Questo protocollo descrive l'impianto di una finestra di vetro sul midollo spinale del mouse per facilitare la visualizzazione mediante microscopia intravitale.
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Articolo metodologico
Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per la laminectomia del midollo spinale e impianto della finestra di vetro per l'imaging in vivo del midollo spinale del topo. Un vaporizzatore digitale integrato viene utilizzato per ottenere un piano stabile di anestesia a bassa portata di isoflurane. Una singola colonna vertebrale viene rimossa e un vetro di copertura disponibile in commercio viene sovrapposto a un sottile letto di agarose. Una piastra posteriore in plastica stampata in 3D viene quindi apposta sulle spine vertebrali adiacenti utilizzando adesivo tissutale e cemento dentale. Una piattaforma di stabilizzazione viene utilizzata per ridurre l'artefatto di movimento dalla respirazione e dal battito cardiaco. Questo metodo rapido e senza morsetti è adatto per la microscopia acuta multi-fotone a fluorescenza. I dati rappresentativi sono inclusi per un'applicazione di questa tecnica alla microscopia a due fotoni della vascolatura del midollo spinale in topi transgenici che esprimono eGFP:Claudin-5 - una proteina di giunzione stretta.
Introduzione
I modelli animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti, se combinati con la microscopia intravitale, forniscono una potente piattaforma per affrontare la biologia e la fisiopatologia. Per applicare queste tecniche al midollo spinale, sono necessari protocolli specializzati per preparare il midollo spinale per l'imaging. Una di queste strategie è quella di condurre un impianto della laminectomia e del midollo spinale. Le caratteristiche principali di un protocollo ideale di microscopia includono la conservazione della struttura e della funzione del tessuto nativo, la stabilità del campo di imaging, il tempo di elaborazione rapido e la riproducibilità dei ris....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti seguono i protocolli dell'Università dell'Illinois, del Chicago Institutional Animal Care e del Comitato d'uso. Questa è una procedura terminale.
1. Preparazione del reagente
- Preparare il fluido spinale cerebrale artificiale (aCSF) per contenere 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucosio, 10 m HEPES, 2 mM MgCl2, 6H2O, 2 mM CaCl22H2H in ddH2O. Filtro Sterile e congelamento in singoli usi. Riscaldare aCSF a bagnomaria a 39 gradi centigradi prima dell'uso.
- Caldo basso punto di fusione agarose (2%) in aCSF fino a completa dissoluzione in un bagno d'acqua....
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Risultati
Le vetrate impiantate e la microscopia a due fotoni intravitale forniscono uno strumento utile per valutare i cambiamenti dinamici nelle proteine del SNC. L'integrità funzionale della BBB è influenzata dall'espressione, dalla localizzazione subcellulare e dai tassi di turnover delle proteine di giunzione strette7. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine di giunzione strette subiscono un rimodellamento rapido e dinamico a stato costante8<.......
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Discussione
Il metodo qui descritto consente l'imaging stabile del midollo spinale nei topi attraverso una finestra di vetro. Questo metodo è stato applicato per valutare il rimodellamento BBB in topi transgenici eGFP:Claudin5/- che esprimono una proteina di giunzione bBB fluorescente, ma potrebbe essere applicato altrettanto bene per gli studi su eventuali proteine fluorescenti o cellule nel midollo spinale.
Sono stati sviluppati diversi metodi per laminectomia e stabilizzazione del midollo spinale. Tutt.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
S.E. Lutz è supportato dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, sotto Grant KL2TR002002 e dai fondi di start-up dell'Università dell'Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford è supportato da RO1 MH084874. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali della NIH. Gli autori ringraziano Dritan Agalliu nel Dipartimento di Neurologia del Columbia University Medical Center per i topi Tg eGFP:Claudin-5, discussioni scientifiche e approfondimenti sullo sviluppo del protocollo chirurgico e delle applicazioni di imaging. Gli autori ringraziano Sunil P. Gand....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Stampante 3D | Raise3D | Pro2 | Per la stampa di piastre posteriori |
| PLA Filamento per stampa 3D | Inland | PLA+-175-B | Materiale per stampa 3D in plastica nera |
| Software CAD 3D Software Dassault | Systèmes | Solidworks | utilizzato per progettare forme 3D Software per |
| stampanti 3D | Raise3D | Software Ideamaker | Software utilizzato per interfacciarsi con la stampante 3D |
| Piastra posteriore ovale stampata in 3D | personalizzata | Campo di imaging stabilizzante | |
| Microscopio da dissezione chirurgica | Leica | M205 C | Dotato di Leica FusionOptics, obiettivo Planapo 0,63x della serie M e tavolino scorrevole |
| Fotocamera per microscopio Fotocamera | a colori Leica | MC170 | HD per la visualizzazione del campo chirurgico |
| Tavolino scorrevole | Leica | 10446301 | Lo stadio di planata è costituito da due piastre metalliche. La piastra di base è fissa. La piastra superiore scorre su un'interfaccia ingrassata per consentire il movimento rotatorio e lineare. |
| Stazione chirurgica e forcella di stabilizzazione | Whale Manufactoring | Laminectomia | personalizzata |
| Unità di erogazione di isoflurano a basso flusso SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Somministrazione chirurgica di anestesia con vaporizzatore digitale integrato |
| Perno di montaggio da 1,5 pollici in acciaio inossidabile | ThorLabs | P50/M | Per il montaggio della stazione chirurgica su tavolo ottico per l'imaging |
| a due fotoniForca di serraggio svasata per montaggio da 1,5" Post | ThorLabs | PF175 | Per stabilizzare la stazione chirurgica montare su tavolo ottico per l'imaging a due fotoni |
| Microdrill osseo ideale | Apparecchio Harvard | 72-6065 | Assottigliamento dell'osso per laminectomia |
| Bagno d'acqua | Fisher | Scientific 15-462-10 | Soluzione salina riscaldante |
| Pistola per cauterizzazione | FST | 18010-00 | Cauterizzazione minore sanguina |
| Termoforo | Benchmark BF11222 | 1,9" x 4,5" riscaldatore in silicone con 20" Elettrocateteri in teflon, 10W, 5V | |
| Sonda rettale termoaccoppiata di tipo K | Physitemp | RET3 | Misurazione della temperatura corporea del mouse |
| vaselina | Sigma | 8009-03-8 | Sonda rettale lubrificante |
| Regolatore termico regolato in feedback | NA personalizzato | Le | alternative disponibili in commercio includono la serie Physitemp TCAT |
| PVA Lance chirurgiche per gli occhi | Beaver-visitec international | 40400-8 | Trimmer elettrico per l'assorbimento del sangue |
| Wahl | 41590-0438 | Lama per rifilare la pelliccia di topo | |
| , #11 | FST | 14002-14 | Pinze per strumenti chirurgici |
| , #5 | FST | 11254-20 | Pinze per strumenti chirurgici |
| , #4 | FST | 14002-14 | |
| Pinza dentata per strumenti chirurgici Titatnium | WPI | 555047FT | Strumento chirurgico |
| Forbici per iride in titanio | WPI | 555562S | Strumento chirurgico |
| Adesivo per tessuti Vetbond | 3M | 084-1469SB | Preparazione della superficie del tessuto per acrilico dentale |
| Vassoio di miscelazione in ceramica | Jack Richeson | 420716 | Miscelazione dell'agente acrilico dentale con l'accelerante |
| Orthojet acrilico dentale | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Incollaggio permanente della piastra posteriore al tessuto |
| Piccolo vetro di copertura rotondo, spessore #1, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | finestra ottica |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | Per aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | Per aCSF |
| Glucosio | Fisher Scientific | 50-99-7 | Per aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Per aCSF |
| MgCl2& punto medio; 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | Per aCSF |
| CaCl2· 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Per aCSF |
| Carprofene | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Acqua batteriostatica | Henry Schein | 2587428 | Diluente per carprofene |
| Isoflurano | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anestesia |
| Soluzione di ringer lattato | Baxter | 0338-0117-04 | Idratazione per il topo |
| Agarosio High EEO | Sigma | A9793 | punto di gel 34-37 gradi C |
| Unguento lubrificante oftalmico | Akwa Lacrime | 68788-0697 | Prevenire l'essiccazione corneale |
| MOM Microscopio a due fotoni | Sutter |
Riferimenti
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journa....
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Ristampe e permessi
