Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dyrkning og Manipulation af O9-1 neurale Crest celler

Published: October 9, 2018 doi: 10.3791/58346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

ERRATUM NOTICE

Summary

O9-1 er en Multipotente mus neurale crest cellelinje. Her beskriver vi detaljerede trinvise protokoller for dyrkning O9-1 celler, differentiere O9-1 celler til specifikke celletyper og genetisk manipulere O9-1 celler ved hjælp af siRNA-medieret knockdown eller CRISPR-Cas9 genom-redigering.

Abstract

Neurale crest celler (NCCs) overflytter Multipotente stamceller, der kan differentiere sig til forskellige celletyper og give anledning til flere væv og organer. O9-1 cell line er afledt af den endogene mus embryonale NCCs og fastholder sin multipotency. Dog under særlige dyrkningsbetingelser, O9-1 celler kan differentiere sig til forskellige celletyper og udnyttes i en bred vifte af forskning applikationer. For nylig, med en kombination af mus undersøgelser og O9-1 celle undersøgelser, vi har vist, at Hippo signalering pathway effektorer Yap og Taz spiller en vigtig rolle i neurale crest-afledte kraniofaciale udvikling. Selvom de dyrkningsbaserede proces for O9-1 celler er mere kompliceret end den, der anvendes til andre cellelinjer, er cellelinie O9-1 en kraftfuld model for at undersøge NCCs in vitro. Vi præsenterer her, en protokol for dyrkning O9-1 cellelinje for at bevare sin stemness samt protokoller for differentiere O9-1 celler til forskellige celletyper, såsom glatte muskelceller og osteoblaster. Derudover er protokoller beskrevet til at udføre gen tab af funktion undersøgelser i O9-1 celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 sletning og små interfererende RNA-medieret knockdown.

Introduction

Neurale crest celler (NCCs) er Multipotente stamceller-lignende celler med en bemærkelsesværdig vandrende evne og forbigående eksistens under fosterudviklingen. NCC'erne stammer mellem overfladen ectoderm og neuralrøret og migrere til andre dele af embryo under fosterudviklingen1. Baseret på deres funktionelle domæner, kan NCCs inddeles i flere forskellige typer, herunder kranie, trunk, vagus, sakrale, og cardiac NCC'erne. Derudover kan NCCs differentiere sig til flere celle lineages, glatte muskelceller, knogleceller og neuroner, og give anledning til forskellige væv2,3. Udviklingen af NCCs er karakteriseret ved en kompleks række morfogenetiske begivenheder, som er finjusteret af forskellige molekylære signaler. I betragtning af den komplekse regulering af NCCs og deres vigtige bidrag til talrige strukturer, kan dysregulering af NCC udvikling almindeligvis føre til medfødt fødselsdefekter, som tegner sig for næsten 30% af alle menneskelige medfødt fosterskader. Abnormiteter i de neurale crest udvikling kan føre til kløft læbe/gane, fejlbehæftet næse dannelse, syndromer, defekter som en defekt hjerte udstrømning tarmkanalen, eller endda børnedødelighed1,4,5, 6 , 7. forstå de molekylære mekanismer af NCC udvikling er vigtig for at udvikle behandlinger for sygdomme forårsaget af defekter i NCC udvikling. Med brug af forskellige in vitro og i vivo tilgange8,9,10,11,12,13,14 ,15, der er gjort betydelige fremskridt i NCC forskning. In vivo, dyremodeller, herunder kyllinger, padder, zebrafisk og mus, har været brugt til at undersøge NCCs1. Desuden har menneskelige embryoner været brugt til at studere processen med NCC migration i tidlige humane embryonale udvikling16. In vitro, cell modeller for NCC'erne, såsom menneskelige NCCs, der stammer fra patienten subkutant fedt, har været brugt til at undersøge Parkinsons sygdom17. O9-1 NCC linje, som oprindeligt stammer fra masse kulturer af endogene NCCs isoleret fra E8.5 mus embryoner18, er en kraftfuld celle model til at studere NCC'erne. vigtigere, under ikke-differentiere dyrkningsbetingelser, O9-1 celler er Multipotente stamceller-lignende NCC'erne. Under varierende dyrkningsbetingelser, kan O9-1 celler opdeles i fornem celletyper, glatte muskelceller, osteoblaster, chondrocytter og gliaceller18. Da disse egenskaber, er O9-1 celler blevet bredt brugt for NCC-relaterede studier, som undersøger den molekylære mekanisme for Kranio-facial mangler19,20.

