パラフィン埋め込まれたマウス精巣のセクションで蛋白質の検出と精巣細胞の不死化線 (mECap18) のためのプロトコルを説明するダイナミンの蛍光抗体法により局在を報告する.また精巣上体液やエアコン携帯メディアから分泌蛋白質の隔離のためのプロトコルについて述べる。
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この記事について
サマリー
要約
哺乳類の精巣上体は後精巣の成熟と精子のストレージをサポートするためにすべての内分泌腺の最も複雑な管腔内流体のいずれかを生成します。このような複雑さは、粘膜上皮細胞の結合分泌・吸収活動のため発生します。ここでは、ダイナミン (そこ) mechanoenzymes; のモデル蛋白質家族に焦点を当てた精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析手法について述べる大規模な低分子量 g 蛋白質双方向膜人身売買イベントを規制する可能性があります。精巣組織の蛋白質の表現の検討, 蛍光ラベリング パラフィン埋め込まれたセクションの標的タンパク質とを介してこれらのタンパク質の分布の後続の検出のための堅牢な方法論について説明します。蛍光顕微鏡検査。分離と小胞、成熟精子細胞と細胞間のコミュニケーションに参加する精巣の内腔に分泌する epididymosomes として知られているようなエキソソームの特性の最適化手法についても述べる。補完的なアプローチとして SV40 不死化マウス頭精巣上皮 (mECap18) の細胞ラインのターゲット蛋白質の蛍光検出について述べる。さらに、精巣の分泌活性の調節を探索するために適した体外モデルとして mECap18 細胞株の有用性について論じる。この目的のため培養 mECap18 細胞株およびその分泌タンパク質プロファイルに影響を与えることができる選択的薬理学的阻害療法の使用メンテナンス要件をについて説明します。後者は、SDS-PAGE および免疫ブロット経由で彼らの後の分析、トリクロロ酢酸/アセトンの沈殿物によって分泌された蛋白質の濃度条件培の収穫を使って容易に評価。我々 は、これらの結合方法が精子成熟および/またはストレージの機能的役割の決定へのプレリュードとして代わりとなる精巣上体蛋白質ターゲットの分析に適していると主張します。
概要
すべての哺乳類の種の精子を取得前方の進歩的な運動を表示して精巣上体、可能性があります男性の精巣余分なダクト システムの専門性の高い領域での長期にわたる降下中に卵子を受精する可能性7-14 日 (種) によって移動するを取る1。父系クロマチンの極端な凝縮と精巣内精子の分化に伴う細胞質の多数の放出のための後続の機能的成熟はの相互作用によってのみ駆動します。精巣微小環境。この環境は、ライニング精巣上体相馬の分泌・吸収活動によって作成され、ターンでは、セグメント バリエーション1の例外的なレベルが表示されます。したがって、タンパク質の合成と分泌の面で最もアクティブなセグメント、精巣上体 (すなわち、頭とコーパス)2の近位部にあります。このアクティビティ ミラー機能の能力の特徴を表示する最初の細胞と精子の機能のプロファイル (すなわち、進歩的な運動とするソーナの酸可溶性糖タンパク質に結合する機能) 次の。3頭精巣上体を通過。これらの機能的な属性は精子射精のための準備で静止状態で格納される前記遠位精巣上体セグメント (バーニャカウダ) に到達、最適なレベルに達する前に開発し続けます。形成とこの精子の貯蔵貯蔵所の維持は、馬尾の強い吸収活動4,
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プロトコル
動物組織のコレクションを含むすべての実験手順は、ニューカッスル大学の動物のケアと倫理委員会によって承認されました。
1. 蛍光染色パラフィン埋め込まれた精巣上体セクション (図 1 および 2)
- CO2吸入 (スイス マウス、8 週間以上古い) 経由で成体の安楽死、直後に慎重に解剖 (外科はさみとピンセットを使用して) 精巣上体覆う結合組織や脂肪の無料、Bouin の定着剤に浸すソリューション (> 10 倍ボリューム/組織重量) 一晩固定用。
- 2 日間 2 × 変更 70% エタノールをティッシュを毎日洗うし、浸潤およびパラフィン ブロックを埋め込むのための準備として傾斜エタノール (70%、95%、100%) を脱水します。
- 4-6 μ m との免疫蛍光染色の準備のスライド マウントの厚さでパラフィン ブロックをセクションします。
- ヒューム フードの組織切片 (3 × 5 分たびに) を完全に没頭するスライドの瓶にキシレンの十分な量を追加することで精巣上体のパラフィン切片を dewax します。
- ティッシュ セクションを精製 H2O で希釈した傾斜のエタノール溶液に浸漬して水分補給 (100% エタノール 100% エタノール 90% エタノール エタノール 80%、70% のエタノールの 1 分 1 分 5 分 5 分 1 分、....
