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方法論記事

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

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DOI:

10.3791/58426

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2018年11月21日

 , 
1CLIP - Childhood Leukemia Investigation Prague, Second Faculty of Medicine, Laboratory of Molecular Genetics, Charles University, Prague

この記事について

サマリー

ここでの代謝状態の白血病患者の骨髄から白血病細胞の分離と解析のためのプロトコルを提案する.主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価は、一次電池の需要のより良い特性を助けることができるし、より個別化医療にまでつながる可能性があります。

要約

癌細胞の代謝の要件および治療効果の生存否定的影響」です。今日では、代謝経路の医薬品ターゲットは、多くの種類の腫瘍でテストします。したがって、がん細胞の代謝セットアップの評価は患者の全体的な結果を改善するために正しい経路をターゲットするために避けられない。残念ながら、癌の大部分は、悪性細胞がかなり高い数値で得にくい、組織生検が必要です。白血病は、白血病細胞の十分な数が骨の髄から分離することができます、例外です。ここでは、白血病患者の骨髄から白血病細胞の分離と細胞外フラックス アナライザーを使用してその代謝状態の後の分析のための詳しいプロトコルを提供します。白血病細胞は、生存に影響しない密度勾配によって分離されます。次の栽培手順を再生成することができます、このように測定代謝状態は最適な条件でセルの状態。このプロトコルは、パーソナライズされた療法に使用できるよく標準化された、一貫性のある結果を達成することができます。

概要

代謝プロファイル細胞の主な特徴の 1 つで、変更された生体エネルギー今がん1,2,3の特徴の 1 つであります。また、代謝のセットアップで変更される可能性があります癌の治療におけるシグナル伝達経路またはがん細胞4,5,6の酵素の機械を対象。癌細胞の代謝の体質を知ることの利点は、現在の療法を向上できます。

培養細胞の代謝活性を評価することが既に確立された方法の多くがあります。解糖作用、に関するグルコース取り込みの放射性標識を用いて測定できる 2 NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) または細胞の乳酸レベル測定酵素によって7,8です。脂肪酸酸化速度は、同位体標識パルミチン酸9,10を用いて別の代謝パラメーターです。酸素消費量はセル11,12、ミトコンドリアの膜電位評価13,14ATP/ADP (アデノシンとともにミトコンドリア活性を決定する広く使用される方法5 '-三リン酸/アデノシン 5'-二リン酸) 比測定15または合計細胞内 ATP 測定16。シグナル伝達経路の代謝過程を規制するため知られている蛋白質の数量ごとに決定され、代謝測定17,18,19の理解を深めることができます。

ただし、これらすべてのメソッドが 1 つだけを測定したり、最良のシナリオでは、1 つのいくつかの代謝パラメーターは同時にサンプルします。重要なは、たとえば、タツノオトシゴ XFp アナライザーによって細胞外フラックス解析による酸素消費量 (OCR) と細胞外酸性化率 (ecar と) の同時測定を実現できます。OCR はミトコンドリア呼吸のインジケーターと ecar とは主に解糖系 (我々 はおそらく高酸化的リン酸化活性と細胞の ecar とを昇降 CO2生産を無視することはできません)、20。これまでのところ、これらのアナライザー21,22,23を使用して種々 の細胞を研究されています。

ここで白血病患者から主芽球 (白血病細胞に由来する未熟造血ステージ) の細胞外フラックス解析のためのプロトコルについて述べる。我々 の知る限り、主な爆発のための特定のプロトコルはまだ利用できません。

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プロトコル

すべてのサンプルは、子供の両親または保護者の informed consent とチャールズ大学、チェコ、プラハ、研究の倫理委員会の承認得られたないです。NV15-28848A。