Her, detaljerede protokoller leveres for at opretholde O9-1 celler, differentiere O9-1 celler til forskellige celletyper og manipulere O9-1 celler ved at udføre gen tab af funktion undersøgelser med CRISPR-Cas9 genom-redigering og små interfererende RNA (siRNA)- medieret knockdown teknologier. Som et repræsentativt eksempel, er brug af O9-1 celler til at studere Yap og Taz tab af funktion beskrevet. Yap og Taz er de downstream effektorer af Hippo signalering pathway, som spiller en afgørende rolle i celledelingen, differentiering og apoptose. Hippo pathway har også vist sig at være vigtigt i udviklingen og homeostase af flere forskellige væv og organer, samt i patogenesen af forskellige sygdomme20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. De centrale komponenter i Hippo signalering omfatter tumor suppressor sterile 20-lignende kinaser Mst1/2, WW domæne-holdige Salvador stillads protein og store tumor suppressor homolog (Lats1/2) kinaser. Hippo signalering hæmmer Yap og Taz aktivitet og fremmer deres nedbrydning i cytoplasmaet. Uden undertrykkelse fra Hippo, kan Yap og Taz translocate i kerner og fungere som transcriptional Co aktivatorer. Vi for nylig viste, at specielt uvirksomme Hippo signalering effektorer Yap og Taz i mus NCCs ved hjælp af Wnt1cre og Wnt1Cre2SOR drivere resulterede i embryonale dødelighed på E10.5 med svær kraniofacial mangler20. Vi har også udført undersøgelser ved hjælp af O9-1 celler til at undersøge rollen af Yap og Taz i NCC'erne. For at studere Yap og Taz funktion i NCC spredning og differentiering, Yap og Taz knockdown celler blev genereret i O9-1 celler ved hjælp af siRNA, og Yap knockout celler blev genereret ved hjælp af CRISPR-Cas9 genom-redigering. De samme gen tab af funktion strategier kan anvendes til forskellige mål gener i andre veje. Derudover kan gevinst af funktion undersøgelser og Transfektion assays også anvendes på O9-1 celler til at studere genfunktioner og regulering. De protokoller er beskrevet her er beregnet til at blive brugt af efterforskere som guider for dyrkning O9-1 celler til at opretholde Multipotente stemness, differentiere O9-1 celler til andre celletyper forskellige kultur betingelser og til at studere genfunktioner og de molekylære mekanismer for NCC'erne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse før O9-1 cellekultur

Bemærk: Basal medier bruges til O9-1 cellekultur skal har været betinget af Sandos indavlede mus thioguanine/ouabain-resistente (STO) mus fibroblastceller; STO celler skal derfor være fremstillet og forberedt som beskrevet nedenfor før du starter O9-1 cellekultur.

  1. Aktive STO cellekultur
    1. Forberede medier for dyrkning aktive STO celler ved at gøre komplet Dulbecco modificerede Eagles medier (DMEM) med 7% føtal bovint serum (FBS) (embryonale stamceller kultur grade), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 2 mM L-glutamin (endelige koncentrationer er angivet).
      Bemærk: STO medium bruges til dyrkning af aktive STO feeder celler. Penicillin, streptomycin og L-glutamin kan danne nedbør i oplagring; opløses fuldstændigt når der afpipetteres inden brug.
    2. Coat en standard 100 mm celle kultur plade med 0,1% gelatine i 30 min. ved stuetemperatur. Efter inkubationstid, Opsug den ekstra gelatine. Brug pladen umiddelbart efter belægning.
      Bemærk: Alternativt dække pladen med STO medier og forlade pladen i en fugtig inkubator at undgå udtørring af pladen (dette er ment kun til kortvarig oplagring og ikke til lagring brugsklare plader).
    3. Optø STO cellerne hurtigt i et 37 ° C vandbad; Aftør cryovial med 70% ethanol før åbningen, og straks overføre det hele hætteglas af celler til et centrifugeglas.
    4. Tilføje STO media dråbevis til centrifugeglasset; forholdet mellem volumen celle for at medier er 1:10.
    5. Centrifugeres celler ved 180 x g i 3 min på RT.
    6. Mix af blid pipettering og overførsel celler på gelatine-belagt pladen.
    7. Tillad STO celler til at vokse i 24 timer i en standard inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    8. Ændre medium (kun efter cellerne overholde) 24 h efter såning og kassér den gamle medium.
    9. Kontrollere STO celler hver dag under et mikroskop og passage på 80% confluency.
      1. Før du starter STO celle passaging, pels plader med 0,1% gelatine (gelatine volumen er lig med halvdelen af væksten medier volumen for at det pågældende fartøj) i 30 min ved stuetemperatur.
      2. For at passage STO celler, Aspirér vækst medier og vaske cellerne med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) to gange (tilføje PBS i et lige saa stort volumen af vækst medier).
      3. Opsug PBS og tilføje 0,25% trypsin-EDTA (justere lydstyrken efter fartøjets størrelse); derefter inkuberes ved 37 ° C i 5 min.
        Bemærk: For en 100 mm plade, bruge 10 mL af vækst medier og 3 mL trypsin løsning. For en 150 mm plade, bruge 20 mL af vækst medier og 8 mL trypsin løsning. Mængden af wash buffer, der bruges er lig med mængden af vækst medier.
      4. Inaktivere trypsin med et lige saa stort volumen af STO medier. Frø STO celler til nye plader med forholdet fra 1:3 til 1:10.
        Bemærk: En fælles ekspanderende ordningen er at udvide fra én cryovial til en 100 mm plade, derefter til en 150 mm plade, derefter til fire 150 mm plader, og endelig til 16 150 mm plader.
  2. Inaktivering og indefrysning af STO celler
    1. For at forberede 2 x frysning medier, skal du tilføje følgende til STO medier (endelige koncentrationer er angivet): 20% FBS, 20% dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Efter blanding, filter sterilisere 2 x frysning medier (pore størrelse 0,22 µm) og gemme det ved 4 ° C indtil brug. Gøre 2 x indefrysning medier den samme dag af brug og kassere ubrugte indefrysning medier.
    3. Forberede mitomycin C løsning i PBS ved en koncentration på 0,5 mg/mL. For at opløse mitomycin C i PBS, tape flaske på en vortexer og vortex lav indstilling for ca. 45 min. til at opløse partiklerne helt.
      Bemærk: Mitomycin C er lys følsom og svært at opløse.
      Forsigtig: Mitomycin C er akut giftigt og kan forårsage kræft. Håndtere kun med passende personlige værnemidler.
    4. Inaktivere STO celler ved at tilføje en endelig koncentration på 0,01 mg/mL mitomycin C til den eksisterende medier. Der inkuberes i 2 h inde i en standard inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    5. Vask plader (150 mm) med 20 mL PBS to gange efter Inaktiveringen med mitomycin C.
    6. Opsug PBS løsning, adskille celler ved hjælp af 8 mL 0,25% trypsin-EDTA og Inkuber i 5 min. inde i en standard befugtet inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    7. Inaktivere trypsin med 8 mL af STO medier.
    8. Celle opløsning overføres til et centrifugeglas. Kombinere mere end én plade i et centrifugeglas at spare tid. Der centrifugeres i 5 min. ved 180 x g.
    9. Opsug supernatanten og resuspenderes celle i 5 mL PBS.
    10. Brug 10 µL af opløsningen celle til at tælle celler ved hjælp af en hemocytometer. Tælle cellerne i det centrale inddelte torv og mangedoble antallet af 104 til at bestemme antallet af celler pr. 1 mL. Tæller to gange og gennemsnitlig to numre for at få den endelige vurdering af antallet af celler pr. milliliter.
    11. Der centrifugeres celler i 5 min på 180 x g.
    12. Opsug PBS og tilføje 1:1 (efter volumen) STO medier og 2 x indefrysning medier til celle pellet. Justere lydstyrken for en afsluttende celle koncentration af 4 x 106 celler/mL (dette beløb er godt for en 100 mm plade).
      Bemærk: For eksempel fra fire 150-mm plader giver ialt 60 x 106 celler, fryse 4 x 106 celler pr. cryovial, med hver cryovial indeholdende 1 mL af celle løsning. Fire plader give ca 15 cryovials (60/4 = 15). Tilsættes 7,5 mL af STO medier og 7,5 mL af 2 x frysning medier til celle pellet, resuspend og delprøve 1 mL i hver cryovial.
    13. Resuspend af langsomt pipettering indefrysning medier med celle pellet. Der overføres 1 mL af celle løsning til hver cryovial og etiket i overensstemmelse hermed.
    14. Placer cryovials inde en låg Varmekrympende boks (dette giver en langsom afkøling sats, hvilket forbedrer celle overlevelse). Overføre boksen til en-80 ° C fryser i mindst 24 timer før overførsel af cryovial til flydende kvælstof.
      Bemærk: du opnår de bedste resultater, minimere cellen tælle tid, samt tid mellem tilføjes celler 2 x indefrysning media og overføre hætteglas til-80 ° C.

