富含半胱氨酸的多肽根据其二硫键连接方式折叠成不同的三维结构。当缓冲氧化无法产生所需的二硫键连接时，需要对单个二硫键异构体进行定向合成。本实验方案涉及含三个二硫键的多肽的选择性合成，并利用核磁共振（NMR）和串联质谱（MS/MS）对其进行结构分析。
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方法文章
μ-芋螺毒素PIIIA异构体的合成及不同二硫键连接方式的结构测定
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
富含半胱氨酸的多肽，其三维结构通常受二硫键连接方式的影响。因此，在多肽合成过程中避免非预期的二硫键形成至关重要，因为这可能导致完全不同的多肽结构，进而改变其生物活性。然而，使用常规缓冲液氧化等标准自折叠方法难以实现多肽中多个二硫键的正确形成，原因在于可能产生多种不同的二硫键连接方式。本方案提供了一种先进策略，适用于那些无法通过缓冲液氧化法以高纯度和高产率合成的多连接二硫桥多肽的定向制备。本研究展示了采用特定保护基策略，定向合成μ-芋螺毒素PIIIA所有可能的三种二硫键连接多肽异构体的方法。这些多肽通过Fmoc固相多肽合成法进行制备，并利用保护基策略实现特定二硫键的形成。各对半胱氨酸分别采用三苯甲基（Trt）、乙酰氨基甲基（Acm）和 叔丁基-丁基 (t使用保护基（如Bu）确保在每一步氧化反应中仅目标半胱氨酸被脱保护并形成二硫键。除定向合成外，还结合多种分析方法以明确肽链的正确折叠及目标肽结构的生成。对不同三对二硫键连接异构体的比较表明，准确测定和掌握二硫键连接方式对于计算肽异构体的三维结构及其生物活性的解释具有重要意义。分析表征包括通过串联质谱（MS/MS）精确解析二硫键连接模式，该分析采用经改良方案制备的完整肽异构体的部分还原与烷基化衍生物进行。此外，结合MS/MS分析所得信息，利用二维核磁共振（NMR）实验确定肽的结构。
引言
生物活性肽在药物研究与开发中的应用备受认可，因为它们是针对特定生物靶点的高效且高选择性化合物1。然而，由于其生物活性依赖于三维结构，因此在进行构效关系研究时，三维结构具有重要意义2,3,4。除了影响整体构象的一级氨基酸序列外，二硫键对富含半胱氨酸肽的结构具有显著的稳定作用5。多种含二硫桥的肽包括来自Conus purpurascens的μ-PIIIA等芋螺毒素，其序列中含有六个半胱氨酸。如此高的半胱氨酸含量理论上可形成15种二硫键异构体。正确的二硫键连接方式对生物活性至关重要6,7。然而，随之而来的问题是：天然存在的肽是否具有不止一种生物活性构象？如果存在，哪一种异构体具有最高的生物活性？对于μ-芋螺毒素而言，其生物靶点是电压门控钠离子通道，其中μ-PIIIA对NaV1.2、NaV1.4和NaV1.7亚型的作用最强3。
二硫键桥接肽的合成可通过多种方法....
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方案
注意：本文所用的所有氨基酸均为L-构型。氨基酸及氨基酸衍生物的缩写遵循国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会（IUB）及国际纯粹与应用化学联合会-国际生物化学联合会生化命名联合委员会（IUPAC-IUB）的推荐标准。
1. 固相多肽合成（SPPS）
注意：使用固相多肽合成仪进行合成。采用9-芴甲氧羰基（Fmoc）化学的标准方案，合成通序列为ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2的线性多肽前体。使用以下保护氨基酸：Pyr(Boc（叔丁氧羰基）)、Arg(Pbf（2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基）)、Asn(Trt)、Asp(tBu)、Hyp(tBu)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Gln(Trt)、Glu(tBu)、Trp(Boc)、Tyr(tBu)、Thr(tBu)和His(Trt)。根据预期的二硫键连接方式，用Trt、Acm或tBu基团对半胱氨酸成对进行保护。
- 准备
- 使用冻干机将Fmoc Rink-酰胺树脂（载量：0.28 mmol/g）干燥过夜。
- 在合成仪程序中输入所需的肽序列（单字母编码）。程序将计算每种试剂所需的量，并提示溶剂的用量。
- 根据方案称取各试剂（氨基酸、HBTU（2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,....
