TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

Summary

Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.

Abstract

Régulation épigénétique joue un rôle central dans l’expression des gènes. Étant donné que la modification d’histone a été découvert dans les années 1960, ses fonctions physiologiques et pathologiques ont été largement étudiées. En effet, l’avènement de la nouvelle génération séquençage en profondeur et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) par l’intermédiaire des anticorps spécifiques d’histone modification a révolutionné notre vision de la régulation épigénétique au sein du génome. À l’inverse, les tissus sont généralement composent de types cellulaires différents, et leur mélange complexe pose des défis analytiques pour enquêter sur l’épigénome dans un type particulier de cellules. Afin d’examiner l’état de la chromatine spécifiques à un type de cellule dans une manière de tout le génome, nous avons développé récemment en tandem la chromatine immunoprécipitation le séquençage (tChIP-Seq), qui repose sur l’épuration sélective de la chromatine par des protéines histones tagged noyau de cellule types d’intérêt, suivie par ChIP-seq. L’objectif de ce protocole est l’introduction de meilleures pratiques de tChIP-suiv. Cette technique fournit un outil polyvalent pour enquête épigénome tissu-spécifique dans les modifications d’histone diverse et organismes modèles.

Introduction

Les tissus des animaux se composent de types cellulaires différents. La régulation des gènes dans chaque cellule définit le type de cellule. Modifications de la chromatine - modification histone et de méthylation de l’ADN - sous-tendent la spécificité cellulaire de type de l’expression génique. Ainsi, la mesure de régulation épigénétique dans chaque type de cellule a été désirée, mais il a été un défi technique.

Pour étudier l’épigénétique dans un type particulier de cellules, le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine en tandem (tChIP-Seq) a été récemment mis au point ()Figure 1)¹. TChIP, protéine de noyau épitope-tag histone H2B est exprimée d’un instigateur de cellule-spécifiques au type. Cette fonctionnalité permet l’isolement des chromatines des cellules d’intérêt, même si le matériel commence à partir d’un mélange de différents types de cellules. Suivant ChIP-Seq — purification de la chromatine via une marque modifiée-histone et séquençage en profondeur de prochaine génération isolé ADN — nous pouvons surveiller l’état épigénétique du type cellulaire ciblée de manière génome-large.

En utilisant cette technique, nous avons étudié récemment triméthylation neurone-spécifique de l’histone H3 protéine sur la lysine 4 (H3K4me3) marques. Dans cette étude, nous avons développé une souris knock-in dans lequel terminalement H2B indicateur-étiquetées protéine a été exprimée lors de la recombinaison Cre-mediated (Rosa26^{CAG floxed-pA H2B-drapeau}). Par croisement avec une souris possédant le gène de Cre-réticulum endoplasmique (re) sous le contrôle du promoteur CamK2a, la lignée de souris obtenue induit H2B-drapeau en neurones actifs sur le tamoxifène injection (Camk2a^H2B-drapeau)¹. A partir de cerveau de la lignée de souris établie, nous avons effectué tChIP-Seq avec anticorps anti-H3K4me3. Étant donné que les marques de H3K4me3 correspondent souvent aux régions promotrices, nous pourrions découvrent des centaines de mRNA spécifiquement exprimé dans les neurones¹.

Nous décrivons ici une méthode typique tChIP-Seq qui couvre les étapes de la dissection des tissus pour la construction de la bibliothèque ()Figure 1). L’objectif final de ce protocole est de partager nos meilleures pratiques pour l’exécution de tChIP-Seq et l’application future de cette méthode à d’autres types de cellules et des modifications d’histone.

Protocol

Toutes les méthodes décrites dans les présentes ont été approuvés par la division de la sécurité du RIKEN (H27-EP071) et réalisées avec les règlements et lignes directrices pertinentes.

1. dissection du tissu

1. Disséquer les tissus d’intérêt en petits morceaux (environ < 3 mm²) à l’aide de ciseaux fine de printemps.
   Remarque : Plus grands fragments de tissu sont plus longs à geler, et petits morceaux porteront sur des volumes plus importants de la mémoire tampon, qui peuvent affecter les résultats.
2. Ajouter les fragments de tissus disséqués à un récipient propre rempli d’azote liquide et les recueillir dans des tubes de 2 mL (1 morceau par tube) rempli d’azote liquide.
   Note : Les Tubes avec une surface hydrophile sont recommandées pour cette étape.
3. Placer les tubes à-80 ° C pendant 5 min > avec le bouchon ouvert pour évaporer le reste de l’azote liquide.
   Remarque : Après la fermeture du bouchon, fragments tissulaires peuvent être stockés à-80 ° C pendant un mois avant utilisation.