1. 試薬の調製

  1. 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4、1.47 mM KH2PO4ddH2O. 調整 pH 7.4 に塩酸定置滅菌にオートクレーブに入れることによって溶解して 500 mL の PBS を準備します。
  2. RPMI 培地 100 mL を準備: 10% 牛胎児血清 (FBS)、(100 U/mL) ペニシリン、ストレプトマイシン (100 μ g/mL) を添加した L-アラニル グルタミン RPMI 1640 媒体。
  3. 0.1 M NaHCO3蒸留水 50 mL を準備します。8.1 pH 調整、フィルター殺菌 (0.22 μ m) と 4 ° C で保存
    注: 2 つの 8 も細胞外フラックス アナライザー プレート 0.1 M NaHCO3 pH 8.1 の 250 μ L を準備します。
  4. 蒸留水で 2 M D-グルコースの 1 mL を準備します。フィルター (0.22 μ m) を殺菌し、-20 ° C で保存
  5. 1 mM エタノールのオリゴマイシン A の 100 μ L を準備します。フィルター (0.22 μ m) を殺菌し、-20 ° C で保存
  6. 1 M 2-デオキシ-D-グルコース (2 DG) 最小限 DMEM (ダルベッコ変更イーグル培地) での 250 μ L を準備します。37 ° C に温める、7.4 (37 ° C で pH 測定を行う) に pH を調整します。フィルター (0.22 μ m) を殺菌し、-20 ° C で保存
  7. 1 mm FCCP (カルボニル シアン p trifluoromethoxyphenylhydrazone) DMSO で 100 μ L を準備します。フィルター (0.22 μ m) を殺菌し、-20 ° C で保存
  8. 1 mM ロテノン エタノールの 100 μ L を準備します。フィルター (0.22 μ m) を殺菌し、-20 ° C で保存
  9. 1 mg/mL のエタノールでアンチマイシン A の 100 μ L を準備します。フィルター (0.22 μ m) を殺菌し、-20 ° C で保存
  10. 使用する直前、解糖系のストレス テスト中の 10 mL を準備します。最小限 DMEM を 37 の ° C の水浴中に暖かいし、7.4 (37 ° C で pH 測定を行う) に pH を調整します。
  11. 使用すると、前に BSA を用いたセル水戸ストレス テスト中の 10 mL を準備します。2 ミリメートル L-グルタミン 10 D-グルコース 1 mM HEPES (pH 7.4) 1 mM ピルビン酸と 0.1 %bsa (ウシ血清アルブミン) を最小限 DMEM を補足します。37 の ° C の水浴中に暖かいし、7.4 (37 ° C で pH 測定を行う) に pH を調整します。
  12. 前の使用、BSA のないセル水戸ストレス テスト中の 10 mL を準備します。2 ミリメートル L-グルタミン 10 D-グルコース 1 mM HEPES (pH 7.4) と最小 DMEM を補完し、1 mM ピルビン酸。37 の ° C の水浴中に BSA のないセル水戸ストレス テスト中を温めるし、7.4 (37 ° C で pH 測定を行う) に pH を合わせなさい。
    注: BSA セル水戸ストレス テスト中に追加されますので媒体は BSA を添加したとき、FCCP によりセルが対応 (さまざまな条件がテストされた)。BSA のない培水戸ストレス テストは、製造元が媒体に BSA を使用してお勧めしませんとしてポートを読み込む使用されます。

2. 骨髄単核細胞の分離

注: 理想的には、プライマリ白血病細胞の代謝状態の測定は、骨髄のコレクションおよび細胞の分離の直後から開始されます。それにもかかわらず、関連データは、チェコ共和国で他の血液から交通センター以降後に分離された細胞からも取得でした。滅菌のティッシュ文化フードのすべてのサブ手順に従います。