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结果
合成了15种不同的二硫键桥接的µ-芋螺毒素PIIIA异构体，并对其进行了详细表征（图1）。通过部分还原及随后的MS/MS分析来确定二硫键的连接方式（图2）。对不同异构体进行核磁共振（NMR）分析（图3），以揭示各自的肽链结构。值得注意的是，必须结合反相高效液相色谱（RP HPLC）、MS/MS碎片分析和NMR分析，才能明确鉴定二硫键的连接模式。
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讨论
本文所述的合成富含半胱氨酸肽（如 µ-PIIIA）的方法，提供了一种从相同氨基酸序列中选择性生成二硫键连接异构体的可能性。因此，基于Fmoc的固相肽合成等既定方法18 并采用了一种明确的保护基策略，用于区域选择性地形成二硫键16固相肽合成可通过自动化合成在聚合物载体（树脂）上生成氨基酸序列。在序列组装过程中，氨基酸的侧链通过特殊的保护基团加以保护，以防止发生不必要的副反应。这些保护基团根据所采用的实验方案不同，将在肽链从树脂上裂解时被脱除。该保护策略同样适用于肽链中的半胱氨酸侧链。 例如，三苯甲基保护。然而，对于单个半胱氨酸对，可采用不同的保护基团，例如乙酰氨基甲基和 叔丁基-丁基不会在此消除步骤中同时被裂解。这些保护基团可在脱保护后使巯基暴露，进而在允许后续氧化的条件下通过形成二硫键而被去除。通过这种方法，可选择性地生成含有六个半胱氨酸残基的肽的全部15种二硫键异构体7,16然而，限制因素.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢不来梅布鲁克公司（Bruker Daltonics GmbH Bremen）的 A. Resemann、F. J. Mayer 和 D. Suckau；达姆施塔特工业大学的 D. Tietze、A. A. Tietze、V. Schmidts 和 C. Thiele；耶拿弗里茨·利普曼研究所（FLI Jena）的 O. Ohlenschläger；波恩大学的 M. Engeser；科隆马克斯·普朗克植物育种研究所的 K. Kramer、A. Harzen 和 H. Nakagami；科隆动物学研究所的 Susanne Neupert；以及法兰克福大学生物分子磁共振波谱设施在技术支援、培训模块和仪器使用方面提供的帮助。同时感谢波恩大学为 D.I. 提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PS PEG2000 Fmoc Rink-酰胺树脂 | Varian, Inc. | PL3867-3764 | AmphiSpheres 40 RAM |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐 | Sigma Aldrich | 8510060 | 易燃 |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | 易燃，有毒 |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | 致癌 |
| 哌啶 | Alfa Aesar | A12442 | 易燃，有毒，腐蚀性 |
| N-甲基吗啉 | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| 三氟乙酸 | Sigma Aldrich | 74564 | 有毒，腐蚀性 |
| 苯酚 | Merck | 1002060 | 有毒 |
| 硫代苯醚 | Alfa Aesar | A14846 | |
| 乙二硫醇 | Fluka Analytical | 2390 | |
| 乙醚 | VWR | 100,921 | 易燃 |
| 叔丁醇 | Alfa Aesar | L12338 | 易燃 |
| 乙腈 | Fisher Scientific | A998 | 易燃 |
| 水 | Fisher Scientific | W5 | |
| 异丙醇 | VWR | ACRO42383 | 易燃 |
| 氢氧化钠 | AppliChem | A6579,1000 | 腐蚀性 |
| 碘乙酰胺 | Sigma Aldrich | I6125 | |
| 碘 | Sigma Aldrich | I0385 | |
| 盐酸 | Merck | 110165 | 腐蚀性 |
| 抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A4403 | |
| 二苯基亚砜 | Sigma Aldrich | P35405 | |
| 苯甲醚 | Sigma Aldrich | 96109 | 易燃 |
| 三氯甲基硅烷 | Sigma Aldrich | M85301 | 易燃 |
| 样品稀释缓冲液 | Laborservice Onken | ||
| 磷酸二氢钠 | Sigma Aldrich | 106370 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-羧乙基)磷酸盐盐酸盐 | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 柠檬酸 | Sigma Aldrich | 251275 | |
| 二水合柠檬酸钠 | Sigma Aldrich | W302600 | |
| 三乙酸盐 | Carl Roth, | 7125 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma Aldrich | E26282 | |
| 肽校准标准品 II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| 设备名称 | 公司 | ||
| 固相多肽合成仪 | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| 冷冻干燥机 | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| 半制备型高效液相色谱仪 | Jasco | 系统 PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 色谱柱（反相，5 µm 粒径，100 Å 孔径，250 x 32 mm） | Knauer | 25QE181E2J | 线性多肽纯化 |
| Vydac 218TP1022 色谱柱（反相 C18，10 µm 粒径，300 Å 孔径，250 x 22 mm） | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | 氧化多肽纯化 |
| 分析型高效液相色谱仪 | Shimadzu | 系统 LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 色谱柱（C18 反相，5 µm 粒径，300 Å 孔径，250 x 4.6 mm） | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | 分析柱 |
| 钢制靶板（MTP 384） | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI 样品制备 |
| C18 浓缩滤柱（ZipTip） | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI 样品制备 |
| MALDI 质谱仪 | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| 氨基酸分析仪 | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 系统 | |
| NMR 谱仪 Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| 分子可视化计算机程序 | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR 结构计算 |
| MALDI 数据分析计算机程序 | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS 碎裂分析 |
| 模拟旋涡混合器 | VWR | VM 3000 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5410 | |
| 离心机 | Hettich | EBA 20 | |
| 旋转真空浓缩仪 | Christ | 2-18 Cdplus | |
| 分析天平 | A&D Instruments | GR-202-EC |
参考文献
- Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
- Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. <....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.
Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
to:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
Step 1.2 in the Protocol section was updated from:
NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.
to:
NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.
Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:
HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).
to:
HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).
The first item in the Materials table was updated from:
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 |
to:
| PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin | Varian, Inc. | PL3867-3764 | AmphiSpheres 40 RAM |