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結果
図 1と図 2は、マウスの精巣上体頭にそこの局在を蛍光抗体法の代表的な結果を示します。3 そこアイソ フォームの各表示異なるローカライズ プロファイルを検討した.したがって、DNM1 は、(図 2 a) 初期セグメントと頭の精巣上体全体で精巣の細胞の比較的控えめなびまん性ラベルが特徴です。対照的に、DNM2 のアイソ フォームが最初に見つかった最初のセグメント内のセルの反対の基底部および根尖部の国境付近隣接する下流頭セグメント内のセルの核上性ドメインに再配置されている前に (すなわち、。ゾーン 2-5) (図 1B、C)。特に、しかし、徐々 にラベル DNM2 の強度は本質的にこれらの精巣上体セグメント21
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ディスカッション
これらの研究には、パラフィン包埋、セクショニングの標準プロトコルにさらされていたブアン固定精巣組織の使用が組み込まれています。ブアン固定液には、具体的かつ相補的な機能を持つ各コンポーネントにホルムアルデヒド、ピクリン酸と酢酸の混合物が装備されています。したがって、タンパク質の架橋結合を形成する第一級アミンと反応してホルムアルデヒドが、ピクリン酸はゆっくりと塩を形成する組織を浸透し、それ故の基本的な蛋白質と逆に、酢酸凝固は急速に組織を浸透しの凝固を引き起こす核酸。これらの複合プロパティは、形態学的詳細の保存に最適な固定液として Bouin を奇形し、その使用が副睾丸の文献で広く報告されます。ただし、Bouin のソリューションはターゲット抗原を隠す可能性があります傾向定着性誘起蛍光性とホルムアルデヒドによる架橋を含む、制限なしではありません。
背景の蛍光性の可能性を要する厳しいマイナス コントロールを使用、一次抗体、二次抗体の省略の省略を含む私たちの研究と、試薬があります、一次抗体の使用そこから生成された免疫になるペプチドに対する preabsorbed。このようなコントロールのアプ.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者は、この作業をサポートするため国立保健医療研究評議会のオーストラリア プロジェクト助成金 APP1103176 を認識したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ダイナミン 1 抗体 | アブカム | ab108458 | <ストロング>宿主種: ウサギ、<ストロング>アイソタイプ: IgG、<ストロング>クラス: ポリクローナル |
| ダイナミン 2 抗体 | サンタクルス | sc-6400 | <ストロング>宿主種: ヤギ、<ストロング>アイソタイプ: IgG、<ストロング>クラス: ポリクローナル |
| ダイナミン 3 抗体 | プロテインテック | 14737-1-AP | 宿主種: ウサギ、Isotype: IgG、Class: ポリクローナル |
| ATP6V1B1抗体 | Santa Cruz | sc-21206 | 宿主種: ヤギ、Isotype: IgG、Class: ポリクローナル |
| CD9抗体 | BDファーミンゲン | 553758 | <強い>宿主種:ラット、<強い>同型:IgG、<強い>クラス:モノクローナル |
| フロチリン-1抗体 | シグマ | F1180 | <強い>宿主種:ウサギ、<強い>同型:IgG、<強い>クラス: ポリクローナル |
| ALOX15抗体 | アブカム | ab80221 | 宿主種:ウサギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル |
| TUBB抗体 | Santa Cruz | sc-5274 | 宿主種:マウス、Isotype:IgG、Class: モノクローナル |
| PSMD7抗体 | Abcam | ab11436 | 宿主種:ウサギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル |
| 抗ウサギ Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | 宿主種:ヤギ、Isotype:IgG、Class: ポリクローナル |
| 抗ヤギアレクサフロー488サー | モ | A11055 | <強い>宿主種:ロバ、<強い>同型:IgG、<強い>クラス:ポリクローナル |
| 抗ヤギアレクサフロー594 | モ | A11058 | <強い>宿主種:ロバ、<強い>同型: IgG、Class:ポリクローナル |
| 抗ラットAlexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | 宿主種:ヤギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル |
| 抗ウサギHRP | ミリポア | DC03L | 宿主種:ヤギ、Isotype: IgG、Class:ポリクローナル |