2. fixation de la cellule

Remarque : Nous avons utilisé un broyeur cryogénique très pratique pour cette étape. Un appareil de rechange peut être utilisé.

1. Tubes de liaison faible de place les 2 mL-protéine contenant les échantillons de tissus sur une grille métallique glace réfrigérée dans l’azote liquide.
2. Placer une balle de métal dans un 1,5 mL-tube et refroidissement à l’azote liquide. Placez-le sur la grille métallique de glace.
3. Ouvrir le tube 2 mL et placer la balle métal prechilled dans le tube. Fermez le bouchon, mettre les 2 mL-tubes dans le porte-tube d’un broyeur cryogénique maniable et tremper immédiatement le titulaire tube assemblé dans l’azote liquide pendant 1 min.
4. Insérez le porte-tube congelé dans la cassette externe de la meuleuse maniable cryogénique et agiter vigoureusement 60 fois pendant 30 s.
5. Démonter le porte-tube, enlever la balle métallique et place les 2 mL-tube sur un échantillon plus frais prérefroidies à-20 ° C.
6. Placer l’échantillon refroidisseur à-20 ° C pendant 15 min éviter le gel du fixateur à l’étape suivante.
7. Amener l’échantillon refroidisseur sur le banc, ouvrez le couvercle du tube et ne versez immédiatement 900 µL de 1 % de formaldéhyde dans elle. Après avoir effectué plusieurs fois, transférer la suspension dans nouveau 2 mL-tube contenant 900 µL du 1 % de formaldéhyde et le fixer pendant 10 min avec rotation douce dans un incubateur à 23 ° C.
   Attention : Le formaldéhyde est toxique et nocif.
8. Pour arrêter la réaction de fixation, ajouter 100 µL de glycine de 2,5 M dans chaque tube et centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C. Jeter le surnageant.
9. Ajouter 1 mL de glacee tampon phosphate salin (PBS), centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant. Répétez cette opération deux fois (3 lavages au total).
   Remarque : Échantillons fixes peuvent être congelés flash par azote liquide et stockées à-80 ° C.
10. Ajouter 500 µL de tampon de lyse 1 (50 mM 4 d’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA acide (EDTA) (pH 8,0), 10 % p/v de glycérol, 0,5 % p/v NP-40, inhibiteur de protéase 0,25 % w/v Triton x X-100 et 0,1 cocktail) au culot, pipette plusieurs fois et faites-la tourner pendant 10 min à 4 ° C.
    Remarque : Tampon de lyse 1 devrait être filtré et stocké à 4 ° C avant utilisation.
11. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
12. Ajouter 1 mL de tampon de lyse 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 mM EGTA et 0,1 x inhibiteur de la protéase cocktail) au culot, vortex et faites-la tourner pendant 10 min à 4 ° C.
    Remarque : Tampon de lyse 2 devrait être filtré et stocké à 4 ° C avant utilisation.
13. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
14. Ajouter 800 µL de tampon immunoprécipitation (RIPA) avec inhibiteur de protéase 1 x cocktail au culot et resuspendre le culot de pipetage.
15. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
16. Ajouter 500 µL de tampon RIPA avec inhibiteur de protéase de 1 x cocktail.
17. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
18. Ajouter 1 mL de tampon RIPA avec inhibiteur de protéase de 1 x cocktail. Procéder immédiatement à l’étape suivante.

3. la chromatine de cisaillement

1. Transférer le lysat dans un tube de sonicateur et ensuite placer le tube sur un ultrasonicator.
2. La chromatine de cisaillement avec les paramètres suivants : température : 4 ° C ; les incidents puissance crête : 175 W ; facteur d’utilisation : 10 % ; cycles/rafale : 200 ; et l’heure : 2 400 s.
3. Transférer l’échantillon dans un 1,5 mL-protéine faible liaison tube et centrifuger pendant 5 min à 20 000 x g à 4 ° C.
4. Recueillir le liquide surnageant dans un nouveau tube de liaison faible de protéines.
   Remarque : L’échantillon peut être flash congelés dans l’azote liquide et conservé à-80 ° C.

