Modification des vecteurs d’Expression Baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte

Résumé

Nous présentons ici les protocoles utilisant les insectes cellulaire et baculovirus protein expression pour produire de grandes quantités de protéines végétales sécrétée de cristallisation de protéines. Un vecteur d’expression baculovirus a été modifié par GP67 ou peptide signal hemolin insectes pour expression plante de sécrétion des protéines dans des cellules d’insecte.

Résumé

Il a été un défi pour les scientifiques exprimer les protéines eucaryotes sécrétoires recombinantes pour les études structurales et biochimiques. Le système d’expression baculovirus insectes cellulaire est l’un des systèmes utilisés pour exprimer les protéines sécrétoires eucaryotes recombinantes avec quelques modifications post-traductionnelles. Les protéines sécrétoires doivent être acheminés à travers les voies sécrétrices de la glycosylation des protéines, la formation de liaisons disulfure et autres modifications post-traductionnelles. Pour améliorer l’expression cellulaire insectes existants des protéines végétales sécrétoire, un vecteur d’expression baculovirus est modifié par l’ajout de soit un GP67 ou une séquence de peptide signal de hemolin entre le promoteur et le clonage de plusieurs sites. Ce système nouvellement conçu vecteur mis à jour le produit avec succès un rendement élevé de protéines réceptrices plante sécrétées recombinantes solubles d’Arabidopsis thaliana. Deux des protéines végétales exprimées, les domaines extracellulaires de récepteurs de la membrane plasmique d’Arabidopsis TDR et PRK3, ont été cristallisés pour les études de diffraction des rayons x. Le système mis à jour le vecteur est un outil amélioré qui est potentiellement utilisable pour l’expression de protéines recombinantes de sécrétion dans le règne animal ainsi.

Introduction

Il est impératif pour un laboratoire de recherche être capable de produire de grandes quantités de protéines recombinantes homogènes pour les caractérisations biochimiques et biophysiques, surtout pour les études de diffraction des rayons x. Il existe plusieurs systèmes d’expression hétérologue bien établies telles que Escherichia coli, levure, cellules d’insectes, des cellules de mammifères, les cellules végétales, etc. , parmi eux, le système d’expression baculovirus insectes cellulaire est un des plus couramment utilisé des techniques pour produire de grandes quantités de structurellement pliés grosses eucaryotes protéines recombinantes pour la cr....

Protocole

NOTE : Un système de cellule/baculovirus insectes avec des vecteurs d’expression modifiées pour l’expression de la protéine sécrétoire plante et cristallisation est utilisé.

1. modification d’un vecteur d’Expression Baculovirus avec le Peptide Signal GP67 pour Expression de sécrétion des protéines végétales

1. Synthétiser un fragment d’ADN contenant un 5' BglII coupe site¹³, la séquence de signaux de sécrétion GP67 et un site multi clonage avec NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI et XhoI (Figure 1 a).
   NOTE : Puisque les BglII et BamHI digéré ADN a permis aux mêmes ....

Résultats

Comme illustré à la Figure 1, deux vecteurs d’expression baculovirus mis à jour le pFastBac1 ont été utilisés pour exprimer les protéines sécrétées avec le GP67 ou la séquence signal hemolin pour remplacer la séquence signal intrinsèque du gène cible. Le GP67 virale et les gènes hemolin insectes ont été démontrés d’avoir des niveaux d’expression de sécrétion élevée dans les cellules. Protéines de fusion avec ou l’autre de ces deux séquences signal sont censés.......

Discussion

Compte tenu de la diversité dans la taille et de la stabilité des milliers de protéines présentes dans les systèmes biologiques, il est souvent empirique pour une recherche laboratoire de décider quel système d’expression hétérologue doit être choisi pour l’expression d’une protéine spécifique. Le système d’expression e. coli est souvent le premier choix pour l’expression de la protéine en raison du cycle de vie court de la bactérie, le faible coût des milieux de culture et assez facilement pour intensifier les<.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agitateur d’incubateur	VWR	Modèle Excella E25	27 oC
Incubateur	VWR	Modèle 2005	27 oC
Centrifugeuse	BECKMAN	Modèle J-6	avec rotor à godets pivotants
Herculase II Fusion DNA polymérase	Agilent	600677-51	Pour l’amplification PCR de l’ADN
Thermocycleur	BIO-RAD	Modèle C1000 Touch	Pour l’amplification par PCR de l’ADN
Agitateur d’incubateur	New Brunswick Scientific	Model I 24	Pour la culture de baceria
Synthèse de l’ADN du client	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	Restriction Endonuclease
BglII	New England Biolabs	R0144S	Restriction Endonuclease
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restriction Endonuclease
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T	Ligature de l’ADN
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Purification de l’ADN à partir du gel Agorase
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Purification de l’ADN plasmidique à partir d’une culture bactérienne
Agarose	Thermo Fisher Scientific	15510-019	Pour l’électrophérose sur gel d’ADN
MAX Efficacité DH5&alpha ; cellule competen	Invitrogen	18-258-012	Pour la transformation du mélange de ligature de l’ADN
Lennox L LB Broth	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	Pour la culture de bactéries
Ampicilline sel sodique	Thermo Fisher Scientific	11593-019	Antibiotiques
Sulfate de kanamycine	Thermo Fisher Scientific	15160-054	Antibiotiques
Tétracycline	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	Antibiotiques
Gentamicine	Thermo Fisher Scientific	15710-064	Antibiotiques
MAX Efficacité DH10Bac cellules compétentes	Thermo Fisher Scientific	10361-012	Pour la fabrication de l’ADN bacmid
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544-034	Pour la transformation de l’ADN
Réactif CellFECTIN II	Thermo Fisher Scientific	10362-101	Réactif de transfection de cellules d’insecte
Système d’expression Bac-à-Bac	Thermo Fisher Scientific	10359-016	Kit d’expression de cellules de baculovirus-insectes
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	Pour l’isolement de l’ADN Bacmid récominant
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	Pour l’isolement de l’ADN Bacmid récominant
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	Vecteur d’expression Baculorirus
Cellules Sf9	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 cellules monocouches
Hi5 cellules	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five cellules d’insectes
Grace' s milieu d’insecte, non supplémenté	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 transfection cellulaire minimum
milieu Grace' s milieu anti-insectes, complété	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 milieu complet de culture cellulaire monocouche
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	Sf9 milieu de culture cellulaire en suspension sans FBS
Express Five SFM Thermo	Fisher Scientific	10486025	Hi5 milieu de culture cellulaire
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10 000 UI/ml)
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
FBS Certifié	Thermo Fisher Scientific	16000-044	500 ml
Plaques 6 puits	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B	Plaques à fond plat
150 mm	Thermo Fisher Scientific	353025	100/caisse
1,5 ml Tubes de microcentrifugation	USA Scientific	1415-2500	500 tubes/sac
15 ml Tubes à centrifuger à bouchon à vis conique	USA Scientific	1475-0511	25 tubes/sac
50 ml Tubes à centrifuger à bouchon à vis conique	USA Scientific	1500-1211	25 tubes/sac
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	en résine NiNTA
	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14

Bandes indicatrices de pH