Summary
Her præsenterer vi vores protokol for producerer induceret erythroid ophav (iEPs) fra mus voksen fibroblaster transskription faktor-drevet direkte afstamning omprogrammering (DLR).
Abstract
Erythroid celle engagement og differentiering fortsætte gennem aktivering af en slægt-begrænset transcriptional netværk orkestreret af en gruppe af celle skæbne bestemmelse og modning faktorer. Vi tidligere fastsat til at definere den minimalt sæt af nødvendige for instruere rød blod celle udvikling ved hjælp af direkte afstamning omprogrammering af fibroblaster til induceret erythroid progenitorceller/prækursorer (iEPs) faktorer. Vi viste at overekspression af Gata1, Tal1, Lmo2og c-Myc (GTLM) kan hurtigt konvertere murine og humane fibroblaster direkte til iEPs, der ligner Bonafide erythroid celler i morfologi, fænotype, og genekspression. Vi har til hensigt at iEPs vil give et uvurderligt værktøj for at studere erythropoiesen og celle skæbne forordning. Her beskriver vi de trinvis proces med at konvertere murine Hale spids fibroblaster til iEPs via transskription faktor-drevet direkte afstamning omprogrammering (DLR). I dette eksempel udføre vi omprogrammering i fibroblaster fra erythroid afstamning sporingen mus, der udtrykker den gul fluorescerende proteiner (YFP) under kontrol af erythropoietin receptor genet (EpoR) promotor, gør det muligt for visualisering af erythroid celle skæbne induktion ved omprogrammering. Efter denne protokol, kan fibroblaster omprogrammeres til iEPs inden for fem til otte dage.
Mens kan stadig forbedres til processen, viser vi, at GTLM-medieret omprogrammering er en hurtig og direkte proces, giver celler med egenskaberne for Bonafide erythroid Stamform og forløber celler.
Introduction
Røde blodlegemer (RBC) er afgørende i alle hvirveldyr og udgør 84% af alle celler af menneskelige organer1. Fra embryonale til voksne liv er vores sundhed meget afhængig af præcis regulering af RBC homøostase. Den løbende produktion af modne røde blodlegemer i hele udvikling ind i voksenalderen er kendt som erythropoiesen. En stor udfordring i erythropoiesen forskning er at definere de master regulatorer, der dirigerer RBC udvikling og skifte mellem primitive og endelige erythropoiesen. Direkte afstamning omprogrammering af erythroid progenitorceller præsenterer en lejlighed til yderligere at forstå erythroid udvikling in vivo.
Direkte afstamning omprogrammering (DLR), også kendt som transdifferentiation, er processen med omprogrammering én celletype direkte ind i en anden, omgåelse pluripotente og Multipotente stamceller faser. DLR er hidtil blevet brugt til at producere mange celletyper, herunder neurale2, hæmatopoietisk3,4,5, hepatisk6 og nefrotisk7, stamceller. For udviklingsmæssige biologer, er DLR blevet et vigtigt redskab for afhører aspekter af afstamning engagement og terminal differentiering processer8,9. DLR kan supplere og delvist erstatte i vivo undersøgelser for forståelse mekanismer af celle skæbne afgørende faktorer under udviklingen. DLR protokol for omprogrammering til erythroid progenitorceller beskrevet i denne hvidbog indeholder feltet en gratis metode til udviklingsmæssige undersøgelser af erythropoiesen.
Vi har tidligere vist, at overekspression af en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er tilstrækkelige til at omprogrammere murine og humane fibroblaster direkte til induceret erythroid ophav (iEPs) 10. the GTLM omprogrammerede erythroid celler meget ligner Bonafide primitive erythroid ophav i form af morfologi og fænotype gen expression10. Dermed iEPs har begrænset spredning kapacitet og moden til nukleeret erytrocytter svarende til dem, der forbigående produceres i den tidlige embryon før starten af endelige erythropoiesen. Ved at foretage ændringer i de omprogrammering betingelser (fx punktmutationer i omprogrammering faktorer eller tilsætning af andre faktorer), kan man forstå, hvordan dette fører til ændringer i erythroid udvikling og differentiering. Vi har for eksempel vist at tilføjelsen af Klf1 eller Myb til GTLM cocktail ændrer globin udtryk mønster fra overvejende embryonale (primitiv) til fortrinsvis voksne (endelige). Dette resultat bekræfter gyldigheden af ved hjælp af DLR som et redskab til at definere udviklingsmæssige faktorer i erythropoiesen.