2. O9-1 cellekultur

  1. Forberede O9-1 cellekultur basal medier ved at tilføje følgende i DMEM (endelige koncentrationer er angivet): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential medier (MEM) uvæsentlige aminosyrer, 1 mM natrium pyruvat, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamin, 103 enheder/mL leukæmi hæmmende faktor (LIF; tilsættes umiddelbart inden brug, ikke føjer nyt til stock flaske), og 25 ng/mL fibroblast vækstfaktor-basic (bFGF; tilsættes umiddelbart inden brug, ikke føjer nyt til stock flaske).
  2. Filter sterilisere den basale medier (pore størrelse 0,22 µm) og wrap i folie for at beskytte mod lys.
  3. Indsamle konditioneret basal medier fra inaktiverede STO celler.
    Bemærk: Fortsæt kun efter at have indhentet inaktiverede STO celler. O9-1 basal media indsamlet fra STO celle plader er herefter benævnt konditioneret basal medier.
    1. Tø inaktiveret STO celler hurtigt som beskrevet ovenfor (en cryovial indeholdende 4 x 106 celler er godt for en 100 mm plade og udbytter ca 100 mL aircondition basal medier efter 10 dage af samling). Frø inaktiveret STO celler på gelatine-belagt pladen ved hjælp af STO medier. Tillad celler til at knytte natten over i en standard befugtet inkubator (37 ° C, 5% CO2).
    2. 24 timer efter optøning STO celler, kassere den eksisterende STO medier og erstatte med den basale medier.
      Bemærk: Ikke at tilføje LIF og bFGF til inaktiverede STO celle kultur retter; kun tilføje til O9-1 celle kultur retter.
    3. Hver 24 h, ændre medier ved hjælp af O9-1 basal medier og indsamle de basale medier fra STO celle plader i en flaske. Wrap flasken indeholder konditioneret basal medier i folie for at beskytte mod lys. Gemme alle de indsamlede medier ved 4 ° C.
      Bemærk: Fordi cellerne var inaktiveret, de er muligvis ikke så sundt som de gjorde efter flere dage med indsamlingen; Dette er forventeligt.
    4. Valgfrit for at kontrollere, om forurening, indsamle basal medierne for hver samling dag i forskellige rør (i stedet for en flaske) indpakket i folie. Ved hjælp af en 24-godt plade, placere 1 mL af medier fra hver dag i hver brønd og inkuberes natten over i en standard inkubator til at kontrollere for bakteriel forurening under mikroskop.
      Bemærk: Medierne forbliver en rød farve, hvis der er ingen forurening end ændringer i gul hvis bakteriel forurening er til stede.
    5. Efter indsamling aircondition basal medier for 10 dage, kassere STO cellerne. Kombinere (hvis relevant) alle indsamlet betinget basal medier og filter sterilisere (pore størrelse 0,22 µm) i en steril flaske. Wrap flasken i folie for at beskytte mod lys. Holde den filtrerede konditioneret basal medier ved 4 ° C i højst en måned fra datoen for filter.

