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方法文章

一种用于研究多囊卵巢综合征的高雄激素小鼠模型

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DOI：

10.3791/58379

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2018年10月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

我们描述了一种具有多囊卵巢综合征样特征的精瘦型小鼠模型的建立过程 二氢睾酮缓释颗粒用于研究多囊卵巢综合征的病理生理学及其子代特征

摘要

高雄激素血症在女性生殖和代谢功能中起着关键作用，是多囊卵巢综合征的标志性特征。建立一种模拟患有多囊卵巢综合征女性的非肥胖型PCOS小鼠模型具有重要的临床意义。在本方案中，我们描述了这样一种模型。通过植入一段4毫米长的双氢睾酮（dihydrotestosterone, DHT）晶体粉末丸剂（丸剂总长度为8毫米），并每月更换一次，我们能够建立一种血清DHT水平比未植入DHT（no-DHT）小鼠高出两倍的PCOS样小鼠模型。该模型在不改变体重和体成分的情况下表现出生殖和代谢功能障碍。尽管这些PCOS样雌性小鼠表现出高度不育，但其中一小部分仍可怀孕，其子代成年后出现青春期延迟和睾酮水平升高。这种非肥胖型PCOS样小鼠模型是研究PCOS病理生理机制以及PCOS样母鼠子代特征的有力工具。

引言

高雄激素血症是根据美国国立卫生研究院（NIH）标准诊断多囊卵巢综合征（PCOS）的主要特征 雄激素过多与多囊卵巢综合征（AE-PCOS）学会。多囊卵巢综合征女性患者受孕困难，且妊娠并发症风险增加1即使成功怀孕，其雌性后代也会出现不良健康后果2,3已采用多种策略开发了动物模型4,5,6,7,8,9,10,11,12 并表现出多囊卵巢综合征（PCOS）的多种特征（无排卵和/或葡萄糖与胰岛素耐受性受损），伴有体重增加和肥胖，且与脂肪细胞体积增大及脂肪细胞重量增加相关。目前用于研究PCOS的动物模型主要有两种构建策略：一种是在出生后直接给予高水平雄激素（外源性雄激素注射/植入），或间接干预（例如使用芳香化酶抑制剂阻断雄激素向雌激素的转化）13另一种原因是胎儿在妊娠期间过度暴露于雄激素14,15 以研究其后代。例如，来自恒河猴的雌性后代16,17，绵羊18，且在子宫内期暴露于男性水平雄激素的啮齿类动物在成年后会表现出类似多囊卵巢综合征（PCOS）的特征。这些模型显著增进了我们对雄激素升高、胎儿编程以及子宫环境影响的理解。然而，这些模型也存在自身局限性：1）动物会出现肥胖，因此难以将高雄激素血症的影响与肥胖引起的生殖和代谢功能障碍区分开来；2）PCOS女性在怀孕前即已存在雄激素水平升高，因此卵母细胞在受精前就已暴露于过量雄激素环境中；3）出生后或妊娠期间使用的药理剂量的睾酮（T）或双氢睾酮（DHT）可能无法真实反映PCOS患者的雄激素暴露环境。已有研究检测了卵巢卵泡液和/或血清中的睾酮和DHT水平，发现PCOS女性的睾酮和DHT水平比正常女性高出1.5至3.9倍5,19,20,21,22,23 与未受影响的女性相比。我们建立了一种成年小鼠模型23,24,25 在植入含有4毫米长结晶DHT粉末（ pellet总长度为8毫米）的缓释丸后，两周内即出现生殖和代谢功能障碍的动物模型。该模型产生的血清DHT水平约为 2倍 高于未经DHT处理的对照组小鼠（称为2xDHT）。2xDHT小鼠未 表现出基础血清雌二醇、睾酮的改变， 黄体生成素和不 发展肥胖，以及 卵巢重量、血清胆固醇、游离脂肪酸、瘦素、TNFα 和 IL-6 水平相似23,24,25 与对照组相比，即使在插入DHT后长达3.5个月仍存在差异23,24,25此外，通过使已表现出多囊卵巢综合征特征的雌性个体交配，我们可以研究母体高雄激素环境对子代代谢和生殖健康的影响。15.