  1. ウォーム アップ PBS と部屋の温度に密度勾配媒体。
  2. 1:1 の比率で、pbs の白血病患者の骨髄サンプルを希釈します。サンプルに白血病細胞の少なくとも 80% が含まれていることを確認します。
  3. セル型の免疫表現型特性の特定の CD マーカーを用いたフローサイトメトリーによる芽球の割合を決定します。密度勾配分離後全体の細胞数を確立するために核の染付核酸肯定的なイベントを検出します。
  4. 次に、白血病の種類ごとに特定の CD マーカーを用いた白血病細胞を決定: B-すべて (CD19、CD45) T オール (CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD99)、急性骨髄性白血病 (CD45、CD33、および特定の骨髄系マーカー)24。白血病細胞の割合を決定するのにすべての核細胞による特定の CD マーカー陽性白血病細胞の数で割ります。
    注: 骨髄は抗凝固剤をチューブに収集します。
  5. 慎重に希釈した骨髄サンプル 15 mL の円錐管に密度勾配媒体の以上 6 mL の 6 mL をレイヤーします。スイング バケツ ローター ブレーキなしで 4 ° C で 35 分 400 × g で遠心分離機します。
    注: サンプルのより大きい容積より多く因数に分けられるまたは 50 mL の円錐管は密度勾配媒体のより大きい量で使用できます。
  6. パスツール ピペットを使用して、慎重に 5 ml の PBS の新しい 50 mL の円錐管に単核細胞 (図 1) から成っている界面層を転送します。スイング バケツの回転子の 4 ° C で 10 分間 400 × g で遠心分離機します。
    メモ: は、5 ml の PBS の単一の 50 mL の円錐管にすべての単核細胞層を転送します。
  7. 上清を吸引し、2 mL の滅菌 PBS で細胞ペレットを再懸濁します。診断を使用してセルをカウントします。
    注: 吸気骨髄の 1 つの mL での白血病細胞の数は患者25によって明らかに異なります。

3. 一晩単核細胞培養

注: 滅菌のティッシュ文化フードのすべてのサブ手順に従います。

  1. RPMI 20 mL で 2 つの T75 フラスコを準備します。各フラスコに 30 × 106分離した単核球を追加します。5% CO2で 16-24 h、37 ° C のために立ってフラスコとセルを孵化します。

4. 細胞接着剤コーティング プレートの準備

  1. 2 つの 8 も細胞外フラックス アナライザー プレートをコートします。
    注: は、滅菌のティッシュ文化フードのコーティングを実行します。
  2. 細胞粘着の 2.2 μ L を追加 (密度: 2.54 mg/ml) 0.1 M NaHCO3、pH 8.1 を各ウェルにソリューションのピペットすぐに 12.5 μ ・ 250 μ L に。
    注: セル接着剤原液は、密度の異なる、それに応じて NaHCO3に追加ボリュームを調整できます。
  3. 約 20 分のためのフードに座って、細胞接着剤を吸引し、洗っても 2 回 200 μ L の滅菌水を使用して各板ができます。井戸が乾くまで蓋を開けてフードに座らせてください。
  4. すぐにプレートを使用してまたは、結露を避けるためにパラフィン フィルムで包まれる縁と 4 ° C で最大 1 週間を保存します。そのプレートを暖めて室温 (約 20 分) のためにフードに細胞を播種する前に確認します。

5. センサー カートリッジの水和

注: 水和物 2 つ 8 よく細胞フラックス アナライザー カートリッジ。

  1. 独立したユーティリティ プレートとセンサー カートリッジ。研究室のベンチにセンサー カートリッジを逆さに置きます。
  2. 塗りつぶしは各 200 μ L calibrant ユーティリティ板のも。Calibrant の 400 μ L で井戸の外側に各堀を埋めます。
  3. センサー カートリッジを calibrant が含まれていますユーティリティ板に戻ります。
  4. 加湿、非 CO2、37 ° C の定温器一晩でカートリッジのアセンブリを配置します。
  5. 細胞外の磁束計有効にし、37 ° C に暖かい、一晩。