3. opretholdelse O9-1 celler

Bemærk: Arbejder O9-1 basal medier er filter steriliseret aircondition basal medier, til hvilke LIF (slutkoncentration 103 enheder/mL) og bFGF (slutkoncentration 25 ng/mL) er tilføjet straks til celle kultur fadet inden brug. Mediet skal være beskyttet mod lys og opbevares ved 4 ° C.

  1. Inddrivelse af O9-1 celler
    1. Langsomt tø stock flasken basalmembranen matrix (f.eks.Matrigel) natten over ved 4 ° C til at forberede delprøver.
    2. Der tilsættes 5 mL af DMEM med 10% FBS til 5 mL af stock basalmembranen matrix membran. Bland godt af pipettering med kolde pipette tips opbevares ved-20 ° C. Holde de oprindelige flaske og alikvot rør på is. Fryse delprøver i forskellige mængder (0,5 mL eller 1 mL alikvoter) afhængigt af eksperiment behov. Undgå fryse-optøning basalmembranen matrix flere gange.
      Bemærk: basalmembranen matrix polymeriserer hurtigt ved stuetemperatur; Brug kolde pipette tips og holde rør kold, når du arbejder for at undgå utilsigtet polymerisering.
    3. Tø en alikvot af matrixen basalmembranen ved 4 ° C eller på is 2 h før du starter eksperimentet. Opbevar ikke matrix ved 4 ° C i længere tid.
    4. Brug filter-steriliseret DMEM med 10% FBS at udvande basalmembranen matrix til en endelig koncentration på 0,5 mg/mL til pels pladerne. Frakke Plader med basalmembranen matrix (0,5 mg/mL) ved stuetemperatur for 1 h. sikre at den fuldt ud dækker pladen (som vist i figur 1).
    5. VIP pladen, når sugning basalmembranen matrix for at undgå at berøre den coatede overflade; tørre plader ved 37 ° C i 30 min. Ikke over tørre overtrukne plader.
      Bemærk: Fortsæt kun når alle medier og reagenser, der er klar til brug (aircondition basal medier, steril-filtreret 10% FBS i DMEM, LIF og bFGF).
    6. Genskab O9-1 celler hurtigt ved at placere cryovial i et 37 ° C vandbad; langsomt swirl hætteglasset indtil løsningen helt slår til væske og gå straks til næste trin.
    7. Overføre alle celle løsning fra cryovial (ca. 1 mL) til en 15 mL centrifugeglas. Tilføj 5 bind af DMEM med 10% FBS (filter steriliseret med et filter porestørrelse på 0,22 µm) og resuspend.
    8. Der centrifugeres i 3 min på 180 x g. Opsug supernatanten uden at forstyrre den celle pellet. Resuspenderes celle (ved at trykke) i konditioneret basal media suppleret med LIF og bFGF. Tælle cellerne ved hjælp af en hemocytometer.
      Bemærk: Konditioneret basal media suppleret med LIF og bFGF er afgørende for at opretholde multipotency i O9-1 cellelinje. Brug pleje til at tilføje de korrekte medier for at undgå utilsigtet Celledifferentiering.
    9. Frø celler fra 10.000 til 15.000 celle/cm2 til en 6-godt plade. Tillad celler til at knytte og vokse i en standard celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) natten før medieskift.
    10. Sikre, at cellerne er knyttet inden vi går videre til at ændre media (sund tilknyttede celler udseende som vist i figur 2).
    11. Altid ændre kultur medier den næste dag efter genopretning af O9-1 celler (bruge konditioneret basal media suppleret med LIF og bFGF).
  2. Passage af O9-1 celler
    1. Når O9-1 celler nå 80% confluency, tø matrixen basalmembranen og forberede en basalmembran matrix-belagt plade som beskrevet ovenfor. Tilføje konditioneret basal media suppleret med LIF og bFGF til fartøjet. Alternativt kan du tilføje DMEM uden FBS at holde basalmembranen matrix fra tørring og gemme inde i en standard befugtet inkubator for ikke mere end 3 dage.
    2. Skyl O9-1-holdige brøndene (6-godt plade) med 2 mL af Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) to gange og forsigtigt afpipetteres for at undgå at miste celler.
    3. Adskille celler med 1 mL 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 3 min. Neutraliser trypsin med en lige mængde af DMEM med 10% FBS. Gentagne gange afpipetteres væsken over hele overfladen af godt at adskille så mange celler fra pladen som muligt.
      Bemærk: Trypsin koncentration er 0,05% i stedet for 0,25%. Brug DPBS til at fortynde fra stock flasken.
    4. Undgå at generere bobler når miljøomkostningerne celler fra pladen.
    5. Alle celle opløsning overføres til et centrifugeglas, og der centrifugeres i 3 min på 180 x g. Opsug supernatanten uden at forstyrre den celle pellet. Resuspenderes celle i centrifugeglasset af blid pipettering i konditioneret basal media suppleret med LIF og bFGF.
    6. Brug en hemocytometer til at tælle det samlede celle nummer som beskrevet ovenfor. Frø celler (10.000 til 15.000 celler/cm2) til belagt pladen forberedt som beskrevet i trin 3.1.4 til 3.1.8. Et godt af en 6-godt plade ville kræve 100.000 celler til frø.
    7. Tillad celler til at knytte og vokse i en standard celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Altid ændre kultur medier den næste dag efter passaging O9-1 celler.
  3. Indefrysning af O9-1 celler
    1. For at forberede 2 x frysning medier for O9-1 celler, fortyndes følgende i DMEM (endelige koncentrationer er angivet): 40% FBS og 20% DMSO.
    2. Filter sterilisere 2 x frysning medier og holde det ved 4 ° C. 2 x frysning medier skal ske på den dag det er brugt. Kassér alle ubrugte indefrysning medier.
      Bemærk: Fryse O9-1 celler på 80% confluency.
    3. Skyl brønde med DPBS to gange; Tilsæt forsigtigt for at undgå at miste celler.
    4. Adskille celler med 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 3 min, så neutralisere trypsin med et tilsvarende beløb af 10% FBS i DMEM. Gentagne gange afpipetteres væsken over hele overfladen af godt at adskille så mange celler fra pladen som muligt.
    5. Overføre alle plade indholdet til et centrifugeglas, og der centrifugeres i 3 min på 180 x g. Opsug supernatanten og der tilsættes 2 mL PBS og resuspend ved at trykke.
    6. Brug 10 µL af celle løsning til at tælle celler ved hjælp af en hemocytometer, som beskrevet ovenfor.
    7. Der centrifugeres celle løsning for 3 min på 180 x g. Opsug supernatanten og justere mængden af basal medier behov; derefter tilføje en lige stor del af 2 x indefrysning media.
      Bemærk: Celler er frosset i en koncentration på 1 x 106 celler/mL (1 mL per cryovial).
    8. Overfør celler til cryovials og etiket i overensstemmelse hermed. Placer cryovials inde en låg Varmekrympende boks til en langsom afkøling hastighed ved-80 ° C i mindst 24 timer før overførsel til flydende kvælstof.
      Bemærk: du opnår de bedste resultater, minimere cellen tælle tid og tiden mellem tilføjer 2 x frysning medier og overføre hætteglas til-80 ° C.

