Здесь мы приводим иммунофлюоресценции локализации Динамин для иллюстрации протоколы для обнаружения белков в парафин врезанных мыши эпидидимальных секций и тех, кто увековечен эпидидимальных клеточной линии (mECap18). Мы также описывают протоколы для изоляции секреторной белков от эпидидимальных жидкости и кондиционером ячейки СМИ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ эпидидимальных белкового синтеза и секреции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Млекопитающих придатка генерирует один из самых сложных жидкостей внутрипросветная любой эндокринной железы с целью поддержки после яичка созревания и хранения сперматозоидов. Такая сложность возникает из-за совместная деятельность секреторных и освоения накладки эпителиальных клеток. Здесь мы описываем методы для анализа эпидидимальных белкового синтеза и секреции, сосредоточив внимание на модели белков семейства Динамин (ДНМ) mechanoenzymes; большие GTPases, которые имеют потенциал, чтобы регулировать двунаправленным мембраны оборота событий. Для изучения экспрессии белков в эпидидимальных ткани мы описываем надежной методологии Этикетировочный иммунофлуоресценции белков-мишеней в парафин врезанных секций и последующего обнаружения пространственного распределения этих белков через иммунофлуоресценции. Мы также обсудим оптимизированный методологии для изоляции и характеристика exosome как пузырьки, известный как epididymosomes, который выделяется в эпидидимальных люмен участвовать в межклеточные связи с созревания сперматозоидов. Как дополнительный подход мы также описывают иммунофлюоресценции обнаружение целевых белков в увековечен SV40 мыши caput эпидидимальных эпителия (mECap18) клеток линии. Кроме того мы обсуждаем утилита mECap18 клеточной линии как модель подходит в пробирке с для изучения регулирование эпидидимальных секреторную активность. Для этой цели мы описываем культивирования требования для поддержания линии клеток mECap18 и использование селективного фармакологических ингибирование схем, которые способны влиять на их профиль белка секреторных. Они легко оценить через уборки кондиционером питательной среды, концентрация секретируемые белки через трихлоруксусной кислоты/ацетон осадков и их последующего анализа через SDS-PAGE и immunoblotting. Мы утверждаем, что эти комбинированные методы подходят для анализа альтернативных эпидидимальных белковых мишеней в качестве прелюдии к определению их функциональной роли в созревания сперматозоидов и/или хранения.
Введение
Сперматозоиды всех видов млекопитающих приобретать потенциал для отображения вперед прямолинейное и оплодотворить яйцеклетку во время их продолжительного спуска через придатка, узкоспециализированные региона мужской экстра яичка канальные системы, которая может 7-14 дней для навигации (в зависимости от вида)1. Из-за экстремальных конденсации отцовской хроматина и пролития часть цитоплазмы, которая сопровождает чувствующего сперматозоидов в яичках их последующее функционального созревания управляется исключительно их взаимодействия с эпидидимальных микроокружения. Это окружение в свою очередь, создается секреторную и освоения активность Сома эпи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные процедуры, связанные с коллекцией тканей животных были утверждены университета Ньюкасла животных уход и Комитета по этике.
1. иммунофлюоресценции окрашивания от парафин врезанных эпидидимальных секций (рисунки 1 и 2)
- Сразу же после эвтаназии взрослых мышей через CO2 ингаляции (швейцарский мышей, более 8 недель), тщательно анализировать придатка (используя хирургические ножницы и щипчики) бесплатно вышележащих соединительной ткани и жира и погрузиться в Bouin с фиксатором решение (> 10 раз объем/ткани вес) для фиксации на ночь.