这一新范式（符合美国国立卫生研究院（NIH）和AE-PCOS学会标准）通过产生与多囊卵巢综合征（PCOS）女性相似的雄激素水平来模拟该疾病，其睾酮或双氢睾酮（DHT）水平比未患病女性高出2至3倍。然而，该模型依赖持续外源性给予DHT维持，一旦停用DHT，不会出现程序性内源性高雄激素状态。本文的总体目标是聚焦于以下三个方面：1）如何制备DHT缓释颗粒；2）如何建立一种类似瘦型PCOS的小鼠模型；3）评估这些母鼠雌性子代的策略。其他表型测量与评估方法未在本文中讨论，但可参见文献5,15,23,24,25,26。

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方案

在此，我们提供了详细的双氢睾酮（DHT）缓释颗粒制备与植入操作流程，以及生殖与代谢功能检测方法。本研究所用小鼠为混合遗传背景（C57/B6、CD1、129Sv），饲养过程中提供食物与饮水。 随意摄取 在约翰斯·霍普金斯大学医学院百老汇研究大楼动物实验设施中，以24 °C、14/10小时明暗循环条件饲养。所有实验程序均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。

1. 建立类似多囊卵巢综合征的小鼠模型

  1. DHT颗粒制备
    1. 高压灭菌硅胶管以进行消毒。用剃刀片将硅胶管切割成15 mm长度。
    2. 用20 G针头将医用粘合硅胶注入管中，封闭一侧 钝化针头连接至3 mL注射器。应先将活塞从注射器中抽出，然后将粘合剂注入储液腔内。重新插入活塞并推动粘合剂，直至其开始从针头端露出。钝化针头可通过使用任何坚固的剪刀剪去20 G针头的尖锐端制成。导管内硅胶的长度应超过2 mm，以预留出产后修整余量。
    3. 过夜干燥；检查密封面是否存在气泡。无气泡者用于DHT颗粒，其余可用于无DHT对照颗粒。
    4. 在通风橱中制备DHT药丸时，应佩戴手套、口罩、护目镜和实验服，以避免DHT接触皮肤。
    5. 将DHT粉末倒入塑料称量舟中，然后将A1.1步骤中制备的带粘性帽的开口试管压入DHT粉末中。
    6. 可用拉直的大号回形针将DHT粉末压紧。  继续操作直至DHT达到4 mm（或所需长度）的高度。用尺子测量DHT的长度，用硅胶密封开口侧，过夜干燥。
    7. 将每侧密封处切割，使硅胶段长度为2 mm，样品总长度为8 mm。
    8. 将空硅胶管两端密封作为对照（无DHT）丸剂。
    9. 将沉淀物置于50 mL锥形管中，用铝箔包裹（避免光照），室温保存直至后续操作  使用。DHT颗粒在储存至少3个月内保持完全效力。
  2. DHT 插入与替换
    1. 最多将20个DHT颗粒或对照颗粒分别浸入含有30 mL无菌0.9%生理盐水的50 mL锥形管中，在37℃下孵育24小时 °插入前立即用 C 进行平衡。
    2. 手术前，使用克利多克斯（clidox）对表面和手套进行消毒，并用带塑料背衬的洁净吸水纸（手术垫）覆盖工作台面。  所有与动物接触的仪器在进入动物设施前均需通过高压灭菌进行去污处理。  器械将在使用前晾干并冷却。
    3. 使用2月龄雌性小鼠（每笼4–5只）。小鼠 腹腔注射赛拉嗪（3.5 mg/kg 体重） 和氯胺酮（78.8 mg/kg 体重）使用胰岛素注射器。麻醉剂配制与给药剂量的计算见于 表1. 
    4. 在麻醉充分（以趾反射消失和呼吸减慢为指标）后，对小鼠进行手术准备。
    5. 使用无菌纱布蘸取聚维酮碘对局部皮肤进行消毒，再用70%乙醇擦拭清洁。  该区域将再次用聚维酮碘涂抹。
    6. 在颈部附近皮肤下用剪刀剪开一个长约5 mm的切口。使用10 G套管针，向头侧方向制作一个约15 mm长的小隧道。通过套管针将药丸背侧插入。
    7. 然后使用外科粘合剂封闭切口。用镊子手动对合伤口边缘，并以轻柔的刷涂动作将一层薄薄的液体粘合剂涂于对合好的伤口边缘。共涂抹3层薄层粘合剂，以确保粘合剂在伤口区域均匀分布。粘合剂应覆盖至对合伤口边缘两侧各1 cm处。也可使用缝线或外科夹闭合切口。将小鼠放回笼中，单独饲养，并放置加热垫以助恢复。每4周更换一次药丸，以维持稳定的雄激素暴露水平。更换时将原药丸取出，并在相同位置按照A1.15节所述方法植入新的药丸。
    8. 在插入DHT 3天后检测动情周期。通过阴道细胞学评估动情周期阶段。  使用10 µL移液器将约10 µL无菌生理盐水注入阴道腔内，然后用同一无菌吸头回吸生理盐水，连续16天收集阴道细胞。  从阴道壁脱落的阴道细胞与生理盐水混合后被收集。
    9. 将含细胞的生理盐水均匀涂布于已标记的载玻片上。每张载玻片可容纳六个样本。载玻片上的标记用于注明每个样本在六个位置中的具体分布。
    10. 待载玻片上的生理盐水完全干燥后，将载玻片放入盛有100%乙醇的容器中以固定细胞。固定时间应至少为5分钟，但载玻片可在固定液中长期保存，直至后续使用。
    11. 将载玻片分别放入缓冲液B的染色液中染色1分钟 用自来水冲洗载玻片，并在室温下晾干。
    12. 在10倍物镜的光学显微镜下观察细胞形态。  通过细胞形态区分动情前期（P）、动情期（E）、动情后期（M）和动情间期（D）的方法见参考文献27,28,29.
    13. 统计每个阶段的天数，除以总天数，以计算各阶段所占的时间百分比。
    14. 在双氢睾酮（DHT）植入后第21天检测葡萄糖耐量：将小鼠禁食过夜（16小时），随后按每公斤体重2 g的剂量腹腔注射20%右旋糖溶液。例如，若小鼠体重为25 g，则注射体积为250 µL 使用50 cc（0.5 mL）胰岛素注射器注射20%葡萄糖溶液。通过尾静脉采血，利用血糖仪和血糖试纸在0、15、30、60、90、120分钟时点测定血糖水平。该方法的详细描述见其他文献。30.
  3. 血液采集
    1. 在DHT植入后的不同时间点收集血液（我们限制采集量为：类固醇检测100 µL，LH/FSH测定30 µL），每日上午9至10点期间通过下颌静脉穿刺采血。该方法详见于11.
    2. 以 6,000 x g 离心血液 g 4 ℃时 ˚C 反应 10 分钟，收集血清层至另一支 1.5 mL 离心管中，可于 -80 保存 °直至检测前均置于 C 条件下保存。