Her, skitsere vi processen til oprettelse af iEPs fra mus Hale spids fibroblaster (TTF). I vores repræsentative resultater, vi udførte omprogrammering på fibroblaster fra erythroid afstamning sporingen mus (Epor- Cre R26- eYFP) som express gul fluorescerende proteiner (eYFP) fra Rosa26 locus i alle celler, har udtrykt erythropoietin receptor, giver mulighed for nem visualisering af engagement i erythroid slægt. Du bruger denne metode, er YFP positive (EpoR +) celler til stede så tidligt som i fem dage efter transduktion. Denne protokol tilbyder derfor en hurtig og robust teknik for generation af erythroid ophav i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. etablering og vedligeholdelse af primære mus Hale spids Fibroblast kulturer
- Forberede gelatine-belagt retter (anbefale en 10 cm parabol for en hale) ved at dække overfladen med 0,1% gelatine og inkubere retter i ca 20 min. ved 37 ° C. Opsug den gelatine løsning fra skålen og lad det tørre i mindst 2 timer.
- Aflive mus af cervikal dislokation. Fjerne halen med en saks, klippe i bunden af halen. Sætte hale i Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) med 2% føtal bovint serum (FBS) indtil klar til brug.
Bemærk: For de bedste resultater, haler bør tages fra mus omkring 6-8 ugens i alder. Haler kan tages fra mus ældre end 8 ugens i alder, men som en mus alder, mulighed for spredning af fibroblaster og effektiviteten af omprogrammering faldet11. - Udføre alle efterfølgende trin af denne protokol i en vævskultur hood under sterile forhold. Forberede en fortyndet trypsin løsning af 0,02% trypsin-EDTA i DPBS og tilsættes 5 mL i en ubestrøget 10 cm parabol.
- Vaske hale, først i 70% ethanol, derefter i DPBS. I en skål, læg halen flad og bruge pincet til at holde det på plads. Gøre et snit på hale langs sin længdeakse fra bunden til spidsen.
- Forstå halen med et par pincet og hold det lodret. Ved hjælp af et andet par pincet, greb i huden ved siden af snit i bunden af halen og skræl det tilbage. Gør dette på begge sider af indsnittet indtil huden kan være pillet ud ved at trække nedad mod spidsen af halen.
- Holde den flåede hale med pincet over fadet med trypsin løsning og skæres hale i ca 1 cm lange stykker. Med halen stykker i opløsningen trypsin, skal du bruge saks til at fragmentere stykker i mindre stykker. Inkuber halen stykker i opløsningen trypsin ved 37 ° C i 10 min.
Bemærk: Jo mindre stykker er foretrukket for at give hvert stykke et højt areal til volumen-forholdet. - Dæmpning af trypsin ved hjælp af 2 bind af fibroblast ekspansion (FEX) medium (high-glucose Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) med 15% FBS, 2 mM L-glutamin, Non-essentielle aminosyrer (NEAA) og 100 U/mL Penicillin/Streptomycin).
- Samle hele indholdet af skålen i en 50 mL tube og centrifugeres ved 350 × g i 5 min. ved 4 ° C. Opsug supernatanten og resuspend hale fragmenter i 10 mL frisk FEX medium.
- Overføre hale fragmenter i medium til en gelatine-belagte fad og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 og 4% O2, tilføje frisk FEX medium hver 2 dage.
Bemærk: Efter fem til syv dage, hale fragmenter er fastgjort i bunden af fadet og fibroblaster kan ses på vej væk fra dem. - Når klynger af fibroblaster er plettet, Ryst forsigtigt parabol for at løsne halen stykker og Opsug mediet og alle knoglerester forlader fibroblaster knyttet til pladen. Tilføje nye FEX medium og kultur fibroblaster indtil sammenflydende.
- For at sikre ingen forurening af fibroblaster af hæmatopoietisk progenitorceller, adskille celler fra pladen ved hjælp af 1 x trypsin-EDTA i 5 minutter og indsamle celler. Nedbryder til celler, der udtrykker hæmatopoietisk markører (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4, og Ter-119) ved hjælp af en magnetisk separation system10.