4. manipulation af O9-1 celler

  1. Udfører siRNA knockdown i O9-1 celler
    1. Tø og pels en 24-godt plade med basalmembranen matrix, som beskrevet ovenfor (trin 3.1.4–3.1.8) før du starter eksperimentet. Genskab og frø O9-1 celler, så de kan vokse til 60% til 80% confluency.
    2. Fortyndet Liposomer i serumfrit medier efter den relevante godt volumen. Fortyndet siRNA i serumfrit medier til finalen. Tilføje fortyndet siRNA til fortyndede Liposomer et forhold mellem af fabrikanten anbefalede. Bland godt af pipettering og inkuberes.
      Bemærk: Følg fabrikantens vejledning på den anvendte mængde, tid og temperatur til inkubation.
    3. Tilføje en passende mængde af siRNA-lipid komplekse celler efter fabrikantens anvisninger.
    4. Inkuber celler i 24 timer i en standard celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Udfør downstream trin som passende (uddrag RNA, ekstrakt proteiner, farvning, osv.)
      Bemærk: siRNA knockdown gange og koncentrationer kan variere afhængigt af den enkelte eksperiment.
  2. Udfører gen knockout i O9-1 celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 genom-redigering
    Bemærk: Henvise til den tidligere udgivne protokol for at bruge CRISPR-Cas9 i pattedyr celle linjer29. Her er en forenklet beskrivelse af CRISPR-Cas9 genom-redigering og relaterede trin.
    1. Få sgRNA sekvenser ved hjælp af et sgRNA designværktøj.
    2. Ligate sgRNA til pSpCas9 (bb) - 2a - normal god landbrugspraksis vektor30.
    3. Transfect O9-1 celler med vektoren ved hjælp af en standard lipofection protokol efter fabrikantens anvisninger.
    4. Inkuber celler i en standard celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i 24 timer.
    5. Udføre fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) baseret på normal god landbrugspraksis/7-ald. Frø normal god landbrugspraksis + enkelt celler i 96-brønd plader.
    6. Vokse celler i rugemaskinen i yderligere 4 dage. Kassér alle brønde, der har mere end en koloni.
    7. Udføre PCR med primere designet til påvisning af sletningen. Efter PCR, køre PCR-produkter på en agarosegel at evaluere band størrelse. Validere knockout effektivitet opnås ved hjælp af CRISPR-Cas9 editingby udfører Western blotting (et eksempel af Yap knockout resultater er vist i figur 3).