4. contrôle de l’ADN (réticulation inverser)

1. Mélanger 20 µL du lysat et 180 µL de tampon d’élution ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0) et 1 % w/v dodécylsulfate de sodium (SDS)) dans un tube de polymerase chain reaction (PCR). Incuber l’échantillon à 65 ° C dans un thermocycleur pendant 6 h avec le couvercle thermocycleur ouvert. Laisser le couvercle du thermocycleur ouvert afin d’éviter trop de dénaturation.
   Remarque : La mémoire tampon d’élution puce devrait être filtré et conservé à température ambiante avant utilisation. L’incubation peut être étendue pour la nuit.
2. Ajouter 1 µL de 10 mg/mL RNase A, vortex et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
3. Ajouter 6,5 µL de 15 mg/mL protéinase K, vortex et incuber à 55 ° C pendant 60 min.
4. La réaction d’un tube de liaison faible de l’ADN de transfert, ajouter 4 µL de glycogène de 5 mg/mL et vortex. Puis, ajouter 200 µL de phénol/chloroforme/isoamylique alcool (25:24:1) et centrifuger pendant 5 min à 18 000 x g à la température ambiante.
5. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de liaison faible d’ADN. Ajouter 200 µL de tampon Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) et 200 mM NaCl) pour le reste de la solution phénol/chloroforme/isoamylique alcool et centrifuger pendant 5 min à 18 000 x g à la température ambiante. Recueillir le liquide surnageant et mélanger avec le surnageant première.
6. Ajouter 900 µL d’éthanol glacé et incuber pendant 1 h à-20 ° C.
   Remarque : Cette incubation peut être prolongée à 4 - 6 h.
7. Centrifuger pendant 30 min à 18 000 x g à 4 ° C.
8. Jeter le surnageant. Ajouter 1 mL d’éthanol glacé de 75 % au culot et centrifuger pendant 30 min à 18 000 x g à 4 ° C. Répétez cette étape (deux lavages au total).
9. Jeter le surnageant soigneusement et sécher à l’air pendant 1 min à température ambiante.
10. Ajouter 50 µL de tampon Tris-EDTA (TE) et dissoudre l’ADN en incubation à température ambiante pendant 30 min ou à 4 ° C durant la nuit. Évitez de vortex ou pipetage. Gardez cet ADN comme « entrée » et l’utiliser pour la préparation de la bibliothèque si nécessaire.
11. Mesurer la concentration d’ADN avec un fluorimètre selon les instructions du fabricant (voir Table des matières) et vérifier la distribution granulométrique avec une machine d’électrophorèse de microfluidique (voir données représentatives illustrées à la Figure de 2 a). utilisation 10 ng ou moins ADN avec ce test.
    Remarque : Les Fragments de 100 à 500 paires de bases (pb) devraient compenser 50 % ou plus de l’ADN.

5. purification d’affinité anticorps anti-drapeau

Remarque : Pour le neurone tChIP-Seq, les tissus du cerveau de 8 souris sont généralement utilisés pour un échantillon de tChIP-Seq pour préparer 2 ng d’ADN purifié par tandem immunitaire-purification (voir étape 7.1). Dans nos mains, 0,1 ng d’ADN encore fournie qualité des bibliothèques d’ADN pour ChIP-Seq (Kadota, inédit). Ainsi, en théorie, une souris peut être suffisante pour effectuer le neurone tChIP-suiv. Le montant demandé doit être optimisé pour le type de tissus et de cellules d’intérêt. Pour le contrôle négatif de l’expérience de la purification de l’imumuno, les tissus cérébraux lysat de souris sans n’importe quelle expression H2B-drapeau devraient être préparées et utilisées.