2. 评估慢性DHT植入母体雌性子代的生殖特征

  1. 交配
    1. 待测雌性小鼠被移入含有已验证生育力雄性小鼠（该雄性小鼠已确认具有繁殖能力）的笼具中  在植入药丸后第15天，曾与雌性小鼠交配产仔 
    2. 每周记录母鼠体重，以判断其是否怀孕。若母鼠每周体重增加超过3 g，则表明已怀孕。
    3. 在观察到母鼠体重较前一周增加超过3 g后的第二周，采集母鼠血液。 
  2. 通过阴道开口和首次动情期评估青春期
    1. 仔鼠出生后21天（PND）断奶后，每天通过肉眼观察检查阴道开口，测量肛门生殖器距离，并记录阴道开口的年龄。
    2. 一旦阴道开口，按照1.2.8–1.2.11所述方法每日收集阴道细胞 检测动情周期。
    3. 观察细胞形态，方法如1.2.12所述，首次动情期定义为所有细胞均为角化上皮细胞的日期。 
  3. 体重与耳缘穿孔
    1. 将采血针尖浸入纹身膏中，用纹身标记法在每只幼鼠的脚趾上做标记   参见参考文献中的描述12 在出生后第7天（7 PND）进行，并每7天称重一次小鼠，直至70日龄。
    2. 使用耳缘打孔法对小鼠进行编号 图1 在出生后12至16天之间。为区分性别，检查动物腹侧，雌性可见乳头。
    3. 在出生后的第21、26和70天（PND）按照上述1.3.1节所述方法采集血液
  4. 激素测定
    1. 通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）和液相色谱串联质谱法（LC-MS）检测血清中的二氢睾酮（DHT）水平23,24,31,32采用液相色谱-质谱法（LC-MS）或经弗吉尼亚大学生殖研究中心配体检测核心实验室验证的大鼠/小鼠ELISA法测定T水平。23,24.

