Qui vi presentiamo il nostro protocollo per produzione indotta da progenitori eritroidi (iEPs) dai fibroblasti adulti del mouse utilizzando la trascrizione factor-driven diretto lignaggio riprogrammazione (DLR).
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Articolo metodologico
Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Differenziazione e impegno delle cellule eritroidi procedere attraverso l'attivazione di una rete di transcriptional lignaggio-limitata orchestrata da un gruppo di destino delle cellule determinazione e fattori di maturazione. Abbiamo precisato in precedenza per definire il set minimo dei fattori necessari per istruire il globulo rosso sviluppo utilizzando discendenza diretta riprogrammazione dei fibroblasti in progenitori/precursori eritroidi indotta (iEPs). Abbiamo mostrato che la sovraespressione di Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) può rapidamente convertire murine ed umane fibroblasti direttamente a iEPs che assomigliano alle cellule eritroidi bona fide in termini di morfologia, fenotipo, e l'espressione genica. Intendiamo che iEPs fornirà uno strumento prezioso per studiare il regolamento di destino delle cellule e di eritropoiesi. Qui descriviamo il processo graduale di conversione fibroblasti punta coda murino in iEPs tramite trascrizione factor-driven discendenza diretta riprogrammazione (DLR). In questo esempio, eseguiamo la riprogrammazione in fibroblasti dai topi di lignaggio traccia degli eritrociti che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) sotto il controllo del promotore del gene (EpoR) del recettore dell'eritropoietina, consentendo la visualizzazione di cellule eritroidi induzione di destino su riprogrammazione. A seguito di questo protocollo, fibroblasti possono essere riprogrammati in iEPs entro cinque-otto giorni.
Mentre possono ancora essere apportati miglioramenti al processo, indichiamo che GTLM-mediata riprogrammazione è un processo rapido e diretto, producendo cellule con proprietà di bona fide cellule eritroidi progenitrici e precursore.
Introduzione
Globuli rossi (RBCs) sono essenziali in tutti i vertebrati e costituiscono l'84% di tutte le cellule dei corpi umani1. Da embrionali alla vita adulta, la nostra salute dipende altamente esatta regolazione dell'omeostasi di RBC. La produzione costante di RBCs maturo nel corso dello sviluppo in età adulta è noto come eritropoiesi. Una sfida importante nella ricerca di eritropoiesi è quello di definire i regolatori matrici che orchestrano sviluppo di RBC e lo switch tra eritropoiesi primitivo e definitiva. Discendenza diretta riprogrammazione dei progenitori eritroidi rappresenta un'opportunità per capire meglio degli eritrociti sviluppo in vi....
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Protocollo
1. stabilimento ed il mantenimento della coda del Mouse primario suggerimento culture del fibroblasto
- Preparare piatti rivestite con gelatina (consigliamo un piatto di 10 cm per una coda) che copre la superficie con 0,1% di gelatina e incubando i piatti per circa 20 min a 37 ° C. Aspirare la soluzione di gelatina dal piatto e lasciare asciugare per almeno 2 h.
- Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Rimuovere la coda con le forbici, tagliare alla base della coda. Mettere la coda in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) con 2% siero bovino fetale (FBS) fino all'uso.
Nota: Per ottenere risultati ottimali, code devono essere prelevate da....
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Risultati
Qui presentiamo un protocollo riproducibile per la produzione di iEPs dai fibroblasti adulti utilizzando trascrizione factor-driven DLR. Valutiamo la riprogrammazione delle cellule tramite flusso cytometry, formanti colonie saggi e gene analisi di espressione. Al fine di facilitare la visualizzazione della conversione al destino delle cellule eritroidi, abbiamo effettuato la riprogrammazione sui fibroblasti dai topi lignaggio traccia degli eritrociti (Epor- Cre R26- eYFP.......
