כאן אנו מציגים שלנו פרוטוקול עבור הפקת המושרה אבות erythroid (iEPs) מן העכבר fibroblasts למבוגרים באמצעות מונחי-פקטור שעתוק ישיר לשושלת התכנות (DLR).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות
במאמר זה
סיכום
תקציר
Erythroid תא מחויבות ובידול המשך ההפעלה של שושלת היוחסין מוגבלת לרשת תעתיק בניצוחו של קבוצה של גורל קביעת והתבגרותו גורמים. קודם לכן יצאנו כדי להגדיר את ערכת מינימלי של הגורמים הדרושים להדרכת התפתחות תאי הדם האדומים באמצעות ישיר לשושלת התכנות של fibroblasts לתוך erythroid המושרה אבות/מבשרי (iEPs). הראנו את ביטוי של Gata1, Tal1, Lmo2ו- c-Myc (GTLM) יכול במהירות להמיר מאתר ואנושי fibroblasts ישירות אל iEPs הדומים פיד ה בונה תאים erythroid במונחים של מורפולוגיה, פנוטיפ, ביטוי גנים. בכוונתנו כי iEPs יספק כלי יקר ערך ללמוד אריתרופויזה ותא תקנה הגורל. כאן נתאר את תהליך stepwise המרת fibroblasts קצה הזנב מאתר iEPs דרך שעתוק מונחה גורם ישיר לשושלת התכנות (DLR). בדוגמה זו, אנו מבצעים את התכנות ב fibroblasts מן השושלת-עקיבה erythroid עכברים המבטאים החלבון הניאון צהוב (YFP) תחת השליטה של אריתרופויאטין קולטן ג'ין (EpoR) המקדם, המאפשר ויזואליזציה של תא erythroid אינדוקציה הגורל על התכנות. בעקבות פרוטוקול זה, שניתן לתכנת fibroblasts לתוך iEPs בתוך חמש עד שמונה ימים.
אמנם עדיין ניתן לבצע שיפורים לתהליך, אנו מראים כי בתיווך GTLM התכנות הוא תהליך מהיר וישיר, מניב תאים בעלי מאפיינים של פיד ה bona קדמון erythroid ותאי מבשר.
מבוא
תאי דם אדומים (RBCs) חיוניים כל החולייתנים ותשלימו 84% של כל התאים של הגוף האנושי1 מעובריים לחיים הבוגרים, הבריאות שלנו תלויה מאוד מדויק ההסדרה של RBC הומאוסטזיס. ייצור שוטף של בוגר RBCs במהלך פיתוח לבגרות מכונה אריתרופויזה. האתגר העיקרי במחקר אריתרופויזה הוא להגדיר הרגולטורים מאסטר זה שננהל את התפתחות RBC והבורר בין אריתרופויזה פרימיטיביים ומוחלטת. השושלת ישירה התכנות של אבות erythroid מהווה הזדמנות להבין עוד יותר erythroid פיתוח בתוך vivo.
השושלת ישירה התכנות (DLR), הידוע גם בשם transdifferentiation, הוא התהליך של התכנות סוג תא אחד ישירות לתוך אחר, תוך עקיפת pluripotent ושלבים קדמון multipotent. DLR שימש ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הקמה ותחזוקה של זנב העכבר הראשי עצה פיברובלסט תרבויות
- להכין מאכלים מצופים ג'לטין (ממליץ על צלחת 10 ס מ עבור אחד זנב) על ידי ציפוי המשטח 0.1% ג'לטין המקננת המנות למשך כ 20 דקות ב 37 º C. האחות הפתרון ג'לטין מתוך קערה ולאפשר לו להתייבש במשך שעתיים לפחות.
- המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם. להסיר את הזנב עם מספריים, חיתוך בבסיס הזנב. שים את הזנב ב- saline פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עם 2% סרום שור עוברית (FBS) עד מוכן לשימוש.
הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, זנבות צריך לקחת מן העכברים בסביבות גיל 6 עד 8 שבועות. ניתן לקחת מלוגנו עכברים שגילן עולה על 8 שבועות של גיל, עם זאת, כמו עידן עכברים, את יכולת התפשטות fibroblasts ואת היעילות של התכנות יריד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן אנו מציגים עבור הייצור של iEPs מ fibroblasts למבוגרים באמצעות שעתוק מקדם מונחה-DLR פרוטוקול לשחזור. נוכל להעריך את התא התכנות באמצעות cytometry זרימה, המושבה יוצרי מבחני ג'ין ביטוי ניתוח. על מנת לסייע החזיית ההמרה לגורל erythroid, ביצענו את התכנות על fibroblasts מן העכברים שושלת היוחסין-עקיבה erythroid (Epor- Cre R26- eYFP) אשר מבטאים את החלבון הניאון צהוב (eYFP) מתוך מיקומה Rosa26 בתאים כל המבטאים את הקולטן אריתרופויאטין (Epor, Cre והגיון אלל אחד ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ביטוי של קוקטייל ארבע-factor, GATA1, TAL1, LMO2, ו- c-MYC (GTLM), מספיקה לתכנת fibroblasts מאתר ואנושי ישירות אל iEPs10. התאים היו erythroid דמה מאוד בונה פיד ה אבות erythroid במונחים של מורפולוגיה, פנוטיפ, ביטוי גנים ויכולת המושבה יוצרי. ממצא זה אם יאשר הרציונל של שימוש ישיר התכנות ככלי להגדרת גורמים התפתחותיים ב- hematopoiesis. כדי לתמוך את תוקפו של שיטה זו, iEPs גם ניתן להפיק באמצעו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לדווח.