1. Pipeter 200 µL de billes magnétiques conjugué à l’immunoglobuline mouton anti-souris G (IgG) dans un tube à faible liaison aux protéines.
2. Placer le tube sur un support magnétique et attendre 1 min pour le surnageant à devenir clair. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de PBS glacee et vortex. Répétez cette étape (deux lavages au total).
3. Ajouter 20 µL de 1 mg/mL d’anticorps anti-drapeau et tourner pendant 5 heures à 4 ° C.
   Remarque : Cette incubation peut être étendue pour la nuit.
4. Laver les perles après étape 5.2. Placer les billes dans un tube de 15 mL.
5. Remettre en suspension les perles en 1110 µL de tampon RIPA et puis ajouter 900 µL de 10 x blocage réactif, 180 µL de 50 x solution de Denhardt, 10 µL de 100 x inhibiteur de la protéase cocktail et 6,8 mL du lysat préparé à l’étape 3. Diviser ce mélange en 5 tubes de liaison faible de protéines. Tourner pendant 6 h à 4 ° C.
   Remarque : Cette incubation peut être étendue pour la nuit.
6. Placer le tube sur le support magnétique et attendre 1 min pour le surnageant à devenir clair. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de tampon RIPA et mélanger doucement. Répétez cette étape 5 fois (6 lavages au total). Centraliser toutes les perles dans un tube de liaison basse seule protéine.
7. Ajouter 200 µL de tampon d’élution ChIP et tourner pendant 15 minutes à température ambiante. Vérifier la qualité de l’ADN comme indiqué au point 4.11 (voir données représentatives illustrées à la Figure 2 b et C). Procéder immédiatement à l’étape suivante.

6. affinity Purification par l’anticorps Anti-H3K4me3 et réticulation inverse

Remarque : La suivante perle préparation que étapes (6.1 à 6.4) devraient être effectuées avant l’étape 5,7.

1. Distribuer 40 µL de billes magnétiques conjugué à anti-souris mouton IgG dans un tube de liaison faible 2 mL-protéine.
2. Placer le tube sur le support magnétique et attendre 1 min pour le surnageant à devenir clair. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de PBS glacée et mélanger doucement. Répétez cette étape (deux lavages au total).
3. Ajouter 4 µL de 1 mg/mL d’anticorps anti-H3K4me3 et tourner pendant 6 h à 4 ° C.
4. Laver les perles après étape 6.2. Placer les billes dans un tube de liaison faible de 2 mL-protéine.
5. Remettre en suspension les perles en 1558 µL de tampon RIPA et puis ajouter 200 µL de 10 x blocage réactif, 40 µL de 50 x solution de Denhardt, 2 µL de 100 x inhibiteur de la protéase cocktail et 200 µL de l’éluat établi en étape de 5,7. Faire tourner toute la nuit à 4 ° C.
   Remarque : Le SDS dans le tampon d’élution ChIP a été dilué 10 fois plus dans cette incubation.
6. Placer le tube sur le support magnétique et attendre 1 min pour le surnageant à devenir clair. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de tampon RIPA et mélanger doucement. Répétez cette opération 4 fois (5 lavages au total). Après le dernier lavage, transférer les billes dans un tube de liaison faible d’ADN et éliminer le surnageant.
7. Ajouter 200 µL de tampon d’élution ChIP et tourner pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer l’éluat dans une nouvelle bindingTube faible de l’ADN.
   Remarque : L’éluat peut être conservé à-80 ° C.
8. Suivre l’étape 4 pour decrosslinking de l’ADN. Remettre en suspension l’ADN purifié dans 20 µL de tampon TE.
9. Vérifier la qualité de l’ADN comme indiqué au point 4.11 (voir données représentatives illustrées à la Figure 2D). (facultatif) Effectuer des analyses par PCR quantitative enrichissement comme décrit plus haut². Dix fois ou plus grand enrichissement doit être observé.