2. retrovirus produktion
- Seed retroviral emballage celler på ca 2,5 × 104 celler/cm2 (2,0 × 106 celler for en 10 cm parabol) på en vævskultur-behandlede (af vakuum-gas plasma) parabol og kultur overnatning i høj-glucose DMEM med 10% FBS, 10 mM natrium Pyruvat, og 100 U/mL Penicillin/Streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2.
- Den følgende morgen, ændre mediet til DMEM med ingen tilsætningsstoffer med halv diskenhed anvendes til kultur natten (5 mL i en 10 cm parabol). Om eftermiddagen, kontrollere, at cellerne er 70-80% sammenflydende og begynde Transfektion.
- For hver omprogrammering faktor forberede Gata1, Tal1, Lmo2, og c-Myc, en 2:1 blanding af udtrykket vektor (pMX) og helper vektor (indeholdende gag og pol gener). For en 10 cm parabol af fibroblaster, bruge 6 µg udtryk vektor og 3 µg af helper vektor i en endelige mængden af 100 µL i DMEM medium.
- For hver omprogrammering faktor, forberede 300 µL af stuetemperatur (RT) DMEM i et sterilt polystyren rør og forsigtigt tilføje 27 µL af kommercielle Transfektion reagens.
Bemærk: Transfektion reagens skal bringes til RT før brug og skal føjes direkte til mediet, som de elektrostatiske egenskaber i indholdsstofferne, som kan gøre det stick til den plast mur af røret. - Tilføje plasmid blandingen ind i Transfektion reagens-holdige rør, vortex kort og inkuberes Transfektion reagens-DNA blanding i 15 min. på RT. kortvarigt vortex blandingen og tilføje det dråbevis til retroviral emballage celler så Transfektion reagens-DNA mix er jævnt fordelt over kultur og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- 24 timer efter Transfektion, ændre mediet til DMEM med 20% FBS og 100 U/mL Penicillin/Streptomycin. 48 timer efter Transfektion, indsamle supernatanten og filtreres gennem et 0,22 µm pore-størrelse sprøjte filter.
Bemærk: Viral analysere kan være frosset til-80 ° C og holdt indtil kræves, selv om transduktion er mere effektive hvis friske viral supernatanten anvendes.
3. GTLM transduktion og iEP høst
- Frø halen tip fibroblaster på 1 × 104 celler/cm2 på 0,1% gelatine overfladebelagt retter i FEX medium og inkuberes ved 37 ° C i 24 timer.
- Den følgende dag, forberede en transduktion blanding som følger.
- Tilføje 1 volumen af viral supernatanten for hver omprogrammering faktor suppleret med 4 µg/mL retroviral infektion reagens (40%) til 6 bind af FEX medium (60%).
- For en 10 cm parabol af fibroblaster, der tilsættes 1 mL af hver viral supernatanten (4 × vira = 4 mL) suppleret med 4 µg/mL retroviral infektion reagens til 6 mL af FEX medium, hvilket giver i alt 10 mL transduktion blanding.
- Opsug FEX medium fra fibroblast kultur og erstatte det med transduktion blanding. Inkuber transduktion i 4 timer ved 37 ° C i hypoksiske betingelser (5% CO2 og 4% O2).
- Opsug transduktion blandingen og erstatte det med friske omprogrammering medium (serumfrit ekspansion medium (SFEM), 100 U/mLPenicillin/Streptomycin, 100 ng/mL murine stamcelle faktor (mSCF), 10 ng/mL murine interleukin-3 (IL3), 2 U/mL humane rekombinante Erythropoietin (hrEPO) og 100 nM dexamethason).
- Inkuber i 8 daysat 37 ° C i hypoksiske betingelser, tilføje frisk omprogrammering medium hver 2 dage. Efter fem til otte dage, vil vellykket omprogrammering give klynger af celler, der er skilt fra pladen.