6. 細胞接着剤コーティング プレートで細胞の播種

注: 解糖作用ストレス テストでは、解糖系のストレス テスト中を使用します。セル水戸ストレス テスト、BSA とセル水戸ストレス テスト媒体を使用します。

  1. シード細胞解糖系のストレス テストや個別の刷版でセル水戸ストレス テスト。各テストでは、一晩かけて培養と 1 つのフラスコからセルを使用します。
  2. 室温で 5 分間 200 x g で細胞を遠心します。適切なメディアの 1 mL の細胞を再懸濁しますおよびそれらを数えます。
  3. 生きているセルの 4 x 106を 400 μ L (使用適切な媒体) の最終的なボリュームに追加します。
  4. B G. 井戸に細胞懸濁液の 50 μ L をプレートします。500,000 のセルは 1 つの井戸で播かれるを確認します。
    注: 他の正規化は実行されず、まさに 500,000 細胞/ウェルをシードする重要です。つまり、異なる患者からの結果を比較できます。複製の最適な数は 6 で、ここで説明です。一次電池が誤って動作をすることもありますので、以下の複製を使用してはお勧めしません。
  5. A と H (これらの井戸はバック グラウンド補正となる) の井戸に適切なメディアの 180 μ L を追加します。
  6. 室温で 5 分間 400 x g でプレートを遠心ブレーキを 1 に設定。
  7. ゆっくりと慎重に井戸 B G 2 つ 8 よく細胞フラックス アナライザー板に適切な媒体の 130 μ L を追加します。視覚的に細胞が顕微鏡の下で見るによって安定井戸の底に接着されたを確認します。
  8. プレートに加湿、非 CO2、30 分の 37 ° C の定温器を置きます。

7. センサー カートリッジのロード

  1. 解糖系のストレス テストでは、100 mM グルコースのそれぞれ、20 μ M のオリゴマイシン A 1 M 2 DG、解糖系のストレス テスト中すべて 250 μ L を準備します。
  2. セル水戸ストレス テストの準備 250 μ L 各 20 μ M オリゴマイシン A、FCCP 15 μ M、30 μ M FCCP、10 μ M の混合物ロテノンと BSA のないセル水戸ストレス テスト中にすべて 10 μ g/ml アンチマイシン A。
    注: 1 つのアッセイで FCCP の 2 つの濃度を注入 FCCP 滴定のための十分な患者の材料がないので推奨します。それにもかかわらず、濃度は、研究者によって決定する必要があります。
  3. (表 1) を次のようにカートリッジの適切なインジェクターのポートに化合物を読み込みます。

8. プログラムを設定

  1. 解糖系のストレス テストの表 2で説明したプログラムを設定します。
  2. 表 3で説明したセル水戸ストレス テスト プログラムを設定します。
  3. プログラムを起動します。(プロンプトが表示されたら) アッセイ プレート calibrant プレートを置き換えます。

9. 評価と結果の解釈

  1. 解糖系のストレス テストの結果で他のすべての ecar と値から 2 DG 注射後 ecar との最小値を減算します。
    注: この値が最も小さい非解糖系の酸性化を表します。通常、最小値は 4回測定からです。
  2. 基底の酸性化、解糖系、最大解糖系、解糖系の関数 (図 2 a) から解糖系の準備パラメーターを計算します。最低 ecar と値を差し引いた ecar との最初の 3 つの測定ポイントからの平均として基底の酸性化を計算する (他の 2 つと大きく異なる場合、最初 ecar と value を省略)、ecar と 3 つの測定から平均として解糖系を計算ブドウ糖注射後ポイントし、ecar と 3 つの測定から平均点オリゴマイシン後注射器として最大解を計算します。計算 Glycolytic 最大解糖解糖系マイナスとして予約。
    注: また、最大解計算、測定した 3 つのポイントから最高 ecar と値を使用します。
  3. セル水戸ストレス テストの結果で他のすべての OCR 値からロテノン/アンチマイシン A 注射後 OCR の最小値を減算します。
  4. 基底の呼吸、ATP 生産、最大呼吸およびミトコンドリア機能 (図 2 b) から予備の容量パラメーターを計算します。OCR の最小値を削除した後、最初の 3 つの測定ポイントから OCR の平均として基底呼吸を計算します。
    注: 最大呼吸、FCCP 注射後最高の OCR 値です。
  5. ATP 生産計算のオリゴマイシン基底呼吸から注入後 3 つの OCR 測定ポイントの平均値を減算します。基底の呼吸マイナス最大呼吸としての余力を計算します。
    注: は常に使用される FCCP 濃度に関係なく最高の OCR 値から最大呼吸を計算します。

