Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo de sequenciamento de próxima geração para sequenciação de rRNA 16S, que permite a identificação e caracterização das comunidades microbianas na vetores. Este método envolve a extração de DNA, amplificação e código de barras das amostras através de PCR, sequenciamento em uma pilha de fluxo e bioinformática para combinar dados de sequência de informação filogenética.

Resumo

Nas últimas décadas, as doenças transmitidas por vetores têm ressurgiu e expandiu-se em alarmantes taxas, causando considerável morbidade e mortalidade em todo o mundo. Eficazes e amplamente disponíveis vacinas estão faltando para a maioria destas doenças, necessitando o desenvolvimento de estratégias de mitigação da doença romance. Para este efeito, uma avenida promissora de controle da doença envolve alvejar o vetor microbiome, a comunidade de micróbios que habitam o vetor. O vetor microbiome desempenha um papel fundamental na dinâmica do patógeno, e manipulações da microbiome conduziram a vector reduzida abundância ou patógeno de transmissão por um punhado de doenças transmitidas por vetores. No entanto, traduzir esses achados em aplicações de controle da doença requer uma compreensão completa da ecologia microbiana do vetor, historicamente limitada pela tecnologia insuficiente neste campo. O advento da próxima geração de sequenciamento abordagens permitiu arranjar em sequência rápida, altamente paralela de diversas comunidades microbianas. Direcionamento do gene de rRNA 16S altamente conservada tem facilitado caracterizações de micróbios presentes dentro vetores sob diferentes condições ecológicas e experimentais. Esta técnica envolve a amplificação do gene 16S rRNA, barcoding amostra através do PCR, amostras de carregamento para uma célula de fluxo para sequenciamento, e se aproxima de Bioinformática para combinar dados de sequência com informação filogenética. Espécie ou identificação de gênero-nível para um elevado número de repetições normalmente pode ser alcançada através desta abordagem, evadir-se, assim, desafios de baixa detecção, resolução e saída de cultivo tradicional, microscopia ou coloração histológica técnicas. Portanto, esse método é well-suited para caracterizar o vector micróbios sob diversas condições, mas atualmente não pode fornecer informações sobre função microbiana, localização dentro do vetor, ou a resposta ao tratamento com antibióticos. Em geral, 16S sequenciamento de próxima geração é uma técnica poderosa para compreender melhor a identidade e o papel dos micróbios vetor na dinâmica da doença.

Introdução

O ressurgimento e a propagação de doenças transmitidas por vetores nas últimas décadas representam uma séria ameaça para a saúde global de humanos e animais selvagens. Vacinas eficazes estão faltando para a maioria dessas doenças, e os esforços de controle são prejudicados pela natureza biológica complexa de vetores e interações vetor-hospedeiro. Compreender o papel das interações microbianas dentro de um vetor na transmissão do patógeno pode permitir o desenvolvimento de novas estratégias que contornar estes desafios. Em particular, as interações entre os comensais microbianas associada a vector, simbiontes e patógenos, referidos como o microbiome, podem ter consequê....

Protocolo

1. assinale a coleção e a esterilização de superfície

1. Coletar carrapatos arrastando um pano² branca de 1 m sobre um habitat carrapato associada, remoção de carrapatos anexado para espécies de hospedeiros, ou criação de carrapatos, no laboratório^15,16. Use pinça fina para manipular carrapatos e armazená-los a-80 ° C.
2. Coloque carrapatos em tubos de PCR individuais e remover contaminantes superficiais vortexing por 15 s sucessivamente com 500 μL de peróxido de hidrogênio (H₂O₂), 70% de etanol e ddH₂O.
3. Coloque os carrapatos em um novo tubo P....

Resultados

Um total de 42 tiques de ovo separado três embreagens e dois períodos de exposição ambiental, 0 e 2 semanas no solo, foram processados para microbiome sequenciamento. Cada grupo de tratamento, considerado uma única vez de embreagem e exposição, contida 6-8 Replicar amostras de carrapato. Estes extratos de carrapato processados foram carregados de um sequenciador de última geração e renderam 12,885,713 leituras emparelhado-fim, passando o filtro. Incluído neste prazo foram 3 controles nega.......

Discussão

Próxima geração sequenciamento de 16S rRNA tem tornar-se uma abordagem padrão para identificação microbiana e permitiu o estudo de como vetor microbiomes afetar a transmissão do patógeno. O protocolo descrito aqui detalha o uso desse método para investigar o conjunto da comunidade microbiana em I. pacificus, uma espécie de vetor para a doença de Lyme; no entanto, pode facilmente ser aplicado para estudar outras espécies de carrapato ou espécies de artrópodes vetores.

Com efeito, seque.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
	Nome do item do material/equipamento	Catálogo da empresa	#
	DNeasy Blood & Kit de Tecidos	Qiagen	69504
2	Qubit 4 Fluorômetro	ThermoFisher Scientific	Q3326
3	NanoDrop 8000 Espectrofotômetro	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP beads	Agen Court	A63880
6	Rack Magnético	ThermoFisher Scientific	MR02
6	TE buffer	Teknova	T0223
7	Nextera Index Kit	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA Library Quantification Kit	Roche	KK4824
9	MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001
11	10 mM Tris-HCl com 0,1% Tween 20	Teknova	T7724

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