- For at indsamle omprogrammerede celler til analyse, forsigtigt pipetteres op og ned for at høste dem direkte fra fadet. For at høste untransduced fibroblaster til sammenligning, tage afstand celler fra pladen ved hjælp af 1 x trypsin-EDTA og indsamle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenterer vi en reproducerbar protokol til produktion af iEPs fra voksen fibroblaster transskription faktor-drevet DLR. Vi evaluerer celle omprogrammering bruger flowcytometri, kolonidannende assays og gen expression analyse. For at hjælpe med visualisering af konvertering til erythroid celle skæbne, vi udførte omprogrammering på fibroblaster fra erythroid afstamning sporingen mus (Epor- Cre R26- eYFP) som udtryk for den gule fluorescerende proteiner (eYFP) fra Rosa26 locus i alle celler, der udtrykker erythropoietin receptor (Epor, Cre bankede ind i en allel af den endogene Epor locus) udskrift på alle stadier af deres udvikling12,13 ( Figur 1A). Efter vellykket omprogrammering af induceret erythroid progenitorceller, er YFP positive (EpoR +) celler observerbare så tidligt som i fem dage efter transduktion. Dag 5 af omprogrammering, celler blive runde, løfte fra overfladen af pladen og begynde at danne klynger. Dag 5-iEPs vise en erythroid forløber-lignende morfologi, der har en karakteristisk centrale kerne, grove kromatin og blå cytoplasma efter maj-Grünwald-Giemsa farvning (figur 1C). Hemoglobinization af nogle celler fremgår af positive benzidin farvning og et mildt røde udseende når pelleted (Fig. 1 d-E). Endvidere er en lille brøkdel af dag 5-iEPs Co express YFP og erythroid-specifikke overflade markør Ter119 (figur 1F). Om dagen 8 kan store YFP + klynger ses. Dag 8iEPs præsentere et mere differentieret erythroid fænotype end dagen 5 iEPs; de er betydeligt mindre, har akkumuleret mere hæmoglobin, og også vise betydeligt upregulated udtryk for Ter119 (figur 1B-1 G). Cyto-spin i dag 8-iEPs afsløre erythroid-lignende morfologi, mens meget få kerneløse reticulocytes overholdes (figur 1H).
Gen expression analyse af kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) af bulk iEPs indsamlet på dag 8 viser, at de har næsten lukning udtryk for fibroblast gener og har upregulated mange erythroid gener herunder globin gener, overvejende at udtrykke embryonale typer (figur 1jeg). For at vurdere, om de omprogrammerede celler overgang gennem Multipotente stamceller, vi udførte et tidsforløb og analyseret udtryk for hæmatopoietisk markører i hele omprogrammering. Vi har tidligere rapporteret, at erythroid forløber output var højest på dag 6, efterfulgt af dag 8, med 10,5% ± 4,6% og 6,6% ± 0,5% af levende YFP + celler Co udtrykker CD71 og Ter119, henholdsvis10. Der er også en befolkning på CD41 positive celler før fremkomsten af Ter119 positive celler. Hverken c-kit eller CD45 markører, som er normalt udtrykt i hæmatopoietisk Stamform og downregulated i erythropoiesen, udtrykkes på ethvert punkt i den omprogrammering (figur 1J). Disse data tyder på, at cellerne ikke går gennem en Multipotente hæmatopoietisk stamfader eller tidligere stadium, nok måske overgangen gennem en megakaryocyte-erythroid Stamform.
En pålidelig måde at vurdere effektiviteten af omprogrammering er at udføre BFU-E kolonidannende assays på de omprogrammerede celler. In vitro differentiering kapacitet på dag 5- og dag 8-iEPs blev analyseret i methylcellulose suppleret med menneskelige erytropoietin, murine stamcelle faktor og dexamethason. Efter 8 dage, iEPs dannet to typer af kolonier: udpræget rød (rød iEP) og ikke-synligt røde (ikke-røde iEP). Mens celler fra røde kolonier vises erythroblast morfologi, celler fra ikke-rød kolonier ligne ikke erythroid celler, og var uregelmæssig, havde store dybe blå og granuleret cytoplasma (fig. 2A).
Dag 5-iEPs dannet ca 1 i 1,000 røde kolonier, mens kun ca 1:10,000 dag 8-iEPs dannede røde kolonier, med en meget højere andel af ikke-rød kolonier dannet (figur 2B). Denne reduktion i kolonidannende evne mellem dag 5- og dag 8-iEPs kunne være forklaret byiEPs gennemgår differentiering fra dage 5-8 og GTLM udtryk vektorer lider silencing over tid. qPCR analyse bekræftet, at udtryk for de eksogene udskrift falder væsentligt fra dage 5 til 8. Som forventet i vellykket omprogrammering, udtryk niveauer af endogent Gata1, Tal1, Lmo2og c-Myc er induceret, endogene Lmo2 udtryk er dog kun meget ringe udtrykt (figur 2C).