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结果

血清双氢睾酮水平和葡萄糖耐量试验

根据方案 1.24–1.25 以及 2.9、3.0，采用 ELISA 和 LC-MS 两种方法检测采集血清中的双氢睾酮（DHT）水平。质谱法与 ELISA 所测得的 DHT 绝对值存在差异，但两种检测方法及各实验之间，DHT 插入组相对于无 DHT 插入组的相对倍数（约 2 倍）结果相似15,23,24（图 2A）。在 DHT 插入小鼠和无 DHT 插入小鼠中，从受孕前到妊娠期间 DHT 水平均显著升高，但在受孕前（交配前一天）和妊娠期（约 14 天）两个时间点，DHT 小鼠体内的 DHT 水平均比无 DHT 小鼠高出约 2 倍（图 2B<...

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讨论

高雄激素血症是多囊卵巢综合征（PCOS）的关键特征。本方案中使用的血清双氢睾酮（DHT）水平（DHT 小鼠中的水平比无 DHT 小鼠高两倍）低于以往其他研究者报道的水平，并经过校准以成比例地模拟 PCOS 女性的状况5,19,20,21。与其他模型不同，该两倍 DHT 模型在植入 DHT 后长达 3.5 个月内，与无 DHT 小鼠相比，并不改变体重和全身组成23,24。这些成年植入 DHT 的小鼠通过持续外源性给予 DHT 进行维持。尽管全身组成未发生改变，但在瘦型 PCOS 女性中已观察到脂肪细胞结构和功能的改变20。因此有必要对不同脂肪储存部位进行细致检查。我们在 DHT 植入后一周内观察到动情周期受损

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披露

无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（S.W. 获资助号 R00-HD068130）和巴尔的摩糖尿病研究中心：试点与可行性资助（S.W. 获资助）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
结晶型 5α-DHT 粉末Sigma-AldrichA8380-1G
道康宁硅胶管Fisher Scientific11-189-15D内径 0.04 英寸/1 毫米 × 外径 0.085 英寸/2.15 毫米
医用硅胶粘合剂Factor II, InC.A-100
护目镜、实验服、手套和口罩
10 µL 无滤芯移液器吸头USA Scientific11113700
用于涂片的显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-003
Diff Quik 细胞染色试剂Fisher ScientificNC9979740
采血针Fisher ScientificNC9416572
3 mL 注射器Becton, Dickinson and Company (BD)30985
配套针头：20 GBD305176
直尺：长度超过 10 cm，带毫米刻度
赛拉嗪Vet one AnnSeA LA, MWI, BoiseNDC13985-704-10100 mg/mL
盐酸氯胺酮Hospira, IncNDC 0409-2051-05100 mg/mL
外科缝合钉AutoClip® System, Fine Science Tool12020-00
胰岛素注射器BD3294611/2 CC，低剂量 U-100 胰岛素注射器
套管针Innovative Research of AmericaMP-182
显微镜Carl Zeiss Primo Star415500-0010-001德国
耳标打孔器Fisher Scientific13-812-201
睾酮大鼠/小鼠 ELISA 试剂盒IBLB79174
DHT ELISA 试剂盒Alpha Diagnostic International1940
稳豪型血糖仪Life Scan, Inc.
稳豪型血糖试纸Life Scan, Inc.
Eppendorf 管Fisher Scientific05-402-18
剃须刀片Fisher Scientific12-640
克菌定Fisher ScientificNC0089321
手术垫单Fisher Scientific50587953制造商：Andwin Scientific 56616018
聚维酮碘消毒液Walgreens
3M Vetbond（正丁基氰基丙烯酸酯）3M Science. Applied to Life

参考文献

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