- Стирать ткани с 70% этанол с 2 × изменения ежедневно в течение....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 и Рисунок 2 представителя результаты иммунофлюоресценции локализации DNM в мыши caput придатка. Каждый из трех изоформ DNM расследование профили отображения отдельных локализации. Таким образом DNM1 характеризуется относительно скромных рассеянного маркировки эпидидимальных клеток на протяжении первоначального этапа и caput придатка, (рисунок 2A). Напротив, DNM2 изоформы вп.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эти исследования включено использование Буэна в фиксированной эпидидимальных ткани, которые подвергались встраивание парафин и стандартные протоколы секущей. Буэна фиксирующие решение состоит из смеси формальдегида, Пикриновая кислота и уксусная кислота, с каждым компонентом, имеющие конкретные и взаимодополняющие функции. Таким образом формальдегид реагирует с первичных аминов в форме белка перекрестные ссылки, пикриновой кислоты медленно проникает в ткань, образуя соли и следовательно коагуляции основных белков, и наоб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы хотели бы признать национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии проект Грант APP1103176 за поддержку этой работы.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: поликлональное
Микроцентрифуга Большой 150 Большой орбитальный шейкер Ratek OM7 Лабораторный pH-метр MeterLab PHM220
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Антитело к динамину 1 | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: поликлональное |
| антитело Dynamin 2 | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: поликлональное |
| антитело к динамину 3 | Proteintech | 14737-1-AP | |
| антитело ATP6V1B1 | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: поликлональное |
| антитело к CD9 | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Крыса, Isotype: IgG, Class: моноклональное |
| антитело Flotillin-1 | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: поликлональное |
| антитело ALOX15 | Abcam | ab80221 | Хозяин вид: Кролик, <сильный>Изотип: IgG, <сильный>Класс: поликлональное |
| антитело TUBB | Santa Cruz | sc-5274 | Хозяин вид: Мышь, <сильно>Изотип: IgG, <сильно>Класс: моноклональное |
| антитело к PSMD7 | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: поликлональный |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: поликлональный |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Осел, Isotype: IgG, Class: поликлональный |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Осел, Isotype: IgG, Class: поликлональный |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: поликлональный |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host вид: Коза, Isotype: IgG, <сильный>Класс: поликлональный |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | <сильный>хозяин вид: Коза, <сильный>Изотип: IgG, <сильный>Класс: поликлональный |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Хозяин вид: Коза, <сильный>Изотип: IgG, Class: поликлональный |
| 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| пропидия йодид (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| бычий сывороточный альбумин (BSA) | Sigma | A7906 | |
| фетальная бычья сыворотка (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-глутамин | Thermo | 25030-081 | |
| пенициллин/стрептомицин | Thermo | 15140-122 | |
| 5&альфа;-андростан-17&бета;-ол-3-онC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| пируват натрия | Thermo | 11360-070 | |
| Трипсин-этилендиаминтетрауксусный кислота (ЭДТА) | Sigma | T4049 | |
| Параформальдегид (PFA) | EMS | 15710 | |
| Ксилол | VWR Химикаты | 1330-20-7 | |
| Этанол | VWR Химикаты | 64-17-5 | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Цитрат натрия | Sigma | S1804 | |
| Tris | Астральный | 0497-5КГ | |
| Глицерин | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-диазабицикло-(2.2.2)-октановое число | Sigma | D2522 | |
| Поли-L-гизин | Sigma | P4832 | |
| Тритон X-100 | Sigma | 78787 | |
| Трипановый синий | Sigma | T6146 | |
| Трихлоруксусная кислота | Sigma | T9159 | |
| Ацетон | Ajax Finechem | A6-2,5 л GL | |
| сахароза | Sigma | S0389 | |
| Poly (виниловый спирт) | Sigma | P8136 | |
| D-глюкоза | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Градиент плотности Medium Sigma | D1556 | ||
| Флуоресцентная микроскопия | Zeiss | Axio Imager A1 | |
| Ультрацентрифуга | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Инкубатор Eppendorf | 5424R | ||
| орбитальный шейкер | Heracell | ||
| Микроволновая печь | LG | MS3840SR/00 | |
| Жидкоотталкивающий маркер для слайдов | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6-луночная пластина | CELLSTAR | 657160 | |
| 12-луночная пластина | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0,45 &; m фильтр | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Беспыльная бумага | KIMTECH | 34155 | |
| Ультрацентрифуга пробирка (2,2 мл, 11 & 35 мм) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ультрацентрифуга пробирка (3,2 мл, 13 & 56 мм) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Клеточное сетчатое фильтр 70 &микро; m Нейлон | FALCON | 352350 | |
| Чашка Петри 35 & 10 мм с кулачками | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Слайд банка | TRAJAN | #23 319 00 |
Ссылки
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59(2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