Et punkt at bemærke, og en begrænsning af analysen, er at ikke-rød kolonier makrofag-lignende celler overtal røde hemoglobinized iEP kolonierne dannet af omprogrammeret fibroblaster i kolonidannende assays. Kolonidannende evnen til at skabe rød iEP kolonier kan forbedres ved at ændre de støkiometriske forhold mellem GTLM faktorer. Transducing celler med dobbelt beløb af Tal1 og Lmo2 udtryk vektorer førte til en svag stigning i forholdet mellem rød kolonier over ikke-rød kolonier, mens ekstra Gata1 førte til en betydelig stigning i dannelsen af røde kolonier og næsten en fuldstændig fjernelse af ikke-rød kolonier støtte spiller en vigtig rolle for disse faktorer i erythropoiesen (figur 2D). Interessant, øger øget udtryk for c-Myc drastisk produktionen af ikke-rød kolonier på trods af at være uundværlig for omprogrammering. For at få ren induceret erythroid ophav til downstream analyse, kan kolonier isoleres fra de kolonidannende assays. Vi udførte gen expression analyse i form af microarray på rød og ikke-rød kolonier fra dag 5-iEPs og kolonier fra 14,5 dage efter coitus (dpc) føtal lever (FL) og voksen knoglemarv (BM) til sammenligning. Microarray data er tilgængelige gennem NCBIS gen Expression Omnibus (GEO): GSE73344. Vi har tidligere vist, at røde-iEP kolonier ligner Bonafide erythroid kolonier (FL og BM) af genet udtryk10. Undersøgelse af udtrykket Gata1, Tal1, Lmo2, og c-Myc i hver koloni viser, at mens de røde kolonier viser lignende niveauer af udtryk for alle fire faktorer til FL og BM, ikke-rød kolonier har lavere udtryk for alle faktorer, især Gata1 (figur 2E). For at forstå, hvad er ikke-rød kolonierne makrofag-lignende celler, vi undersøgte udtryk for celle type-specifikke gener i hver type af kolonien fra microarray data. Som tidligere rapporteret express de røde kolonier mange erythroid-specifikke gener, svarer til FL og BM. Efter gennemgang af data, er det klart, at de ikke-rød kolonier Vis høj udtryk for en række gener karakteristiske makrofag celler14 (figur 2F). Hverken rødt eller ikke-rød kolonier viser signifikant øget udtryk for typisk megakaryocyte gener15. Sammen, tyder disse data på, at de ikke-rød kolonier mere nøje ligner makrofager end erytrocytter. Da ikke-rød kolonier er aldrig observeret, når en af GTLM faktorer er fjernet synes disse makrofag-lignende celler at dannes, når udtrykket niveauer af en eller flere af de omprogrammering faktorer Gata1, Tal1, Lmo2 er lavere end nødvendige for omprogrammering til iEPs. Sammen, tyder dette på, at udtrykket niveauer af alle fire GTLM faktorer er vigtige i TTF til iEP omprogrammering og at heterogenitet forklares ved ufuldstændig omprogrammering af individuelle celler, som potentielt kan rettes ved at justere støkiometriske forhold.
For at vurdere effektivitet og robusthed af vores protokol, vi testede sæt numre af fibroblaster evne til at producere synlige klynger af iEP celler efter 5 dage når kulturperler i 384-godt plader. Vi fast besluttet på at ud af 24 transductions 20, 30, 40 og 50 TTFs, antallet af brønde med mindst én iEP klynge var 3 (0,6% af plader fibroblaster), 15 (2,0% af plader fibroblaster), 15 (1,6% af plader fibroblaster) og 13 (1.1% af plader fibroblaster) , henholdsvis. Dette tyder på at GLTM iEP omprogrammering er en robust og pålidelig proces, der kan nå en virkningsgrad på 1%.
Andre faktorer, der kan påvirke effektiviteten af omprogrammering indeholde passage af fibroblaster og dyrkningsbetingelserne. Vi sammenlignede omprogrammering effektiviteten af TTFs, der havde været passaged tre gange eller ni gange før transduktion. TTFs, der havde været passaged ni gange (P9) viste en dramatisk reduktion i evnen til at producere klynger af iEPs (fig. 3A). Interessant, inddragelse af serum i omprogrammering medierne helt blokke omprogrammering, erstatter serum med erythroid cytokiner er nødvendigt at tillade de transduced faktorer til at køre den nye celle skæbne uden kompoundering signaler fra serum. Fjernelse af serum og udtryk for nye faktorer inden for cellen er tilbøjelige til at være stressende på cellerne. Faktisk øget blokere p53 aktivering stærkt antallet af iEPs genereret. Denne effekt kan også ses i omprogrammering af p53 knockout fibroblaster (fig. 3B-D). Hæmning af p53 signalering fører til mere celle overlevelse og bedre omprogrammering og en valideret metode til at forbedre udbyttet. Endelig er omprogrammering i hypoksiske betingelser gunstige, men ikke afgørende for iEP produktion. Dog transduced TTFs kulturperler i normoxia er meget langsommere til at omprogrammere og iEP klynger er observeret efter 10 dage i stedet for fem til otte dage (figur 3E).