5. O9-1 Celledifferentiering

  1. Differentiering af O9-1 celler til osteoblaster
    1. For at forberede osteogenic differentiering medier, fortyndes følgende i alpha-MEM (endelige koncentrationer er angivet): 0,1 mM dexamethason, 100 ng/mL ben morfogenetiske proteiner 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbinsyre, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, og 100 mg/mL streptomycin.
    2. Opdage den osteoblastdannelse markør, osteocalcin, i differentierede osteoblaster ved immunfarvning som vist i figur 4.
      Bemærk: Osteogenic differentiering kan også vurderes ved hjælp af andre markører af osteoblaster eller med Alizarin rød farvning eller alkalisk fosfatase farvning.
  2. Differentiering af O9-1 celler af chondrocytter
    1. For at forberede Chondrocyt differentiering medier, fortyndes følgende i alpha-MEM (endelige koncentrationer er angivet): 5% føtalt kalveserum (FCS), 1% insulin-transferrin-selen (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, omdannelse af 10 ng/mL vækstfaktor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbinsyre, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethason og 1 mM natrium pyruvat.
    2. Første kultur en éncellelag i O9-1 celler med osteogenic media i 3 dage og derefter trypsinize og kultur som en micromass format i Chondrocyt differentiering medier for yderligere 7 dage.
    3. Æsler chondrogenic differentiering med Alcian blå farvning eller markører af chondrocytter.
  3. Differentiering af O9-1 celler af glatte muskelceller
    1. For at forberede glat muskel celle differentiering medier, fortyndes følgende i DMEM (endelige koncentrationer er angivet): 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, og 10% FBS.
    2. Æsler glat muskel Celledifferentiering med immunofluorescens farvning ved hjælp af antistoffer mod markører af glatte muskelceller, som glat muskel aktin (SMA), vist som eksempel i figur 5.
  4. Differentiering af O9-1 celler til glial celler
    1. For at forberede glial celle differentiering medier, fortyndes følgende i DMEM/F12 (endelige koncentrationer er angivet): 1 x B-27 supplement, 2 mM L-glutamin, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF og 1% varme-inaktiverede FBS.
    2. Evaluere glial Celledifferentiering af udfører immunofluorescens farvning med antistoffer mod glial celler markører som fedtsyre bindende protein 7 (FABP7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med vores knockdown og knockout forsøg var at undersøge virkningerne af Yap og Taz tab-af-funktion i O9-1 celler. Før de knockdown og knockout eksperimenter skal vi sørge for at forberede basal medier og kultur O9-1 celler som beskrevet ovenfor (for eksempel, basalmembranen matrix skal dække hele pladen som vist i figur 1og O9-1 celler inddrevet fra flydende nitrogen som vist i figur 2). Vi udførte knockdown eksperimenter som beskrevet ovenfor, hvor Yap og Taz blev samtidig slået ned. Lige store mængder af Yap siRNA og Taz siRNA blev føjet til den endelige rumfang af fabrikanten anbefalede. Til kontrol plade, blev et lige saa stort volumen af nontargeting siRNA tilføjet.

En Yap-null O9-1 cellelinje blev genereret ved at slette exon 3 af Yap ved hjælp af CRISPR/Cas9 genom-redigering, som beskrevet af Wang et al. 20. vi udførte knockout eksperimenter ved hjælp af CRISPR-Cas9 genom-redigering som beskrevet ovenfor, og Wang et al. 20. vi brugte de følgende sgRNA sekvenser, der flankeret exon 3 af Yap: 5 '-caccgtggattacgtgggtatgtt-3′ (sgRNA1-forward), 5 '-aaacaacatacccacgtaatccac-3′ (sgRNA1-omvendt), 5 '-caccgagatggtctaatgtagtga-3′ (sgRNA2-forward), 5 ' - aaactcactacattagaccatctc-3 ' (sgRNA2-omvendt)

CACC blev føjet til den fremskudte strand, og AAAC blev tilføjet til den omvendte strand. G blev tilføjet i 5'-slutningen af den forreste strand fordi oligo ikke begynder med G og C blev tilføjet til 3'-enden af den omvendte strand. Under de CRISPR-Cas9 genom-redigering trin, der beskrives ovenfor, og Wang et al. 20, var celler i konditioneret basal medier til O9-1 celler suppleret med LIF og bFGF til at undgå uønskede differentiering. Følgende PCR primere blev anvendt til påvisning af Yap sletning: 5 '-AAAACAGTCTCCACTACCCCTT-3′ (frem) og 5 '-GGCCATCATAGATCCTGGACG-3′ (omvendt). Placeringen af sgRNAs er fra basen #7973399 til #7974433 på mus kromosom 9. PCR primer position på kromosom er fra basen #7973306 til #7974478. Efter PCR optrådte PCR bandet for Yap knockout med exon 3 slettet som en 138-bp bandet på en agarosegel; Wild-type Yap optrådte som en 1173-bp band. Effektiviteten af Yap knockout ved hjælp af CRISPR-Cas9 genom-redigering blev valideret Western blotting, som vist i figur 3.