תודות
אנו מודים אוולין וואנג והייד גרגורי (מכון וייטהד, Cambridge, MA) על שיבוט, הארווי Lodish (מכון וייטהד) למתן רבים פלסמידים משמש ליצירת ספריית retroviral. אנו מודים Kavitha Siva, סופי Singbrant (המחלקה לרפואה מולקולרית, ריפוי גנטי, אוניברסיטת לונד), גוראן קרלסון, סאנג'י שמיט (המחלקה להמטולוגיה מולקולארית, אוניברסיטת לונד) על תפקידיהם בתיאור של ייצור iEP. אנחנו רוצים גם להכיר ולהודות ג'וליאן Pulecio (מרכז של רפואה רגנרטיבית, ברצלונה פארק מחקר ביו-רפואית), ויולטה זהורית-אסטרדה (רוקפלר אוניברסיטה, ניו יורק), קארל Walkley (המכון למחקר רפואי סנט וינסנט, מחלקת רפואה, בית החולים סנט וינסנט, אוניברסיטת מלבורן), רעיה אנחל (קטלאנית במוסד לחולי ומחקר ללימודים מתקדמים, ברצלונה), ענ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM ללא נתרן פירובט | GE Life Sciences | SH30022.01 | אמצעי תרבית לתאי PhGP |
| DMEM עם נתרן פירובט | GE Life Sciences | SH30243.01 | אמצעי תרבית לפיברובלסטים בקצה הזנב |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | טכנולוגיות תאי גזע | 9650 | מדיית תכנות מחדש |
| סרום בקר עוברי HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | גורם גדילה |
| פניצילין/סטרפטומיצין HyClone (100x) | GE Life Sciences | SV30010 | אנטיבויוטיות |
| לא חיוניות (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL Media מסופקת עם |
| חומר דיסוציאציה | Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 |
| פקטור תאי גזע של עכברים (mSCF) | פרוטק | 250-03 | נוסף לתכנות מחדש |
| של מדיה רקומביננטית עכברית Il-3 | פפרוטק | 213-13 | נוסף לתכנות מחדש של מדיה |
| אריתרופוייטין אנושי רקומביננטי (hrEPO) | פפרוטק | 100-64 | נוסף לתכנות מחדש של מדיה |
| דקסמתזון | סיגמא | 50-02-2 | נוסף לתכנות מחדש של מדיה |
| ג'לטין מעור חזיר | סיגמא | 9000-70-8 | מפורק ב- dH2O ומשמש לציפוי צלחות. יש לוודא סטריליות לפני השימוש. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | אנטיביוטיקה לבחירה. משפיע הן על תאים פרו-והן על תאים אוקריוטיים |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | משמש לשלבי כביסה |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | זיהום / טרנספקציה מגיב |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | מגיב טרנספקציה לקו תאים PhGP |
| Millex-GP יחידת מסנן מזרק 0.22 ומיקרו; m | Merck | SLGP033RS | משמש לסינון וירוסים סופרנטנט |
| BD אמרלד מזרק היפודרמי | בקטון דיקינסון | מק"ט: 307736 | משמש לסינון וירוס סופרנטנט |
| 100 מ"מ צלחת תרבית | קורנינג | 430167 | תרבית תאים |
| צלחת 6 בארות | פלקון | 10799541 | תרבית תאים |
| תכשיטן מלקחיים #5 | Sklar | 66-7642 | משמש ל טיפול בשברי זנב קטנים |
| מספריים איריס Sklarlite | Sklar | 23-1149 | משמש לחיתוך הזנב לחתיכות קטנות |
| ערכת דלדול תאים שושלת, עכבר | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | לדלדול תאים המטופויאטיים בתרביות פיברובלסטים |
| CD117 MicroBeads, עכבר | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | לדלדול תאים המטופויאטיים בתרביות |
| פיברובלסטיםתאי PheonixGP | ATCC | CRL-3215 | קו תאי אריזה רטרו-ויראלי |
| וקטור EcoPAC (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | וקטור עוזר רטרו-ויראלי המכיל גנים gag ו-pol |
| pMX-Gata1 | משובט במעבדה | ||
| pMX-Tal1 | משובט במעבדה | ||
| pMX-Lmo2 | משובט במעבדה | ||
| pMX-cMyc | משובט במעבדה | ||
| תוכנת CellSens Standard 1.6 | תוכנה לניתוח ציטוספין |
מקורות
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
