas diárias de sequências enviados pelo usuário, mas é uncurated. Enquanto a seleção entre os bancos de dados normalmente depende de necessidades dos usuários em relação a resolução, cobertura e moeda, tem um impacto significativo na atribuição filogenética e análise a jusante47,48. Consenso entre investigadores sobre qual banco de dados de referência para usar assim, é imperativo para evitar viés adicionais nas análises.
Abordagens padrão para esses desafios de processamento de dados provavelmente irão emergir como sequenciamento de 16S rRNA, torna-se uma técnica cada vez mais comum. Continuou reduções nos custos de sequenciamento e tempo mais irão popularizar este método. O maior uso desta tecnologia permitirá mais profundas investigações sobre a composição e a ecologia do vetor microbiomes sob diversas condições. Como o conhecimento da biologia de microbiome vector está ainda em sua infância, estes tipos de estudos descritivos são um primeiro passo crítico anteriores tentativas para alavancar a microbiome como um meio de controle de vetor. No entanto, para compreender verdadeiramente o papel da microbiome na transmissão do patógeno, identificação microbiana deve ser combinada com o conhecimento do papel funcional destes micróbios. A sequenciação do ARN e abordagens transcriptomic, que envolvem o mapeamento e quantificação de expressão gênica, permitem inferências sobre o papel funcional de micróbios mas exigem sequenciamento profundo e completamente montado genomas de espécies-alvo. Contornar estes desafios, ferramentas computacionais para predizer a composição funcional de 16S rRNA, dados de sequenciamento recentemente têm sido desenvolvidos, mas não são amplamente adotados ainda49. O desenvolvimento de tais ferramentas, bem como a teoria ecológica, ligando a identidade microbiana e o papel funcional dentro de vetores irá aumentar a utilidade dos dados de sequenciação de rRNA 16S em estudos de microbiome vector.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation concede a A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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