7. bibliothèque Construction

1. Pour chaque entrée et chaque échantillon d’ADN de puce, calculer la proportion de l’ADN dans la région de 100 – 500 pb à l’aide de la fonction d’analyse frottis du logiciel pour l’appareil d’électrophorèse microfluidiques. Estimer le volume de l’échantillon nécessaire pour obtenir 2 ng de 100 – 500 bp ADN. Utiliser 20 ng ADN dans la gamme 100 – 500 PB comme l’exemple « d’entrée ».
2. Pipetter des échantillons d’ADN dans les tubes PCR 8-bande et ajouter H₂O pour porter le volume total de 10 µL. (facultatif) si le volume de l’ADN dépasse 10 µL, proportionnellement mesurent-vers le haut, la réaction suivante de fin-réparation et la sélection de la taille.
3. Préparer le mélange maître fin-réparation (voir Table des matières). Ajouter 4 µL du mélange maître fin-réparation de l’ADN et incuber 30 min à 20 ° C.
4. Ajouter 36 µL de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 et 0,6 x volume (30 µL) de solid phase billes magnétiques réversible immobilisation (SPRI) et incuber pendant 5 min à température ambiante.
5. Placer le tube sur un support magnétique et attendre jusqu'à ce que le liquide surnageant devient clair.
6. Transférer le surnageant dans un nouveau tube, ajouter 1,2 x volumes (60 µL) de billes magnétiques SPRI et incuber 5 min à température ambiante.
7. Placer le tube sur un support magnétique et attendre jusqu'à ce que le liquide surnageant devient clair.
8. Laver les perles deux fois avec 200 µL de 80 % EtOH, tenant encore sur l’aimant.
9. Brièvement, centrifuger le tube afin de recueillir l’EtOH résiduel en bas et placez-le sur l’aimant. Enlevez complètement l’EtOH résiduelle.
10. Laissez le couvercle du tube ouvert pendant 1-2 min permettre l’EtOH à s’évaporer.
11. Fermer le couvercle et gardez le tube sur la glace.
    Remarque : Vous avez maintenant obtenu ADN sélectionnée à la taille de 100 – 500 pb sur les perles. On trouvera des renseignements supplémentaires concernant la sélection de taille double sur le site du fabricant (www.beckman.com).
12. Préparer A-tailing master mix (voir Table des matières).
13. Remettre en suspension les perles (à partir de 7.10 étape) avec 10 µL du mélange maître A-tailing et incuber 30 min à 30 ° C.
14. Ajouter 1,8 x volume (18 µL) de polyéthylène glycol (PEG) / solution de NaCl et incuber pendant 5 min à température ambiante.
15. Suivez les étapes 7,7-7.11 pour purifier l’ADN.
16. Préparer le mélange tampon ligature (voir Table des matières).
17. Distribuer 8 µL du mélange tampon ligature sur les perles (à partir d’étape 7.14), ajouter 1 µL de 1 adaptateur µM et remettre en suspension les perles. Utilisez 1 µL de 5 adaptateur µM pour l’échantillon d’entrée. Envisagez d’utiliser des adaptateurs différents pour chaque échantillon pour le multiplexage.
18. Ajouter 1 µL d’ADN Ligase et incuber pendant 15 min à 20 ° C.
19. Ajouter 1,0 x volume (10 µL) de solution de PEG/NaCl, remettre en suspension les perles et incuber pendant 5 min à température ambiante.
20. Suivez les étapes 7,7-7.10 pour purifier l’ADN.
21. Pipetter 25 µL de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 dans le tube et remettre en suspension les perles.
22. Ajouter 1,0 x volume (25 µL) de solution de PEG/NaCl et incuber pendant 5 min à température ambiante.
23. Suivez les étapes 7,7-7.10 pour purifier l’ADN.
24. Pipetter : 11 l 10 mm Tris-Cl, pH 8,5 dans le tube et remettre en suspension les perles.
25. Placer le tube sur un support magnétique et attendre jusqu'à ce que le liquide surnageant devient clair.
26. Recueillir le liquide surnageant dans un nouveau tube de PCR 8-bande.
27. Préparer le mélange maître en temps réel de PCR (voir la documentation pour plus de détails).
28. Pipeter 8,5 µL du mélange maître PCR en temps réel une plaque 384 puits quantitative de la PCR (qPCR) et ajouter 1,5 µL de l’adaptateur ligaturé ADN (à partir de 7.26 étape).
29. Déposer 10µl de chaque norme fluorescente dans les puits vides.
30. Effectuer une PCR en temps réel avec le programme suivant : (98 ° C pour 45 s) x 1 cycle, (98 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s) x 20 cycles, et (72 ° C pendant 60 s) x 1 cycle.
31. Déterminer le nombre de cycles PCR nécessaires pour atteindre l’intensité de la fluorescence de la norme 2 fluorescents.
32. Préparer le maître PCR mix (voir Table des matières).
33. Pipetter 11,5 µL du mélange maître PCR dans l’ADN d’adaptateur-ligaturé restante (à partir de 7.26 étape) et effectuer des PCR comme indiqué dans l’étape 7 h 30 avec les cycles PCR déterminés dans l’étape 7.31.
34. Ajouter 1,0 x volume (20 µL) de solution de PEG/NaCl et incuber pendant 5 min à température ambiante.
35. Suivez les étapes 7,7-7.10 pour purifier l’ADN.
36. Pipeter 20 µL de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 dans le tube et remettre en suspension les perles.
37. Placer le tube sur un support magnétique et attendre jusqu'à ce que le liquide surnageant devient clair.
38. Recueillir le liquide surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL-ADN peu contraignantes.
39. Vérifier la qualité de la bibliothèque comme indiqué au point 4.11 (voir données représentatives illustrées à la Figure 2E et F). Utilisez 1 µL de l’échantillon d’ADN de bibliothèque. (facultatif) Effectuer une analyse de l’enrichissement par qPCR comme décrit plus haut ². Dix fois ou plus grand enrichissement doit être observé.