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Discussione
Sovraespressione di un cocktail di quattro-fattore, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), è sufficiente per la riprogrammazione di fibroblasti murini ed umani direttamente a iEPs10. Cellule eritroidi riprogrammate notevolmente ha assomigliato a bona fide progenitori eritroidi in termini di morfologia, fenotipo, espressione genica e possibilità di formazione di colonie. Questa scoperta conf.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse al rapporto.
Ringraziamenti
Ringraziamo Evelyn Wang e Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) per la clonazione e Harvey Lodish (Whitehead Institute) per fornire molti dei plasmidi utilizzati per generare la libreria retrovirale. Ringraziamo Riccardo Siva e Sofie Singbrant (dipartimento di medicina molecolare e Gene Therapy, Università di Lund), Göran Karlsson e Shamit Soneji (dipartimento di ematologia molecolare, Università di Lund) per i loro ruoli nella descrizione della produzione iEP. Inoltre vorremmo citare e ringraziare Julian Pulecio (centro di medicina rigenerativa, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM senza piruvato di sodio | GE Life Sciences | SH30022.01 | Terreni di coltura per cellule PhGP |
| DMEM con piruvato di sodio | GE Life Sciences | SH30243.01 | Terreni di coltura per fibroblasti della punta della coda |
| Terreni di espansione liberi da siero StemSpan (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Terreni di riprogrammazione |
| Siero fetale bovino HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Fattore di crescita |
| Penicillina/Streptomicina HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | non essenziali antiboiotici |
| (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media è fornito con questo |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Agente di dissociazione cellulare |
| Fattore di cellule staminali murine (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Aggiunto ai terreni di riprogrammazione Recombinant |
| Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Aggiunto ai terreni di riprogrammazione |
| eritropoietina ricombinante umana (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Aggiunto ai terreni di riprogrammazione |
| Desametasone | Sigma | 50-02-2 | Aggiunto ai supporti di riprogrammazione |
| Gelatina da pelle suina | Sigma | 9000-70-8 | Sovviato in dH2O e utilizzato per il rivestimento di lastre. Garantire la sterilità prima dell'uso. |
| Blasticidina S cloridrato | Sigma | 3/9/3513 | Antibiotico di selezione. Colpisce sia le cellule pro- che quelle eucariotiche |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Utilizzato per le fasi di lavaggio |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infezione / Trasfezione Reagente |
| FuGENE HD Reagente di trasfezione | Promega | E2311 | Reagente di trasfezione per linea cellulare PhGP |
| Millex-GP Siringa Unità di filtro 0,22 &; m | Merck | SLGP033RS | Utilizzato per filtrare il surnatante del virus |
| BD Siringa ipodermica Emerald | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Utilizzato per filtrare il surnatante del virus |
| Piatto di coltura da 100 mm Corning | 430167 | Piastra | |
| 6 pozzetti | Falcon | 10799541 | Pinza per gioielliere per colture cellulari |
| #5 | Sklar | 66-7642 | Utilizzato per manipolazione di piccoli frammenti di coda |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Utilizzato per tagliare la coda in piccoli pezzi |
| Kit di deplezione delle cellule di lignaggio, topo | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Per la deplezione delle cellule ematopoietiche in colture di fibroblasti |
| CD117 MicroBeads, | topo Miltenyi Biotec | 130-091-224 | Per la deplezione delle cellule ematopoietiche nelle colture |
| di fibroblastiCellule PheonixGP | ATCC | CRL-3215 | linea cellulare di imballaggio retrovirale |
| vettore EcoPAC (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | vettore helper retrovirale contenente geni gag e pol |
| pMX-Gata1 | Clonato in laboratorio | ||
| pMX-Tal1 | Clonato in laboratorio | ||
| pMX-Lmo2 | Clonato in laboratorio | ||
| pMX-cMyc | Clonato in laboratorio | ||
| Software CellSens Standard 1.6 | Software di analisi di citospin |
Riferimenti
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M.
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Ristampe e permessi
