Summary
Her rapporterer vi immunofluorescence lokalisering av dynamin å illustrere protokollene for påvisning av proteiner i parafin-innebygd mus epididymal inndelinger og de av en udødeliggjort epididymal celle linje (mECap18). Vi beskriver også protokollene for isolering av sekretoriske proteiner fra både epididymal væske og betinget cellen media.
Abstract
Pattedyr bitestikkel genererer en av de mest komplekse intraluminal væskene av alle endokrine kjertel for å støtte den nye testicular modning og lagring av spermatozoa. Slik kompleksitet oppstår på grunn av kombinerte sekretoriske og absorberende aktiviteten til fôr epitelceller. Her beskriver vi teknikker for analyse av epididymal proteinsyntese og sekresjon ved å fokusere på modellen protein familien dynamin (DNM) mechanoenzymes; store GTPases som har potensial til å regulere toveis membran menneskehandel hendelser. For studier av protein uttrykk i epididymal vev beskriver vi robust metode for immunofluorescence merking av målet proteiner i parafin-embedded deler og den etterfølgende oppdagelsen av den romlige fordelingen av disse proteinene via immunofluorescence mikroskopi. Vi beskriver også optimalisert metodikk for isolering og karakterisering av exosome som blemmer, kjent som epididymosomes, som utskilles i den epididymal lumen til å delta i intercellulære kommunikasjon med modne sædceller. Som en komplementær tilnærming beskriver vi også immunofluorescence deteksjon av mål proteiner i en SV40-udødeliggjort musen caput epididymal epitel (mECap18) cellen linje. Videre har diskutere vi verktøyet av mECap18 celle linjen som passer i vitro modell med å utforske regulering av epididymal sekretoriske aktivitet. For dette formålet beskriver vi culturing kravene for vedlikehold av mECap18 celle linjen og bruk av selektiv farmakologiske hemming regimer som kan påvirke deres sekretoriske protein profil. Sistnevnte er vurdert lett via høsting av betinget kultur medium, konsentrasjonen av utskilles proteiner via Trekloredikksyre/aceton nedbør og deres påfølgende analyse via SDS-side og immunoblotting. Vi hevder at disse kombinerte metodene er egnet for analyse av alternativ epididymal protein mål som et forspill til å bestemme sin funksjonelle rolle i sperm modning og/eller lagring.
Introduction
Spermatozoa av alle pattedyrarter erverve potensial til å vise frem progressiv motilitet og befrukte egget under deres langvarig nedstigning bitestikkel, et høyt spesialisert område av mannlige ekstra testicular Ledningskanalsystemet, som kan ta 7-14 dager å navigere (avhengig av arten)1. Ekstreme kondens på farssiden chromatin og blodsutgytelse flertallet av cytoplasma som følger cytodifferentiation spermatozoa i testiklene, er deres påfølgende funksjonelle modning drevet av deres samspill med den epididymal microenvironment. Dette miljøet er, igjen, skapt av sekretoriske og absorberende aktiviteten til fôr epididymal soma og viser en enestående nivå av segmentet-segmentet variant1. Dermed er de mest aktive delene proteinsyntese og sekresjon ligger i den proksimale delen av bitestikkel (nemlig caput og corpus)2. Denne aktiviteten gjenspeiler funksjonelle profilen spermatozoa, med celler første begynnelsen vise kjennetegner funksjonell kompetanse (dvs., progressiv motilitet og muligheten til å binde til syre-solubilized zona glykoproteiner) følgende deres passasje gjennom caput bitestikkel3. Disse funksjonelle attributtene fortsette å utvikle før optimale nivåer som sperm nå den distale epididymal segmentet (cauda), der de er lagret i en passivisert tilstand i beredskap for utløsning. Dannelsen og vedlikeholdet av denne sperm lagring reservoaret er også nært knyttet til fôr epitel, som i cauda domineres av sterke absorberende aktivitet4,5. Selv om anatomiske forskjeller har vært rapportert6,7,8, synes slike regionene arbeidsdeling å være karakteristisk for bitestikkel som deles blant fleste pattedyrarter studerte til dato, inkludert vår egen9,10. Faktisk, fra en klinisk perspektiv, det er kjent at epididymal dysfunksjon er et viktig bidrag til etiologien av mannlig faktor ufruktbarhet11, dermed fremhever viktigheten av å forstå regulering av denne spesialisert vev.
Det er derfor beklagelig at vår forståelse av epididymal fysiologi og mekanismer som regulerer sekvensiell faser av sæd modning og lagring i denne tissue, forblir fullt løses. Blant de medvirkende faktorene er begrensende fremskritt innen epididymal forskning generelle kompleksiteten i dette vevet og kunnskap om mekanismene som utøver regulatoriske kontroll over sine luminal microenvironment. Anatomisk, vet vi at utover æren av caput, corpus og cauda segmenter, bitestikkel kan videre deles inn i flere soner (figur 1A), hver atskilt med septa12 og preget av separate profiler av genet/protein uttrykket13,14,15,16,17,18. Basert på detaljerte transcriptional profilering av Segmentinformasjon genuttrykk i bitestikkel, har faktisk som 6 og 9 forskjellige epididymal soner rapportert i musen og rotte modeller, henholdsvis19,20. Slik kompleksitet antagelig gjenspeiler sammensetningen av den epididymal soma, en pseudostratified epitel består av mange forskjellige celletyper; hver forskjellige forhold til sine overflod, distribusjon og sekretoriske/absorberende aktiviteter langs i tarmkanalen. Dermed er viktigste celler langt den mest tallrike epididymal celle type utgjør opp 80% av alle epitelceller. Følgelig er viktigste celler ansvarlig for mesteparten av epididymal protein biosyntesen og sekresjon5. Derimot er klare celle befolkningen, som rangerer som den nest mest rikelig celle typen innen den epididymal soma, hovedsakelig involvert i selektiv absorpsjon av luminal komponenter og forsuring av denne microenvironment5. Legger til et annet nivå av kompleksitet, utøve androgener og andre lumicrine faktorer av testicular opprinnelse differensial kontroll over hver av disse epididymal celletyper avhengig av deres plassering langs tarmkanalen.