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結果

図 3は、解糖系のストレス テストは、白血病の芽球の細胞水戸ストレス テスト測定後 BCP すべて (B 細胞前駆急性リンパ芽球性白血病) や急性骨髄性白血病 (急性骨髄性白血病) 患者から曲線を示します。これらの測定からの代謝パラメーターの計算はまた示されます。500,000 細胞/ウェル播種し、すべての測定は hexaplicates で行われました。

解糖系のストレス テストでのみ基本培地使用はので、細胞が栄養素を奪われています。得られた最初のパラメーターは、基底の酸性化は、細胞内のブドウ糖の量を反映すべきです。最初の注射の後、細胞がグルコースを利用、乳酸を発酵させることができますので ecar とが増加します。第 2 注入のオリゴマイシン A は ATP 合成酵素を阻害して、こうして主に解糖系で ATP を生成するために細胞を指示します。これはさらに ecar との昇格を引き起こす必要...

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ディスカッション

急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 患者から得られた主な白血病芽球の OCR と ecar と値によって評価代謝活性の測定により、上記プロトコルまたは急性骨髄性白血病 (AML)。細胞フラックス アナライザーを用いた測定の利点は、生きているセルでリアルタイムで代謝プロファイルの検出できます。基本的に、指定されたプロトコルのすべての段階は、1 つの計画研究に細胞の種類に応じて調節できます。ここでは、結果に影響を与えることができるし、未満の最適な値を提供することを最も重要なパラメーターを説明します。

最適化への第一歩は、新鮮な材料の対材料を凍結から取得したデータの比較でした。冷凍物の代謝活性を測定すること可能になる患者のサンプルを液体窒素のバンクに格納の回顧的な研究。すべてのサンプルの場合、我々 は急性骨髄性白血病細胞は、最適な結果を凍結解除後も測定したに対し、新鮮な素材からのみ一貫した代謝活性を検出することができた。

最適化に向けて 2 番目のステップは、白血病芽球のプライマリの栽培です。(養殖) なし密度勾配分離後まっすぐ、ま...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

チェコ小児血液学センターに感謝したいと思います。この作品は私 nr でグラントの保健省 (NV15 28848A)、厚生省の教育・青少年・ スポーツ当社、チェコ共和国、大学病院 Motol、プラハ、チェコ共和国 00064203 によってサポートされています。LO1604。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementGibco, ThermoFisher Scientific61870-010
Fetal Bovine SerumBioseraFB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco, ThermoFisher Scientific15240-062
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS5761-500G
D-(+) GlucoseSigma-AldrichG7021-100G
オリゴマイシン ASigma-Aldrich75351-5MG
2-デオキシ-D-グルコースSigma-AldrichD8375-1G
FCCPSigma-AldrichC2920-10MG
DMSOSigma-AldrichD8418-100ML
ロテノンSigma-AldrichR8875-1G
アンチマイシン A から ストレプトマイセス sp.Sigma-AldrichA8674-25MG
タツノオトシゴ XF ベース ミディアム、100 mLAgilent Technologies103193-100
L-グルタミン溶液、200 mMSigma-AldrichG7513-100ML
HEPES 溶液、1 M、pH 7.0-7.6Sigma-AldrichH0887-100ML
ピルビン酸ナトリウムSigma-AldrichP5280-25G
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA2153-10G
Ficoll-Paque PlusSigma-AldrichGE17-1440-02密度勾配 中
タツノオトシゴ XFp FluxPakAgilent Technologies103022-100
コーニング&トレード;Cell-Tak 細胞および組織接着剤ThermoFisher ScientificCB40240
タツノオトシゴ分析装置 XFpAgilent TechnologiesS7802A
タツノオトシゴ XFp 細胞培養ミニプレートAgilent Technologies103025-100

参考文献

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