Som beskrevet ovenfor, kan være kulturperler O9-1 celler i specifikke differentiering-inducerende medier til at fremme differentiering af bestemte celletyper. Evaluering af differentiering kan gøres ved hjælp af forskellige tilgange, såsom kvantitativ PCR eller immunfarvning af specifikke celle markører. Som et eksempel, viser figur 4 O9-1 celler, der var kulturperler i osteoblastdannelse-inducerende medier og differentieret til osteoblaster, der blev evalueret ved immunfarvning celler med antistof mod osteocalcin (Ocn, en osteoblastdannelse markør). Kombineret med gen knockdown og knockout eksperimenter beskrevet ovenfor, O9-1 celler kan stort set bruges til gen funktion undersøgelser og fænotypiske analyser. Som et eksempel, både wild-type og Yap-null O9-1 celler blev kulturperler i glat muskel celle differentiering medier og evalueret af immunfarvning celler med antistof mod glat muskel aktin (SMA, glat muskel celle markør). De fleste vildtype O9-1 celler gav anledning til SMA-positive glatte muskelceller (figur 5A), paa Yap-null O9-1 celler undladt at differentiere i SMA-positive glatte muskelceller (figur 5B), hvoraf det fremgik, at Yap spiller en kritisk rolle i differentiering af NCCs i glatte muskelceller.

Figure 1
Figur 1: Matrigel fuldt ud dækker en 35 mm plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: O9-1 celler 24 h efter genopretning fra flydende nitrogen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Western blot data viser den effektive knockout (ko) af Yap i O9-1 celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 genom-redigering. WT: wild-type. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: immunofluorescens farvning af osteoblastdannelse markør osteocalcin (Ocn) angiver at O9-1 celler gav anledning til osteoblastdannelse celler osteogenic differentiering betingelser. Celler var farves med osteoblastdannelse markør Ocn antistof (grøn), og kerner var plettet med DAPI (blå). Pilene angiver Ocn-positive celler. Osteocalcin (Ocn, en osteoblastdannelse markør); DAPI (′, 6-diamidino-2-phenylindole). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Immunfluorescens farvning af glatte muskelceller actin (SMA) med angivelse af, at de fleste vildtype O9-1 celler under glat muskel celle differentiering betingelser, gav anledning til glatte muskelceller (A), mens Yap-null O9-1 celler undladt at differentiere i glatte muskelceller (B). Celler var plettet med SMA antistof (rød), og kerner var plettet med DAPI (blå). Pilene angiver SMA-positive celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NCC er en alsidig og vigtig bidragyder til forskellige væv og organer under embryonale morfogenese. O9-1 cell line opretholder dets potentiale til at differentiere i mange forskellige celletyper og efterligner NCCs, gør det en nyttig in vitro- værktøj til at studere genfunktioner og molekylær forordning i NCCs i vivo karakteristika. O9-1 celler forskellige status kan svare til forskellige neurale crest afkom i vivo, afhængig af kultur i O9-1 celler. O9-1 celler kan opretholdes i den Multipotente tilstand når kulturperler betingelser ikke skelne kultur, svarende til regelmæssig stamcelle kultur. Ikke skelne O9-1 celler kan svare til pre-migratory og vandrende Multipotente stamceller-lignende NCCs i vivo. Derudover kan O9-1 celler differentiere sig til mange forskellige celletyper under specifikke differentiering kultur betingelser, som er en vigtig fordel for at studere genfunktioner og forordning under differentiering af NCCs fra Multipotente stamceller celler i en bestemt differentieret celletype. De differentiering O9-1 celler kan svare til post-migratory neurale crest afkom i vivo, som har en anden celle skæbne at differentiere sig til forskellige celletyper. Afhængigt af forskningsinteresse, kan O9-1 celler manipuleres og kulturperler forskelligt til supplement i vivo NCC studier med dyremodeller.

Der er forskellige måder at manipulere O9-1 celler til at studere NCC begivenheder, herunder gen tab af funktion og gevinst af funktion. Eksempler præsenteres her, i hvilke siRNA knockdown og CRISPR-Cas 9 gen redigering eksperimenter blev udført i O9-1 celler til Hippo pathway effektor Yap tab af funktion undersøgelser20. Med kombineret brug af en musemodel og O9-1 celler viste vores undersøgelse, at Yap spiller en afgørende rolle i reguleringen af NCC spredning og differentiering af glatte muskelceller celler20. Andre undersøgelser i forskellige modeller har også vist en vigtig rolle for Yap i NCC'erne. Yap var vist forlanges for musen neurale crest glatte muskulatur differentiering31 og til at forbedre menneskers NCC skæbne og migration32. Derudover er Yap udtrykt i tidlige Xenopus udvikling33. Effektiviteten af genet knockdown og knockout i O9-1 celler, kombineret med bekvemmeligheden af udfører andre downstream molekylære teknikker som kvantitativ PCR (qPCR), Western blotting og immunfarvning understøtter at cellelinie O9-1 er en fremragende NCC model, der kan nemt manipuleres i vitro. Ud over tab af funktion undersøgelser vi har beskrevet ovenfor og tidligere20, forskellige andre anvendelser af O9-1 celler er blevet beskrevet til at studere NCC'erne. O9-1 celler kan bruges som et effektivt alternativ til eksperimenter, der kræver en relativt store beløb af væv, såsom kromatin immunoprecipitation sekventering (ChIP-seq). Men mange i vivo celle begivenheder såsom NCC migration er afhængige af komplekse væv til væv interaktioner, så det forbliver uklart hvor godt O9-1 celler præcist kan efterligne i vivo NCC migration. På grund af begrænsninger af in vitro- undersøgelser med O9-1 celler anbefales det at validere bemærkninger med O9-1 celler i vivo ved hjælp af dyremodeller.