| 抗ラットHRP | Millipore | DC01L | 宿主種:ヤギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル |
| 抗マウスHRP | Santa Cruz | sc-2005 | 宿主種:ヤギ、Isotype: IgG、<ストロング>クラス:ポリクローナル |
| 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI) | シグマ | D9564 | |
| ウ化プロピジウム(PI) | シグマ | P4170 | |
| ビオール4-88 | バイオケム | 475904 | |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | シグマ | A7906 | |
| シ胎児血清(FBS) | ボボゲン | SFBS-F | |
| DMEM | サーモ | 11960-044 | |
| L-グルタミン | サーモ | 25030-081 | |
| ニシリン/ストレプトマイシン | サーモ | 15140-122 | |
| 5&α;-アンドロスタン-17&ベータ;-オール-3-oneC-IIIN | シグマ | A8380 | |
| ビン酸ナトリウム | サーモ | 11360-070 | |
| トリプシン-エチレンジアミン四酢酸酸性(EDTA) | シグマ | T4049 | |
| パラホルムアルデヒド(PFA) | EMS | 15710 | |
| キシレン | VWRケミカルズ | 1330-20-7 | |
| タノール | VWRケミカルズ | 64-17-5 | |
| リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS) | シグマ | P4417 | |
| エン酸ナトリウム | シグマ | S1804 | |
| トリス | アストラル | 0497-5KG | |
| グリセロール | シグマ | G5516 | |
| 1、4-ジアザビシクロ-(2.2.2)-オクタン | シグマ | D2522 | |
| -L-ギジン | シグマ | P4832 | |
| トンX-100 | シグマ | 78787 | |
| パンブルー | シグマ | T6146 | |
| クロロ酢酸 | シグマ | T9159 | |
| アセトン | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| スクロース | シグマ | S0389 | |
| ポリ (ビニルアルコール) | シグマ | P8136 | |
| D-グルコース | Ajax ファインケム | 783-500G | |
| OptiPrep 密度勾配 ミディア | シグマ | D1556 | |
| 蛍光顕微鏡 | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| 超遠心分離機 | ベックマン・コールター | オプティマ Max-XP | |
| 微量遠心分離機 | エッペンドルフ | 5424R | |
| インキュベーター | ヘラセル | 150 | |
| 大型オービタルシェーカー | Ratek | OM7 | |
| マイクロ波 | LG | MS3840SR /00 | |
| ラボ用 pHメーター | MeterLab | PHM220 | |
| 撥液スライドマーカー | 大同産業 | ミニ | |
| カバースリップ | サーモ | 586 | |
| 6ウェルプレート | CELLSTAR | 657160 | |
| 12ウェルプレート | CELLSTAR | 665180 | |
| スライド | マイクガラス | SF41296PLMK | |
| 0.45 & マイクロ;m フィルター | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes ダストフリーペーパー | KIMTECH | 34155 | |
| 超遠心チューブ (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| 超遠心チューブ (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 & micro;メートル | FALCON | 352350 | |
| ペトリ皿35 × カム付き10ミリメートル | SARSTED | 82.1135.500 | |
| スライド | ジャーTRAJAN# | 23 319 00 |
参考文献
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59(2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F.
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再版と許可