Til tross for begrensningene pålagt av slik kompleksitet, fortsetter betydelig innhugg gjøres i løse mekanistisk grunnlaget for epididymal funksjonen. En nøkkel til disse studiene er anvendelse av avanserte massespektrometri strategier for å etablere bred skala lagerbeholdning på den epididymal proteom, sammen med detaljerte analyser av personlige proteiner valgt blant disse innledende undersøkelser. En illustrasjon av denne tilnærmingen er vår siste karakterisering av DNM mechanoenzymes i mus modell21. Vår første interesse DNM var drevet av sin dual action i koplingen exo - og endocytotic prosesser. Bygge på disse observasjonene, kunne vi vise at de tre kanoniske isoformene av DNM (DNM1 - DNM3) er svært uttrykt i musen bitestikkel og riktig plassert for å oppfylle forskriftsmessige roller i protein sekresjon og absorpsjon21 . Videre kunne vi skille hver DNM isoformen basert på deres mobilnettet og sub mobilnettet lokalisering, dermed antyder at de har utfyllende, i motsetning til redundant aktivitet innen epididymal epitel21.
Her beskriver vi eksperimentell metodikk ansatt for studier av DNM uttrykk i mus bitestikkel med håp om at denne informasjonen vil finne omfattende program i karakterisering av alternativ epididymal proteiner og dermed bidra til vår forståelse av funksjonen av denne viktige delen av mannens reproduksjonsevne skrift. Spesielt beskrive vi utviklingen av robust metode for immunofluorescence merking av målet proteiner i parafin-embedded epididymal deler og den etterfølgende oppdagelsen av den romlige fordelingen av disse proteinene via immunofluorescence mikroskopi. Vi ytterligere dokumentere våre nylig optimalisert protokoller22 for isolering og karakterisering av epididymosomes; små exosome som blemmer som utgjør viktige elementer av epididymal sekretoriske profilen og synes å holde en fremtredende rolle i å fremme sperm modning23. Som en komplementær tilnærming beskriver vi også immunofluorescence deteksjon av mål proteiner i en udødeliggjort musen caput epididymal epitel (mECap18) cellen linje og bruk av denne ressursen som modell med å utforske regulering av epididymal sekretoriske aktivitet i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyr tissue samling ble godkjent av University of Newcastle's Animal Care og etikk.
1. immunofluorescence farging av parafin-embedded Epididymal deler (tall 1 og 2)
- Umiddelbart etter eutanasi voksen mus via CO2 innånding (sveitsisk mus, over 8 uker gamle), nøye analysere bitestikkel (med kirurgisk saks og pinsett) gratis overliggende bindevev og fett og dyppe i Bouins bindemiddel løsning (> ti ganger volum/vev vekt) for natten fiksering.
- Vask vevet med 70% etanol med 2 × endringer daglig i 2 dager og deretter tørke gjennom gradert etanol (70%, 95% og 100%) i forberedelse til infiltrasjon og innebygging til en parafin.
- Del parafinblokkene på tykkelse på 4-6 µm og montere på lysbildene i forberedelse til immunofluorescence flekker.
- I avtrekksvifte, dewax de epididymal parafinsnitt ved å legge til en tilstrekkelig mengde xylen lysbildet jar å helt fordype delen vev (3 × 5 min hver gang).
- Rehydrate delene vev av nedsenking i gradert etanol løsninger fortynnet i renset H2O (100% etanol 5 min., 100% etanol 5 min, 90% etanol 1 min, 80% etanol 1 min, 70% etanol 1 min, og 50% etanol 1 min).
- Vask delene i en lysbilde krukke gang etter 5 min med tilstrekkelig fosfat bufret saltvann (PBS) å helt fordype delen hele vev (Følg disse instruksjonene for alle etterfølgende vasker).
- Dekanter riktig antigen henting løsning (dvs., 10 mmol/L natriumsitrat, 50 mmol/L Tris pH 10.5 eller alternativ antigen henting løsning, avhengig av antigen kan oppdages) i en objektglasstativet og mikrobølgeovn til koking. Fordype lysbildene i denne løsningen og utsette delene vev varme-indusert antigen henting forhold optimalisert for individuelle antistoffer (se tabell 1).
Forsiktig: Kontroller at lysbildene er helt oppslukt i antigen henting løsning under antigen prosessen. - Fjern beholderen lysbildet fra mikrobølgeovn og kjølig til romtemperatur.
- Skyll lysbildene med PBS og bruke en flytende-frastøtende lysbildet markør pennen å spore rundt delen vev.
- Plasser lysbildene i en fuktet beholder (laget av en fuktet vev ved foten av beholderen), og bruke blokkerer løsning (3% BSA/PBS, tidligere filtrert gjennom et filter for 0,45 µm) 1t på 37 ° C.
- Skyll lysbildene øyeblikkelig med PBS.
- Inkuber delene med passende primære antistoff utvannet til en eksperimentelt optimalisert konsentrasjon i filtrert 1% BSA/PBS på 4 ° C over natten (1:60 for anti-DNM1, DNM2 og DNM3 antistoffer; 1: 100 for anti-ATP6V1B1 antistoff, se tabell for materiale for antistoff detaljer).
Merk: for å skille bestemt fra ikke-spesifikke antistoffer bindende, er det nødvendig å inkludere strenge negative (dvs., sekundær antistoff bare, primære antistoff preabsorbed mot immunisere peptid) og positiv kontroller24. - Rewarm lysbilder ved å plassere ved romtemperatur for 30 min.
- Vask den lysbilder 3 × med PBS på en risting plattform (60 rpm) for 10 min.
- Inkuber delene med passende sekundære antistoff fortynnet i 1% BSA/PBS (filtrert gjennom et filter for 0,45 µm) ved 37 ° C i 1 time (1:400 fortynning for alle sekundære antistoffer, se Tabellen for materiale for antistoff detaljer).
Advarsel: Hold lysbilde beholderen i mørket dette trinnet og utover. For dobbelt merking, velge en kompatibel kombinasjon av sekundær antistoffer (dvs., sekundær antistoffer må har vært reist i ulike arter). - Vask den lysbilder 3 × med PBS på en risting plattform (60 rpm) for 10 min.
- Counterstain delene med propidium iodide (PI, 7.48 μmol/L) eller 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4,37 μmol/L) i 2 minutter ved romtemperatur å merke cellekjernen.
- Vask lysbilder to ganger med PBS på en risting plattform (60 rpm) for 5 min.
- Montere delene med 10% Mowiol 4-88 forberedt i en løsning av 30% glyserol 0,2 mol/l Tris (pH 8.5) og 2,5% 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-oktan.
- Seal dekkglassvæske med nail lakk og lagre skliene i 4 ° C for fremtidige observasjon.
FORSIKTIG: Det anbefales å utføre avbilding av lysbildene så snart som praktisk etter utarbeidelse å unngå overdreven tap av fluorescens.
2 isolering av Epididymosomes fra musen Caput bitestikkel (figur 3)
- Umiddelbart etter eutanasi voksen mus via CO2 innånding (sveitsisk mus over 8 uker gamle), perfuse blodkar deres med PBS (pre oppvarmet til 37 ° C) for å redusere blod forurensning av epididymal vev.
FORSIKTIG: blodplasma inneholder ulike bestander av exosomes, som er av samme størrelse til epididymosomes25. Effekten av blod klaring fra epididymal vev kan nås via inspeksjon av første segmentet, en svært vascularized epididymal segmentet ligger proksimale caput segmentet (dvs., sone 1 i figur 1A) - Nøye analysere bitestikkel gratis overliggende fat og bindevev, og skyll med endrede Biggers, Whitten og Whittingham medium (BWW, pH 7.4, osmolality 300 mmol/kg vann26,27) for å redusere fare for overflate blod forurensning.
- Blot epididymal vevet å fjerne overflødig media, dissekere caput bitestikkel (dvs., soner 2-5 i figur 1A) og overføre til en frisk Petriskål (35 × 10 mm) som inneholder BWW medium. Kontroller at mengden av medium er tilstrekkelig for siste utvinning.
Merk: For 6 caput epididymides, er det anbefalt å bruke 1.1 mL av mediet til å tillate en utvinning av ~ 900 µL, som er så jevnt delt og brukes på toppen av 2 ferdig graderinger (se trinn 2.9). - Gjør en rekke små incisions i caput vevet med et barberblad. Ikke hakke vev og dermed unngå forurensende prøven med overdreven cytosolic innhold. Inkuber platen inneholder vevet med mild agitering på 37 ° C i 30 min å løslate luminal innholdet.
- Filtrere resulterende suspensjon gjennom 70 µm membraner fjerne mobilnettet rusk.
- Samle filtratet og underlagt dette påfølgende sentrifugering trinnene på 4 ° C med økende hastighet for å eliminere mobilnettet rusk (dvs., 500 × g, 2000 × g, 4000 × g, 8000 × g, 5 min hver; 17000 × g for 20 min, og endelig 17000 × g for en ekstra 10 minutter, eller til ingen pellets er dannet etter sentrifugering).
Advarsel: Det er viktig å vurdere fargen på pellet etter første 500 × g sentrifugering trinn å sikre minimal blod forurensning er tilstede. Kast noen eksempler som dette pellet viser rosa farge. - Klargjør usammenhengende iodixanol graderinger (med 40%, 20%, 10%, 5% lag) ved å fortynne en tetthet gradert medium (som består av 60% (w/v) vandig iodixanol) med 0,25 mol/L sukrose og 10 mmol/L Tris (pH 7.5).
- Klargjør forløpningen i et ultracentrifuge rør (11 × 35 mm), med hver fraksjon av 450 µL (Figur 3). Visuelt inspisere graderingen etter hver fraksjon slik at grensesnittene er vellykket dannet mellom hvert før lasting epididymal væske prøven. Forberede hver forløpning frisk ved bruk, men epididymal luminal væske prøven kan bli bevart ved 4 ° C i opptil 2 timer før lasting.
- Forsiktig legge til 450 µL av epididymal luminal væske suspensjon (tilsvarende materialet samlet fra caput i 3 epididymides) på toppen av en enkelt gradering.
- Ultracentrifuge graderingene 160.000 × g på 4 ° C 18 h.
Advarsel: Siden denne sentrifugering gjennomført ved svært høy hastighet, alle ultracentrifuge rør må være sammenkoblet og balansert nøyaktig. Sjekk rør for å sikre at de er fri for synlige skader som kunne kompromittere sin integritet. - Fjern 12 lik brøker (hver bestående av 185 µL) fra det øverste laget og framover mot bunnen av graderingen. Basseng tilsvarende fraksjoner utvinnes fra hver forløpning eventuelt (opptil to graderinger).
Merk: Musen epididymosomes er mest beriket i fraksjoner 9-1122, se Figur 4 og diskusjon. - Etter utvinning og av brøker 9 – 11: fortynne i 2 mL PBS og ultracentrifuge prøvene på 100.000 × g på 4 ° C for 3 h (13 × 56 mm rør) til pellets til epididymosomes.
Advarsel: Siden epididymosome pellets kan være vanskelig å se, sikre at retningen på rørene er kjent som de plasseres i rotoren og merke røret for å angi forventningsfull plasseringen av epididymosome pellets. Kontroller at hver rør inneholder et tilstrekkelig volum (dvs., over 50% av totale kapasitet) å utelukke risiko for rør kollaps. - Nøye Sug opp og kast nedbryting uten å forstyrre epididymosome pellets.
- Vurdere epididymosome renhet (Figur 4).
- Resuspend epididymosome pellets til ønsket medium i henhold til nedstrøms program(mer). BWW medium brukes for eksempel vanligvis for eksperimenter som involverer co inkubasjon spermatozoa eller alternativt en passende lyseringsbuffer i forberedelse til oppløsningen av det epididymal proteom via SDS-siden.
3. immunofluorescence Beising mECap18 celler
- Utarbeidelse av sterile coverslips (å bli gjennomført i celle kultur hette)
- Nyt coverslips (12 × 12 mm) i 70% etanol i 10 min og desinfisere ved tørking under høy temperatur over en etanol lampe.
- Cool dekkglassvæske for 10 før overføring til en 12 godt plate.
- Bruke sterile poly-L-lysine løsning for å dekke dekkglassvæske og betale for 10 min ved romtemperatur.
- Forkaste poly-L-lysine løsningen og skyll dekkglassvæske med sterilt H2O eller passende medium.
- Forberedelse mECap18 celler
- Passasje dele 2 × 105 mECap18 celler i hver brønn av 12 godt plate som inneholder coverslips.
- Kultur cellene med mECap18 celle middels (DMEM med 1% L-glutamin, 1% natrium pyruvate, 1% penicillin/streptomycin og 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN) som inneholder 10% fosterets kalv serum (FBS) i en 37 ° C inkubator under en atmosfære 5% CO2 over natten.
- Når cellene overholder dekkglassvæske, forkaste mediet og skyll cellene to ganger med PBS.
- Legge til en tilstrekkelig mengde 4% paraformaldehyde (PFA) fortynnet i PBS å fordype hele dekkglassvæske og fikse cellene i romtemperatur i 15 min.
- Forkaste PFA løsningen og skyll coverslips to ganger i PBS.
- Immunofluorescence flekker
- Permeabilize mECap18 celler av nedsenking i 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 min.
- Skyll coverslips med PBS.
- Blokkere mECap18 celler med 3% BSA og fortsett med immunolabeling celler utnytte tilsvarende protokoller med dem som beskrives for epididymal vev deler.
4. isolering av proteiner fra betinget celle kultur Medium
- Samling av betinget celle kultur medium
- Passasjen dele 4 × 105 mECap18 celler i hver brønn 6 vel plate med mECap18 celle medium med 10% FBS 24 h.
- Vask mECap18 celler tre ganger med mECap18 celle medium (forberedt uten FBS) for å fjerne gjenværende FBS og eventuell tilknyttet protein forurensninger.
- Legge til 1,5 mL mECap18 celle medium (forberedt uten FBS) hver brønn og ruge med mECap18 celler for 12 h i en 37° C inkubator under 5% CO2.
Merk: mECap18 celler på dette trinnet kan vurderes for ulike antigener ifølge eksperimentell design. - Etter 12 h inkubasjon samle celle medium og sentrifuger 2000 × g i 10 min å fjerne alle mobilnettet rusk.
Merk: Varigheten av inkubasjon er kjøpedyktig endres i samsvar med eksperimentell design/endpoint vurdering og behandling cellens toleranse anvendt treatment(s). Det anbefales å skreddersy tidspunktet for inkubasjon basert på bestemte eksperimentelle regimer slik at optimale resultater er oppnådd. - Vurdere mECap18 celle levedyktighet via anvendelse av en standard trypan blå utelukkelse analysen28. Forkaste alle materiale som cellen levedyktighet har falt under 90% å eliminere bias introdusert av proteiner fra døde eller døende.
- Isolere proteiner fra cellen medium som følger eller bevare mediet på-80 ° C.
- Protein isolasjon (for å bli gjennomført i avtrekksvifte)
- Legge til 20% volumet av kjølt 100% Trekloredikksyre 80% volumet av betinget celle medium for å utløse proteiner fra kulturperler mECap18 cellene. Ruge på 4 ° C over natten med konstant miksing.
- Etter inkubasjon, pellets utfelt protein med sentrifugering (17 000 × g, 4 ° C i 10 min).
Merk: På grunn av begrenset antall protein skal skilles ut til medium, er det mulig at pellet ikke vil være lett å visualisere etter sentrifugering. Det er derfor viktig å riktig orientere røret før sentrifugering og ta vare ikke for å forstyrre forventningsfull pellet plasseringen under fjerning av nedbryting. - Forkaste nedbryting og vaske pellet to ganger med kjølt aceton før det re sentrifugering (17 000 × g, 4 ° C i 10 min).
- Nøye fjerne og slette nedbryting før luft-tørking eventuelle gjenværende aceton i avtrekksvifte.
- Resuspend protein pellet i en passende utvinning buffer i forberedelse til endepunktet analyse komplett sekretoriske protein profiler og/eller personlige mål proteiner (f.eks., SDS sider, immunoblotting).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og Figur 2 viser representant resultatene av immunofluorescence lokalisering av DNM i musen caput bitestikkel. Hver av de tre DNM isoformene undersøkt vise forskjellige lokalisering profiler. Dermed er DNM1 preget av relativt beskjeden diffus merking av epididymal celler i første segmentet og caput bitestikkel (figur 2A). I motsetning DNM2 isoformen ble først oppdaget i celler i første segmentet, motstridende basal og apikale grensen før blir flyttet til supranuclear domenet i celler i tilstøtende nedstrøms caput segmentet (dvs., soner 2-5) (figur 1B, C). Spesielt, men intensiteten av DNM2 merking gradvis redusert mellom sone 2 til 5 av caput bitestikkel, et resultat som i hovedsak gjenspeiler sekretoriske aktiviteten til disse epididymal segmenter21 (figur 1B, C). Følgelig ble supranuclear merkingen av DNM2 deretter vist samsvare med distribusjon av Golgi apparatet i caput viktigste celler21. Spermatozoa isolert fra samme epididymal region viste intens acrosomal merkingsteknikker for DNM2 (figur 1 d). Som en påminnelse, men var tilsvarende DNM2 merking ikke rutinemessig funnet på luminal spermatozoa innenfor våre vev seksjoner. Dette fenomenet er den vi har støtt på flere anledninger når du bruker en rekke antistoffer målretting ulike epididymal/sperm antigener og antagelig oppstår på grunn av problemer forbundet med antigen presentasjon og/eller maskering i den parafin-embedded vev deler. I alle fall viktigheten slike forskjeller av å gjennomføre parallelle immunofluorescent merking isolert spermatozoa sammen med epididymal vevet seg. Forskjellig fra både DNM1 og DNM2, ble DNM3 isoformen hovedsakelig oppdaget i apikale domene av caput epitelceller (figur 2B, grønne pilene), som ble vist å tilsvarer befolkningen klare celle sub ved co merking med den anerkjente klare celle markøren, ATP6V1B1 (figur 2B, røde piler). På en lignende måte oppsummeres representant markører som har vist seg egnet for å skille de forskjellige epididymal epiteliale celletyper i tabell 229,30,31 , 32 , 33 , 34.
I tillegg til beskrivelsen av teknikkene for den subcellular lokaliseringen av proteiner bosatt epididymal epitel her, rapportere vi også våre nylig optimalisert protokoller for studier av sekretoriske proteiner innkapslet i epididymosomes, små ekstracellulære blemmer som representerer en viktig komponent i luminal miljøet ansvarlig for å støtte sperm modning og lagring22. Kombinert, gir trinn 2 og Figur 3 en detaljert skritt for skritt redegjørelse av metodikken som brukes for isolering av høyanriket bestander av epididymosomes fra musen caput epididymal vev. Spesielt, men er disse metodene lett anvendelig for isolering av alternative bestander av epididymosomes fra flere distale epididymal segmenter. På grunn av potensialet for forurensning av disse prøvene beskrevet vi også strenge karakterisering protokoller som vi rutinemessig bruker for hver epididymosome forberedelse. Disse inkluderer vurdering av størrelsen og heterogenitet mellom de epididymosome med både høy oppløsning elektronmikroskop og dynamisk lysspredning teknikker. Parallelt, vi også benytte immunoblotting strategier for å vurdere anriking av anerkjente ekstracellulære vesicle markører og tilsvarende fravær av proteiner som er karakteristiske for potensielle miljøgifter (dvs., anti-hemoglobin (HBB) som en markør for blod forurensning og anti-arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15) og anti-IZUMO1 antistoffer som markører cytoplasmatiske slippverktøy og sperm forurensning, henholdsvis)22. Selv om vi har funnet at forurensninger er sjeldne, hvis de er, kaste vi umiddelbart epididymosome utarbeidelse.
Den ikke-overlappende lokaliseringen av DNM isoformene i caput bitestikkel bedt om en videre undersøkelse av deres potensielle roller i å regulere epididymal microenvironment. For dette formålet, ble en udødeliggjort mECap18 celle linje benyttet som en i vitro modell å studere epididymal celle sekretoriske aktivitet. Tidligere karakteristikk av denne cellen linjen har vist at det havner en mikset-celle befolkningen, som flekker positivt for enten viktigste eller klare markører. Videre har mECap18 celler også vist egnet for rapportering fysiologiske profiler av epididymal genet og protein uttrykk under forskjellige i vitro behandling regimer35. Før bruk må ble DNM lokalisering vurdert i kulturperler mECap18 celler av settling disse på poly-L-lysine behandlet coverslips (figur 5A) og utsette dem for immunofluorescence gjenkjenning. I samsvar med distribusjon mønstre i caput epididymal vev deler, DNM1 ble oppdaget i cytoplasma av mECap18 celler, mens DNM2 var konsentrert i supranuclear domenet av disse cellene og DNM3 var preget av diskrete fokus på membran flekker i små sub-befolkningen tall (dvs., 11%) av de mECap18 cellene som var ATP6V1B1 positive (figur 5B). Disse dataene bekrefter nytten av mECap18 celle linjen som en verdifull ressurs for å undersøke rollen DNM i å regulere epididymal celle sekretoriske/absorberende aktivitet.
Følgelig beskriver trinn 4 metodene for analyse av mECap18 celle sekretoriske aktivitet. teknikkene som er bredt mottakelig for å vurdere effekten av en rekke forskjellige eksperimentelle forhold. I vår studie brukt vi selektiv farmakologiske intervensjoner for å undertrykke DNM1 og DNM2 før visualisering og måling av profilen for proteiner ut fra mECap18 celler i betinget middels21. Et viktig trekk ved denne analysen, men var å sikre at mECap18 celler ble grundig vasket og kultivert i fravær av FBS kosttilskudd. Mens slikt skritt var avgjørende å utelukke forurensning av betinget medium med FBS avledet proteiner, likevel bærer attendent risikoen for negativt påvirker mECap18 cellevekst og/eller levedyktighet. Kontrollere for denne muligheten, vi bemerket at mECap18 celle linjen tolerert FBS fri kultur og innføring av DNM hemmere for varigheten av våre inkubasjon vinduet (dvs., 12 h). Faktisk, denne gang løpet, celle levedyktighet forble over 90% i alle eksperimentelle gjentak. Denne tilnærmingen kan fungere som en nyttig proof-of-concept strategi å identifisere funksjonen til bestemte epididymal proteiner før du forplikter deg til investeringer i genet manipulasjon strategier.
| Varme indusert epitope henting løsning | 10 mmol/L natriumsitrat | 50 mmol/L Tris (pH 10.5) |
| Tid | 3 min | 3 min |
| 6 min | 6 min | |
| 9 min | 9 min | |
| 12 min | 12 min |
Tabell 1 : Generelle betingelser for optimalisering av varme-indusert antigen henting for bruk med parafin-embedded epididymal seksjoner. Fiksering prosessen kan være problematisk som forskjellige epitopes ofte krever bruk av ulike fiksering teknikker, og dermed nødvendiggjør at metodikken er optimalisert for hver antigen.
| Tarmepitelet type | Distribusjon | Markør | Referanser (PMID) |
| Viktigste celle | Hele bitestikkel | AQP9 | 11027599, 17360690 |
| Klare celle | Caput, corpus og cauda | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
| Basal celle | Hele bitestikkel | CLDN1 | 11159859, 21441423 |
| Smale celle | Første segmentet | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
Tabell 2 : Representant markører egnet for påvisning av ulike primære epididymal epitel celletyper.
Figur 1: romlige uttrykket DNM 2 i proksimale musen bitestikkel. (A) skjematisk modell av bitestikkel viser partisjonering på musen bitestikkel i 10 soner fysisk atskilt septa som Turner og kolleger20. I denne modellen, sone 1 tilsvarer første segmentet, soner 2-5 tilsvarer caput bitestikkel, soner 6-7 tilsvarer corpus bitestikkel og soner 8-10 representerer cauda bitestikkel. (ABC) Immunofluorescence lokalisering av DNM2 avslørt sone-spesifikke distribusjonsmønstrene (angitt med hvitt pilhode og piltastene). Grensen mellom sone 1 og 2 er avgrenset av en prikket linje eller merket med gule piler. (D) DNM2 er også uttrykt i peri-acrosomal domenet spermatozoa isolert fra caput bitestikkel. Men ble ingen slike flekker rutinemessig oppdaget i luminal spermatozoa i de tilsvarende epididymal delene. EP, epitelceller; l, lumen; Neg., sekundær antistoff eneste kontrollen. Eksperimenter ble kopiert på materiale fra tre dyr og representative immunofluorescence bilder presenteres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Immunofluorescence påvisning av DNM 1 og DNM 3 i musen caput bitestikkel. (A) lokaliseringen av DNM136 ble undersøkt i musen caput bitestikkel. (B) co lokalisering av DNM336 og den klare celle markøren, ATP6V1B137 i musen caput bitestikkel. Denne analysen bekreftet at både DNM3 (grønn pil) og ATP6V1B1 (røde piler) bor i befolkningen klare celle sub men vise minimal sub mobilnettet overlapping. EP, epitelceller; int, interstitium; l, lumen; SP, sperm; Neg., sekundær antistoff eneste kontrollen. Cellen kjerner var counterstained med DAPI (blå). Eksperimenter ble kopiert på materiale fra tre dyr og representative immunofluorescence bilder presenteres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk isolasjon protokollsettet for anriking av musen caput epididymosomes. Etter disseksjon, er caput epididymal vev nedsenket i en dråpe BWW medium og en avbildning for å frigjøre luminal innholdet. Luminal væske blir så filtrert gjennom en 70 µm membran og resulterende suspensjon er centrifuged øke hastigheten for å pellets eventuelle gjenværende celle rusk. Ryddet suspensjon deretter lastet på toppen av en usammenhengende tetthet gradert (iodixanol løsning) og utsatt for overnatting ultracentrifugation. Epididymosomes deling i fraksjoner 9-11, hvilke er gruppert, vasket via fortynning i PBS og tilbake til ultracentrifuge å pellets til epididymosomes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: vurdering av epididymosome renhet. Tolv lik fraksjoner ble gjenopprettet etter ultracentrifugation på graderingen og en aliquot av hver forberedt for (A) protein og RNA kvantifisering, (B) størrelse heterogenitet vurdering ved å bruke dynamiske lysspredning og (C). immunoblot analyse av epididymosome markør distribusjon. Ekstra karakterisering trinn inkludert (D) to-merking av epididymosomes konsentrert på aldehyd/sulfat latex perler, (E) overføring elektronmikroskop vurdering og (F) immunoblot vurdering av spermatozoa (Sperm) og røde blodlegemer (RBC) forurensning med anti-arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15, cytoplasmatiske slippverktøy/sperm forurensning) eller anti-hemoglobin (HBB, RBC forurensning). Immunoblots ble også undersøkt med kjente epididymosome Last (26S proteasome ikke-ATPase regulatoriske delenhet 7, PSMD7, varme sjokk protein 90kDa beta medlem 1, HSP90B1, og beta tubulin, TUBB). Disse dataene ble opprinnelig publisert i vitenskapelige rapporter (PMID: 27549865) og har blitt gjengitt her med tillatelse fra utgiveren, Springer natur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Immunofluorescence påvisning av DNM isoformene i mECap18 celler avsløre distribusjon mønstre som samsvar med de oppdaget i caput epididymal vev. (A) skjematisk av dekkglassvæske forberedelse til sterilt mECap18 cellekultur. (B) representant immunofluorescence bilder av DNM farging avdekket mobilnettet distribusjon mønstre (piler og innfelte (dual merking av DNM3 og klare celle markør ATP6V1B1)) som avspeilet de oppdaget i epididymal vev inndelinger. Cellen kjerner var counterstained propidium iodide (PI, rød) eller DAPI (blå). Eksperimenter ble kopiert på materiale fra tre dyr og representative immunofluorescence bilder presenteres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Disse studiene innlemmet bruken av Bouins fast epididymal vev som hadde vært utsatt for parafin innebygging og snitting standardprotokoller. Bouins etappe, den stabiliserende løsningen består av en blanding av formaldehyd, pikrinsyre og eddiksyre, med hver komponent har en bestemt og utfyllende funksjon. Dermed formaldehyd reagerer med primære aminer til protein cross-links, pikrinsyre trenger sakte vevet danner salter og dermed koagulering av grunnleggende proteiner og omvendt, eddiksyre raskt trenger vevet og fører koagulering av atomer syren. Disse kombinert egenskapene har skapt Bouins som valgfrihet for bevaring av morfologiske detaljer og bruken er rapportert i litteraturen epididymal. Bouins løsning er imidlertid ikke uten begrensninger, inkluderer tilbøyelighet for etappe, den stabiliserende indusert fluorescens og formaldehyd indusert cross-linking som kan maskere målet antigener.
Potensialet for bakgrunnen fluorescens nødvendiggjør bruk strenge negative kontrollene, som i våre studier inkluderer unnlatelse av primære antistoffer, unnlatelse av sekundær antistoffer og hvor reagensene er tilgjengelig, bruk av primære antistoffer preabsorbed mot den immunizing peptid som de ble generert. Detaljer av slike kontroller er eksemplifisert i vår forrige studie av dynamin DNM uttrykk i mus bitestikkel21. Ideelt sett slike resultater bør også godkjennes ved hjelp av vev fra knockout dyr, men dette materialet er ikke alltid lett tilgjengelig. I søker å motvirke sekundære problemet med krysskoblet eller kjemisk endret antigener, er det ofte nødvendig å utføre noen form for antigen henting for å avsløre epitopes endres av fiksering og dermed gjenopprette deres potensial for antistoff bindende. Metodene som er brukt for henting avhenger av mange variabler, inkludert mål antigen, antistoff, vev type og metoden for fiksering. Men har den mest brukte teknikker anvendelse av enten varme-mediert eller proteolytisk indusert antigen henting. De tidligere funksjonene som vår favoritt adgang på grunn av en høyere suksessrate for å gjenopprette immunoreactivity, med detaljer om den varme regimer og henting løsninger vi vanligvis bruker som dokumentert i tabell 1. Vi forsiktig imidlertid at dette er ikke en uttømmende liste, og til slutt optimalisering av antigen henting for hver kombinasjon av protein mål/antistoff krever forstudier bruker en matrise av tid og temperatur pH kombinasjoner. Ekstra hensyn inkluderer potensialet for varme henting framprovosere vevsskade og/eller forårsake artefactual merking. Dermed, i tillegg til anvendelsen av negative kontrollene dokumentert ovenfor, vi rutinemessig innlemme positiv kontroller med antistoffer, som anti-Golgin-97, som anerkjenner distinkte mobilnettet organeller.