Når du bruger O9-1 cell line for at studere NCCs i vitro, opretholde multipotency i cellerne under rutinemæssige kultur er afgørende. Multipotency i O9-1 celler kan testes i begyndelsen af kultur ved at evaluere udtryk for NCC markørgener som AP-2a og Sox9. Ligeledes kan muligheden for differentiering af O9-1 celler testes ved at differentiere dem ind i bestemte celletyper. For at undgå uønskede differentiering under den rutine dyrkning af O9-1 celler, skal de eksperimentelle procedurer udføres i overensstemmelse med etablerede protokollen beskrevet her. Omhyggelig forberedelse af konditioneret basal medierne og frisk tilføjelsen af de korrekte koncentrationer af LIF og bFGF er afgørende for at opretholde multipotency i O9-1 celler. Derudover eksperimentelle tidslinjen skal planlægges omhyggeligt, eftersom dyrkning O9-1 celler kræver først forberede inaktive feeder STO celler og indsamle konditioneret basal medier, hvilket er godt for kun ca. en måned. Tidligere undersøgelser har vist, at kælderen membran matrix er vigtige for opretholdelse af differentiering potentielle muskel og neurale forløber celler, samt mesenkymale stamceller celler34,35,36. I forbindelse med protokollen beskrevet her, basalmembranen matrix giver en platform for O9-1 celler til at fastgøre og bidrager til at opretholde differentiering potentielle. Basalmembranen matrix er derfor en vigtig faktor, der kan påvirke eksperimentelle resultater og deres sammenhæng, når gentages. Vi anbefaler forbereder basalmembranen matrix strengt ifølge protokollen beskrevet ovenfor og undgå flere fryse-tø cykler af matrixen basalmembranen. Også, når inddrive O9-1 celler fra frossen tilstand til kultur, processen med at flytte cellerne fra flydende kvælstof til et 37 ° C vandbad skal gøres hurtigt, at undgå enhver vortexing under hele processen. Derudover skal overvækst af O9-1 celler også undgås for at opretholde multipotency i O9-1 celler. Når passaging O9-1 celler, sikre at trypsin koncentration er fortyndet til 0,05% i stedet for 0,25% og at cellerne vises korrekt adskilles. Gentagne gange pipettering meget forsigtigt er for at opnå en enkelt celle suspension nødvendige for at undgå dannelsen af aggregerede celler. Hele processen med håndtering cellelinie O9-1 skal i almindelighed gøres forsigtigt og omhyggeligt.

Sammenfattende cellelinie O9-1 er et meget nyttigt redskab til at studere NCCs i vitro, især når det anvendes som et supplement til i vivo studier af NCC'erne. O9-1 celler metode har åbenlyse fordele såsom lethed med som de kan tilgås og lethed, med hvilke tilstrækkelig celle kan numre fås for eksperimenter. I betragtning af differentiering mulighederne i O9-1 celler, har de et stort potentiale til brug i en bred vifte af applikationer i forskellige områder af forskning. O9-1 celler kan være praktisk anvendes til applikationer såsom hurtig drug test og screening, ChIP-FF., transposase-tilgængelige kromatin med høj overførselshastighed sekventering (ATAC-seq) og RNA sekventering (RNA-FF.), gen gevinst af funktion og tab af funktion undersøgelser, samt signaling forordning undersøgelser. Brug af en standardiseret og fuldstændig protokol for håndtering af O9-1 celler vil lette reproducerbarhed af undersøgelser, hvor de bruges.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Nicole Stancel, Ph.D., ELS, videnskabelige publikationer på Texas Heart Institute, forudsat redaktionelle støtte. Vi takker også de følgende finansieringskilder: American Heart Associations nationale Center videnskabsmand udvikling Grant (14SDG19840000 til J. Wang), 2014 Lawrence Research Award fra Rolanette og Berdon Lawrence knogle sygdom Program af Texas (til J. Wang ), og de nationale kontorer i sundhed (DE026561 og DE025873 til J. Wang, DE016320 og DE019650 til R. Maxson).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active STO feeder cells ATCC ATCC CRL-1503 Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco 11960-044
DMEM, high glucose Hyclone SH30243.01
FBS (fetal bovine serum) Millipore Sigma ES-009-B
Penicillin - streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Gelatin from porcine skin Sigma G1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS Genesee Scientific 25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium Lonza 17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100Xx Gibco 11140-050
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Mitomycin C Roche 10107409001
Matrigel matrix Corning 356234
DMSO (dimethylsulfoxide) Millipore Sigma MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
Opti-MEM I (1x) Gibco 31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine Corning 10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA Dharmacon L-041057
ON-TARGETplus Non-targeting Pool Dharmacon D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA Dharmacon L-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Tags

Genetik udstede 140 CRISPR Cas9 O9-1 celler gen knockout gen knockdown neurale crest celler

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

Dyrkning og Manipulation af O9-1 neurale Crest celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. … More

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (140), e58346, doi:10.3791/58346 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter