侵略を勉強し、膀胱癌の治療を評価するための 3次元細胞培養システム

Summary

膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の 3次元の文化を取り入れた膀胱がん浸潤モデルをご紹介します。侵襲的プロセスの機能を定義するため、治療薬のスクリーニングは、この手法が役に立ちます。

Abstract

膀胱癌は、重大な健康問題です。以上 16,000 人は膀胱癌から米国で今年を死ぬと推定されます。膀胱癌の 75% は非侵襲と転移する可能性は低い、約 25% は浸潤性増殖パターンに進行します。侵襲的な癌患者の半分までは致命的な転移再発を開発します。したがって、膀胱がんに侵襲的な進行のメカニズムを理解することは患者の転帰を予測して致死的な転移を防ぐために重要です。この記事では腫瘍細胞や膀胱腫瘍微小環境における発生する生体内の状態を模倣する間質成分の混入を可能にする三次元がん浸潤モデルを提案する.このモデルは、タイムラプス イメージングを使用してリアルタイムで侵襲的プロセスを観察し、ブロックの侵入する可能性のある共焦点蛍光イメージングと画面の化合物を使用して関与する分子経路を調査する機会を提供します。このプロトコルは、膀胱がんに焦点を当てて、侵略と他の腫瘍型で運動性を調べるための同様のメソッドが使える可能性が高いです。

Introduction

侵略は、癌の進行、転移に必要なより低い生存率と予後に関連付けられた重要なステップです。ひと膀胱癌、尿路、世界で年間約 165,000 死亡を引き起こす最も一般的な悪性腫瘍で癌の病期、治療、予後に直接関係侵略¹の有無。膀胱癌症例の約 75% は、局所切除と非筋肉侵襲とに管理されます。対照的に、筋層浸潤性膀胱癌 (すべてのケースの約 25%) は転移率の高い強い腫瘍であり、積極的な集学的治療^2,3と扱われます。したがって、侵略を誘発する分子経路を理解することはより侵襲的な進行のリスクを特徴付ける侵襲的な進行を防ぐことができる治療上の介在を開発するために不可欠です。

腫瘍浸潤進行複雑な三次元 (3 D) 環境で発生し、他の種類の免疫細胞、線維芽細胞、筋細胞を含む細胞の基底膜、実質他の腫瘍細胞と腫瘍細胞間相互作用を含むと血管血管内皮細胞。彼らはリアルタイムで浸潤過程の微視的監視を許可していないので、アッセイ系はよく癌細胞浸潤⁴、しかし、これらのシステムを量的に使用されて (例えばTranswell) 透過性のサポートは限られて、さらに染色し、分子解析のためのサンプルの取得は困難です。生体外でシステムの利便性と定義されたアイソレータケージ ....

Protocol

1. がん回転楕円体の成長

1. 細胞からの成長
   1. 従来の付着の下で文化ひと膀胱がん細胞は細胞の培養条件と 5% CO₂に付属している 37 ° C の定温器の維持します。細胞を維持 < 90% の confluency。
      注: 使用培地はダルベッコ 4.5 g/L、D-グルコース ピルビン酸ナトリウム 110 mg/L、L-グルタミンを含む最低限不可欠なメディア (DMEM) を変更し、10% 牛胎児血清 (FBS) このプロトコル全体に付属しています。
   2. 実験の開始前に 1 日 trypsinize (0.25% を使用して、トリプシン-EDTA) 細胞、細胞濃度を定量化し、6 も超低取り付けプレートの各ウェルに 3 mL の培地で 1 x 10 の⁶セルを配布。
   3. ≥16 h の 37 ° C で低接着条件のセルを孵化させなさい。これは細胞に十分な時間を許可する必要がありますほとんどの膀胱癌細胞のスフェロイドに集計します。
      注: 回転楕円体の形成は、倒立明視野顕微鏡による観察できます。個々 の実験に最適なサイズおよび回転楕円体の数によって異なりますが、我々 は 150 μ m 50 μ m から径と回転楕円体が一般的に 20 X 対物レンズを用いたタイムラプス イメージングに適しているを見つけます。
   4. 追加の細胞の種類、線維芽細胞や免疫細胞に回....

Results

浸潤性膀胱癌腫瘍回転楕円体の作成に成功した細胞または原発腫瘍から適切に大きさで分類された腫瘍スフェロイドの形成が必要です。図 2Aは、4 つのひと膀胱癌細胞株 (UM UC9、UM UC13、UM UC14、253J、および UM UC18) から開発された適切に大きさで分類された回転楕円体を示しています。図 2Bは、コラーゲン マトリックスに埋め込まれた BBN で生成されたマウス膀胱腫瘍から腫瘍の回転楕円体を示しています。前述のようにこれらの球体が埋め込まれた、代表的な画像は、ライブセル イメージングのための顕微鏡を使用してキャプチャされました。イメージング UM UC18 スフェロイド UM-UC14、UM UC13 UM UC9 マウス膀胱腫瘍回転楕円体は、5 倍と 10 倍の対物レンズを使用して検討したに対し、20 X 対物レンズが使われました。

Discussion

ここで癌の進行および転移のために重大である膀胱癌の浸潤のリアルタイム観察を可能にする 3次元腫瘍回転楕円体モデルをについて説明します。このシステムは膀胱癌の浸潤が起こる組織微小環境良い要約する捜査官を許可するさまざまな間質および細胞コンポーネント定款に従う。膀胱がん回転楕円体細胞 (遺伝子組み換え細胞シグナル伝達経路の侵略プロセスに影響を与えるを検討を含む) などのさまざまなソースから生成することができます、プライマリ マウス腫瘍 (ここを参照)。それは可能性も人間の腫瘍の解析に適しています。使用してイメージング システム、に応じてリアルタイムまたは固定して様々 な時点で染色蛍光、蛍光を監視できます。システムは、侵入の潜在的な阻害剤をテストする使用できます。これはシステムを膀胱癌・細胞増殖を評価するために汎用性と強力なツールになります。

温度管理、水分制御、および CO₂供給を提供する気候室と共焦点顕微鏡システムはこのプロトコルで記述されているモデルを構築するための機器の重要な部分です。

細胞生物学、癌研.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ヒト膀胱がん細胞株 UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM 細胞培養液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11995065
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィ	26140079
抗生物質-抗真菌薬 (100x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15240062
トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200056
ウシ血清アルブミン (BSA)	Sigma-Aldrich	A3803
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010023
Costar Ultral-low attachment 6-well cluster	Corning	3471
従来型倒立顕微鏡	Carl Zeiss	491206-0001-000	細胞培養およびスフェロイドのチェックに一般的に使用される
ラットテール由来のコラーゲン1型、高濃度	Corning	354249
Nunc Lab-Tek II チャンバーカバーガラス	Thermo Fisher Scientific	155382
共焦点顕微鏡	Carl Zeiss	LSM800	クライメートチャンバー、マルチロケーションイメージング、Zスタックスキャン機能を備えた共焦点ミスコスコープ
クライオスタットマイクロムトーム	ライカバイオシステムズ	CM3050 S
Zen 2 画像処理ソフトウェア	カールツァイス
パラホルムアルデヒド溶液	電子顕微鏡科学	15710
ImmEdge疎水性バリアPAPペン	ベクトル研究所	H4000
O.C.Tコンパウンド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23730571
Hoechst 33342ソリューション	サーモフィッシャーサイエンティフィック	62249
抗 ATDC (Trim29) 抗体	Sigma-Aldrich	HPA020053
抗サイトケラチン 14 抗体	Abcam	ab7800
抗ビメンチン抗体		Abcam ab24525
ProLong Diamond			封入剤