Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des cellules leucémiques de leucémie patients la moelle osseuse et l’analyse de leur état métabolique. Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires pourrait aider à mieux caractériser la demande des cellules primaires et pourrait mener à une médecine plus personnalisée.
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Article de méthode
Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’exigence métabolique des cellules cancéreuses peut influencer négativement la survie et l’efficacité du traitement. De nos jours, ciblage pharmaceutique des voies métaboliques est testée dans plusieurs types de tumeurs. Ainsi, la caractérisation de l’installation métabolique de cellules du cancer est inévitable afin de cibler la bonne voie afin d’améliorer le résultat global des patients. Malheureusement, dans la majorité des cancers, les cellules malignes sont assez difficiles à obtenir en plus grand nombre et la biopsie de tissu est requise. La leucémie est une exception, où un nombre suffisant de cellules leucémiques peut être isolé dans la moelle osseuse. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des cellules leucémiques de leucémie patients la moelle osseuse et l’analyse ultérieure de leur état métabolique avec analyseur de flux extracellulaire. Les cellules leucémiques sont isolés par le gradient de densité, ce qui n’altère pas leur validité. La prochaine étape de la culture aide à se régénérer, donc l’état métabolique mesuré est l’état des cellules dans des conditions optimales. Ce protocole permet d’obtenir des résultats cohérents et bien standardisées, qui pourraient être utilisées pour la thérapie personnalisée.
Introduction
Le profil métabolique est l’une des principales caractéristiques des cellules et bioénergétique altérée sont désormais considérés comme une des caractéristiques du cancer1,2,3. En outre, les changements dans les paramètres métaboliques pourraient servir dans le traitement du cancer en ciblant les voies de transduction de signal ou de la machinerie enzymatique de cancer des cellules4,5,6. Sachant la prédisposition métabolique des cellules cancéreuses est donc un avantage et peut aider....
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Protocole
Tous les échantillons ont été obtenus avec l’informed consent des parents ou les tuteurs des enfants et l’approbation du Comité d’éthique de l’Université Charles à Prague, en République tchèque, l’étude aucun. NV15-28848A.
1. préparation des réactifs
- Préparer 500 mL de PBS en dissolvant 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, ddH2O. ajuster le pH à 7,4 avec HCl. stériliser à l’autoclave.
- Préparation de 100 mL de milieu RPMI : milieu RPMI-1640 avec L-Alanyl-Glutamine additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), la pénicilline (100 U/mL) et la streptomycine (....
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Résultats
La figure 3 montre les courbes après test d’effort de la glycolyse et mesures de stress test cellule Mito de blastes leucémiques du BCP-ALL (leucémie lymphoblastique aiguë de la B-cellule précurseur) et les patients AML (leucémie myéloïde aiguë). Le calcul des paramètres métaboliques de ces mesures est également indiqué. 500 000 cellules / puits ont été ensemencées et toutes les mesures ont été effectuées en hexaplicates.
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus permet la mesure de l’activité métabolique évaluée par OCR et ECAR valeurs dans les blastes leucémiques primaires provenant de patients atteints de leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) ou leucémie myéloïde aiguë (LMA). L’avantage de la mesure à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire, c’est qu’il permet la détection du profil métabolique dans le temps réel dans les cellules vivantes. Essentiellement, toutes les étapes du protocole fourni pourraient être ajusté selon le type de cellule,.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier les centres d’hématologie pédiatrique tchèque. Ce travail a été soutenu par la subvention du ministère de la santé (NV15-28848A), ministère de la santé de l’Université l’hôpital Motol, République tchèque, Prague, République tchèque 00064203 et par le ministère de l’éducation, jeunesse et Sports NPU I nr. LO1604.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Medium, Supplément GlutaMAX | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Sérum fœtal bovin | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotique-antimycosique (100x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Bicarbonate | de sodium Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycine A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycine A de Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7,0-7,6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Pyruvate de sodium | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Sérum bovin Albumine | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Gradient de densité moyen |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning&trade ; Adhésif pour cellules et tissus Cell-Tak | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Analyseur Seahorse XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Miniplate de culture cellulaire | Agilent Technologies | 103025-100 |
Références
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallm....
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