8. le séquençage

1. Les bibliothèques dans un séquenceur de prochaine génération de séquence (voir données représentatives illustrées à la Figure 3).
   Note : La profondeur de séquence suffisante pour l’analyse des données varie selon la taille du génome de l' organisme³. Pour l’homme et la souris, il est recommandé d’obtenir au moins 20 millions de single-end se lit comme suit. Selon le rendement des lectures, il pourrait être rentable de multiplexage.

Representative Results

Nous décrivons ici la dissection des tissus, lyse cellulaire, fixation, purification de tandem de la chromatine et ADN bibliothèque préparation pour la prochaine génération de séquenceurs. Au cours de la procédure, on peut tester la qualité de l’ADN, qui est la clé pour le séquençage réussi, à de multiples étapes (Figure 2). Puisqu’un seul nucléosome est généralement entouré de 147 bp ADN ⁴, cisaillé ADN ne doit pas être inférieure à cette taille. Immédiatement après la sonication, l’ADN a été isolé et exécuté sur une machine d’électrophorèse de microfluidique (Figure 2 a). Malgré tous nos efforts pour optimiser les tailles, nous avions encore une population d’ADN (environ 2 kbp) qui est resté anialik. À cette étape, la fraction d’ADN allant de 100 à 500 bp devrait être de 50 % ou plus de la population. Après purification d’affinité de l’anticorps anti-drapeau (Figure 2 b), puis des anticorps anti-H3K4me3 (Figure 2D), la qualité de l’ADN isolé a été vérifiée à l’aide de l’appareil d’électrophorèse microfluidique et la quantité d’ADN allant de bp 100-500 a été estimée. Bien que nous avons souvent observé une tendance plus forte à 2 morceaux de kbp à cette étape, double la sélection de la taille de billes magnétiques SPRI supprimé cette fraction.

La spécificité d’immunitaire-purification de l’ADN sur H2B-drapeau a été confirmée avec les échantillons de contrôle négatif, dans quel cerveau lysat de souris sans H2B-drapeau expression a été utilisée (Figure 2). Généralement, nous avons détecté des quantités négligeables de l’ADN des échantillons de contrôle négatif.

Suite A-tailing, ligature de l’adaptateur et PCR, on a vérifié la qualité de la bibliothèque de séquençage (Figure 2E). En général, bp 250-600 ADN a été obtenu. La puce ordinaire réussie et tChIP ont été attestées par l’analyse de l’enrichissement avec qPCR² en utilisant des amorces ciblant la région promotrice du gène GAPDH (Figure 2F).

Représentant a lu les distributions le long des gènes de neurone (Camk2a, Slc17a7 et Gria1) par génome-navigateur sont indiquées à la Figure 3. L’enrichissement des lectures à l’extrémité 5′ de gènes par neurone tChIP-Seq au cerveau entier tChIP-Seq a été observée.

Figure 1 : représentation schématique de tChIP-suiv. Ce chiffre a été modifié par Mito, M. et al. ¹. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : contrôle de qualité de l’ADN. (A, B, Det E) Électrophorégramme obtenue à l’aide d’une machine d’électrophorèse microfluidique pour la chromatine cisaillée ADN (A), ADN purifié avec anticorps anti-drapeau (B) et anticorps anti-H3K4me3 (C), puis la bibliothèque finale (D). Les pics a mis en évidence avec des numéros verts et violets constituent des normes de taille interne. Les lignes pointillées bleues indiquent les régions de taille d’ADN pris en considération pour l’analyse en aval. FU : unités de fluorescence.
(C) la quantité d’ADN récupéré par anti-Flag immunitaire-purification. Chaque point représente une réplication indépendante. (F) analyse de l’enrichissement par qPCR ciblage GAPDH. Chaque point représente une réplication indépendante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : lire les distributions en neurone tChIP-suiv. (A-C) Les distributions de lire le long des gènes représentatif de neurone en neurone tChIP-Seq et contrôle tout le cerveau tChIP-Seq sont indiquées. Tr/min : lectures par million de lectures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Notre protocole a été optimisé pour les neurones du cerveau de souris, dans lequel l’expression de l’indicateur-étiquetées H2B est induite par injection de tamoxifène. Promoteurs, utilisés pour l’expression H2B, matériaux de tissu de départ et la quantité des tissus sont des paramètres pivotales pour succès tChIP-suiv. Ainsi, l’optimisation de ces facteurs devrait considérer pour chaque type de cellules d’intérêt.

Une étape essentielle entre les procédures utilisées dans le présent protocole est l’ADN de cisaillement pour atteindre une longueur de chromatine de 100 à 500 bp⁵. En général, la normalisation de l’étape de sonication est difficile car elle dépend fortement de différents facteurs ; conditions de fixation, les tissus utilisés, le matériel utilisé pour ultra-sonication et au matériel régler, entre autres. Par conséquent, optimisation d’essais et d’erreurs de cette étape de cisaillement ADN sera requise pour les expériences individuelles. Au lieu de l’ultra-sonication, traitement nucléase micrococcique doit être une option pour isoler l’ADN de nucléosomes taille unique, comme ceux utilisés dans le naïf puce méthode⁶. Bien qu’homogène de la distribution de la taille de l’ADN est idéale, cisaillé DNAs peuvent montrer les populations multiples, comme illustré à la Figure 2 a. La sélection de taille double de billes magnétiques SPRI, tel que décrit ci-dessus, contribue à éliminer le plus de taille des fragments d’ADN.

En règle générale, préparation de la bibliothèque nécessite 1 ng de 100 à 500 bp ADN. Basé sur cette exigence, nous entartré le matériau initial du tissu cérébral pour les neurones. Toutefois, cette procédure pourrait être difficile pour les très petits échantillons de types de cellules rares. Dans ce cas, œuvre de puce, qui est basé sur la transposase Tn5 au lieu de ligase et nécessite moins de matière⁷, peut être meilleure alternative.

Néanmoins, ce protocole actuel est limité aux types cellulaires majeurs en la matière. Dans nos mains, occupation de 10 % des cellules ciblées dans la population originale de cellule fourni juste purification de la chromatine de cellules de cible¹. Toutefois, si même plusieurs types de cellules rares sont ciblées, puis une optimisation plus fine d’immunoprécipitation de la balise de l’épitope sera justifiée de distinguer l’ADN isolé de contaminés ADN provenant de cellules indifférenciés. Pour les meilleures pratiques de l’analyse des données, nous recommandons vivement en comparant les données à l’analyse de tChIP-Seq contrôle du tissu entier utilisé pour lancer l’expérience. Étant donné que nous avons trouvé des biais importants de protéine exogène H2B-drapeau, l’analyse devrait être comparé et analysé par enrichissement (ou épuisement) au fond¹. Pour ce contrôle, nous avons en effet créé une lignée de souris avec ubiquitaire expresse H2B-indicateur (Rosa^H2B-drapeau) et exécuté tChIP-Seq¹. Une interprétation plus détaillée des données a été indiqué plus haut¹.

Selon notre analyse, le H3K4me3 tChIP-Seq de neurones fourni comparable ou meilleure détection des gènes connus de neurone-spécifique que RNA-Seq de neurones FACS-tri⁸ et traduction de purification d’affinité ribosome (TRAP)-Seq⁹. Par exemple, des gènes connus axon/dendrite-localisées ont été efficacement récupérés à l’aide de neurone tChIP-Seq¹. Fait remarquable, notre tChIP-Seq n’est pas limitée pour la marque d’histone associée à promoteur mais s’applique également aux autres divers histone modifications¹⁰ si les anticorps sont disponibles. En outre, la stratégie consistant à isoler la chromatine par les histones taggé base utilisable dans d’autres organismes de modèle. Bien qu’ici nous avons utilisé l’épitope FLAG pour baliser la protéine histone, autres balises peuvent être appliqués. Étant donné que la fixation à l’ADN de formaldéhyde survient le plus souvent à des résidus de lysine d’une protéine¹¹, une balise avec la lysine beaucoup doit être évitée afin d’éliminer les préjugés par l’épitope de marquage. L’approche de tChIP-Seq devrait donc être polyvalent dans les divers tissus le long de nombreux types de contextes dans les études épigénétiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region