I arbeidet med å etablere om proteiner som tilhører familien DNM oppfylle overflødig, i motsetning til utfyllende, funksjoner i epididymal vev, har vi funnet det spesielt lærerikt å utføre to merking eksperimenter som illustrert i figur 2B. Denne strategien innebærer sekvensiell merking av vev seksjoner med par primære antistoffer (oppvokst i ulike arter) fulgt riktig sekundære antistoffer konjugert til ulike fluorophores. En forvirrende funksjon som noen ganger oppstår i å utføre disse to merking studier er imidlertid uforlikelighet av antigen henting protokollene trengs for optimal merking med hver primære antistoff. Denne begrensningen oppstod ved co merking av DNM 2 og Golgin-97 i musen caput bitestikkel, fører oss bruke påfølgende føljetong seksjoner (i motsetning til den samme delen)21. En av disse metodene er imidlertid svært nyttig i forbindelse med tillegge protein uttrykk til en bestemt celle type blant dem i pseudostratified epididymal epitel. Med dette målet i tankene, har vi inkludert en liste over representant celle type markører og deres rapporterte distribusjonsmønstrene langs den epididymal tubule (tabell 2). Når man ønsker å gå utover celle type og begynne å utforske subcellular distribusjon av målet proteiner, tilbyr bruk av dobbel merking med anerkjent organelle markører, som Golgin-97, forskjellige fordeler. Eventuelt forblir bruk av høy oppløsning elektronmikroskop parallelt med immunogold merkingsteknikker metoden for valg for detaljert ultrastructural lokalisering og validering av flekker mønstre ved hjelp av immunofluorescence21 .
Blant begrensningene som utgjør studiet av epididymosomes er deres lille størrelse og vanskelighetene med å skaffe tilstrekkelige mengder for detaljert endepunktet analyser, spesielt i ofte brukte laboratorium arter som musen. Men ved å utnytte den banebrytende studier Sullivan og kolleger38,39,40, har vi kunnet optimalisere robust metode for epididymosome isolert fra mus modell (se trinn 2). Vi stress, men behovet for å innføre strenge kontroller å vurdere og fysiske egenskaper av beriket epididymosome bestander41 på grunn av potensielle forurensning fra spermatozoa, cytoplasmatiske dråper og/eller blodbårne exosomes ( se Figur 4). For dette formålet, vi rutinemessig bruker en kombinasjon av: (i) høy oppløsning elektronmikroskop visualisere størrelsen og heterogenitet epididymosome utarbeidelse, (ii) beregning av gjennomsnittlig partikkel størrelse og heterogenitet (iii) konsentrasjonen av den epididymosomes på 4 µm aldehyd/sulfat latex perler og fluorescerende merking av anerkjente exosome overflate markører, inkludert CD9 og FLOT1, og (iv) immunoblotting av isolerte epididymosomes med en rekke antistoffer anbefales for eksperimentell validering av exosomes (f.eks., anti-CD9, anti-FLOT1), så vel som negative kontroller tilsvarer antigener som skal begrenses til spermatozoa (anti-IZUMO1), sperm cytoplasmatiske dråper (anti-ALOX15) eller blod (anti-HBB)22. Hvis disse standarder er oppfylt, så de epididymosome forberedelsene isolert er lett mottakelig for bruk i nedstrøms programmer inkludert co inkubasjon med spermatozoa og/eller Last profilering analyserer22,42, begge er kraftig tilnærminger for å øke vår forståelse av rollen epididymosomes i å regulere epididymal sperm modning1.
I denne studien beskrive vi anvendelsen av en SV40-udødeliggjort musen caput epididymal epitel (mECap18) cellen linje, som vi har benyttet for å studere involvering av DNM i regulering av epididymal sekretoriske aktivitet21 i tillegg til virkningen av miljømessige giftstoffer på epididymal fysiologi43. En viktig funksjon i mECap18 celle linjen er at det viser fenotypiske stabilitet mellom passasjer og funksjoner både rektor og tydelig celler21,35,44representant innbyggere. Forhold til primære epididymal cellekulturer, viser mECap18 celle linjen også toleranse for dyrking i fosterets kalv serum gratis medium, som utvider varighet og eksperimentelle tiltakenes type og disse cellene kan bli utsatt for, mens også ettergivende gjenopprette en høyere overflod av utskilles proteiner fra betinget medium. En begrensning av mECap18 celle linjen, er imidlertid at det har blitt udødeliggjort og kan dermed reagerer ulikt stress og / eller immun-relaterte stimuli sammenlignet med det primære cellen kulturer eller cellene gave i vivo. Med denne begrensningen i tankene, er det anbefalt å sammenligne resultatene med mECap18 celler i vivo svar når det er mulig. I sammendraget markere protokollene beskriver vi nytten av denne cellen linjen som et verktøy til å begynne å studere funksjonaliteten til målet proteiner i caput bitestikkel. Faktisk, i kombinasjon med bruk av kommersielle protein hemmere og/eller genomet-redigeringsverktøy (for eksempel CRISPR-Cas9), mECap18 celle linjen har betydelig potensial til å løse mekanistisk grunnlaget for epididymal funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne National Health and Medical Research Council av Australia prosjektet Grant APP1103176 til støtte for dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
References
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
- Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