Figur 1 : Tvungen udtryk for Gata1, Tal1, Lmo2, og c-Myc omprogrammerer murine voksen fibroblaster i erythroid progenitorceller, som udviser egenskaber af Bonafide erythroid celler. (A) eksperimentelle design for transskription faktor-medieret omprogrammering af erythroid reporter (Epor-Cre R26-eYFP) Hale spids fibroblaster (TTF) til EpoR + omprogrammerede celler. (B-F) Tid forløbet af iEP generation af untransduced TTFs (dag 0) og bulk GTLM-transduced TTFs på dag 5 og 8 (repræsentant for n = 2-3). Transdifferentiation blev evalueret ved (B) levende celle, lysfelt billeder af enkelt brønde (skala bar, 50 µm); (C) maj-Grünwald - Giemsa farvning cyto-spin (skalalinjen, 20 µm); (D) benzidin/Giemsa farvning cyto-spin (skalalinjen, 20 µm); (E) makroskopisk inspektion af celle pellets; og (F) repræsentative flowcytometri grunde viser YFP / Ter119 udtryk. (G) celle diameter af iEPs høstet på dage 5 og 8 målt fra flere cyto-spin dias, viser et fald i Cellestørrelse på dag 8. Data præsenteres som betyder ± SD (n = 21-25); p ≤ 0,0001 af uparret t-test. (H) repræsentative høj opløsning benzidin/Giemsa billeder af GTLM-transduced TTFs dag 8. Skalalinjen, 5 µm. (I) Relative mRNA udtryk for relevante fibroblast - og erythroid-specifikke gener herunder globin gener i untransduced TTFs (grå søjler) versus bulk GTLM-transduced TTFs (røde søjler) på dag 8, bestemmes af qPCR. Data præsenteres som betyder ± SD (n = 4-6 til iEPs, n = 2 for untransduced TTFs). (J) graf viser Resumé af tidsforløb flow flowcytometri analyse af untransduced TTF (dag 0) og bulk GTLM-transduced TTF høstet på dag 2, 4, 6 og 8 viser YFP, CD45, CD71 og Ter119 udtryk (n = 3). Data præsenteres som gennemsnit ± SD. figur er tilpasset fra Capellera-Garcia S, mfl. 10. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : GTLM iEPs producere røde og ikke-rød kolonier i BFU-E koloni assays. (A) repræsentative lysfelt og maj-Grünwald-Giemsa cytospin billeder af iEP-afledte rød og ikke-rød kolonier. Skala barer, 50 µm (koloni billeder) og 10 µm (cyto-spin billeder). (B) koloni tæller genereret fra forgyldt untransduced TTFs, bulk dag 5 iEPs og bulk dag 8. Data præsenteres som betyder ± SD (n = 3); p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 af to-vejs ANOVA. (C) Relative mRNA udtryk for Gata1, Tal1, Lmo2, og c-Myc i untransduced TTF og bulk GTLM-transduced TTF høstet på dag 5 og 8, bestemmes af qPCR. Primere var designet således at endogene udtryk kunne skelnes fra samlede udtryk. Data præsenteres som betyder ± SD (n = 4-6 til iEPs, n = 2 for untransduced TTF). (D) koloni tæller genereret fra forgyldt untransduced TTFs og bulk dag 5 iEPs genereret ved at fordoble forholdet mellem hver af GTLM faktorer. Data præsenteres som betyder ± SD (n = 3); ** p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001 af to-vejs ANOVA. (E) Relative udtryk for Gata1, Tal1, Lmo2, og c-Myc i untransduced fibroblaster og plukkede kolonier genereret fra GTLM-transduced iEPs (rød og ikke-røde), 14,5 dpc føtal lever og voksen knogle marv, bestemmes af microarray. Data præsenteres som betyder ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 af to-vejs ANOVA. (F) Relative udtryk for valgte gener kendt for deres udtryk i erythroid (top), megakaryocyte (midt) og makrofager (nederst) celler i untransduced fibroblaster og plukkede kolonier genereret fra GTLM-transduced iEPs (rød og ikke-røde), 14.5dpc føtal lever og voksen knoglemarv, bestemmes af microarray. Data præsenteres som betyder ± SD; * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,005. p ≤ 0.0005; p ≤ 0,0001 af to-vejs ANOVA. Figur er tilpasset fra Capellera-Garcia S, et al. 10. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : GTLM omprogrammering er en robust og pålidelig proces. (A) grafen for antallet af klynger observeret fra 10.000 TTFs og repræsentative billeder på dag 5 af GTLM omprogrammering af Hale spids fibroblaster (TTF), der har gennemgået tre passager (P3) eller ni passager (P9) forud for omprogrammering. Data præsenteres som betyder ± SD (n = 6); skala barer er 50 µm. (B-D) repræsentative billeder af iEP klynger 6 dage efter (B) GTLM omprogrammering af Hale spids fibroblaster; (C) GTLM omprogrammering af TTFs med tilsætning af p53DN udtryk vektor; (D) GTLM omprogrammering af p53 knockout TTFs (skala barer = 50 µm). (E) repræsentative billeder af iEP klynger efter 10 dage af GTLM omprogrammering udført på normoxic betingelser (skalalinjen = 50 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overekspression af en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er tilstrækkelige til at omprogrammere murine og humane fibroblaster direkte til iEPs10. Omprogrammerede erythroid celler meget lignede Bonafide erythroid progenitorceller morfologi, fænotype, genekspression og kolonidannende evne. Dette resultat bekræfter rationale for at bruge direkte omprogrammering som et redskab til at definere udviklingsmæssige faktorer i bloddannelsen. Til støtte for gyldigheden af denne metode, kan iEPs også genereres ved hjælp af GTLM induktion af musen embryonale fibroblaster og menneskelige forhuden fibroblaster, viser, at det virker for fibroblaster af forskellig oprindelse og på tværs af arter10. I denne betænkning fremkalde vi omprogrammering af fibroblaster fra erythroid afstamning sporingen mus som et værktøj til at visualisere konvertering til en erythroid celle. Brug af denne mus er nyttige, men ikke kritisk til protokollen. Vi rutinemæssigt udføre omprogrammering ved hjælp af flere typer af fibroblast fra forskellige mus stammer og identificere iEPs af celle overflade markør udtryk af Ter119 og CD71.
Vores nuværende metode genererer iEPs, der udviser en primitiv erythroid fænotype i modsætning til en endelig voksen fænotype. Én stor forskel mellem disse faser af udvikling er udtryk for forskellige globin gener. Vi har dog vist at tilsætning af Klf1 og Myb til GTLM cocktail ændringer iEPs' globin udtryk mønster fra overvejende embryonale til fortrinsvis voksne10,14. Interessant, fordomme supplement af Gata2 og Runx1 til de fire-faktor cocktail og thrombopoietin på mellemlang omprogrammering processen mod megakaryocytic afstamning16.
GTLM-induceret iEPs producere erythroid progenitorceller med en primitiv gen expression signatur og en begrænset proliferativ kapacitet. Desuden, iEPs producere meget få kerneløse erytrocytter. Dårlig erythroid stamfader ekspansion skyldes undladelse af at omprogrammere kit + endelige erythroid celler, som potentielt ville kunne opnås med tilsætning af andre faktorer, inducerende direkte omprogrammering til iEPs med en definitiv genekspression program.
Vores data tyder også på fattige enucleation effektivitet er forklares ved, GTLM-induceret iEPs generere prækursorer med en primitiv, snarere end en definitiv gen expression program. Flere forsøg på at optimere dyrkningsbetingelserne blev forsøgt uden forbedret enucleation. Igangværende forsøg på at øge både stamfader spredning og enucleation effektivitet er derfor fokuseret på at identificere mangler faktorer for inducerende omprogrammering til endelige iEPs.
For den optimale produktion af røde iEP kolonier er det afgørende, at cellerne er transduced med alle fire vektorer og GTL gener er udtrykt på et højt niveau. I øjeblikket mest effektive metode tillader desværre ikke forudgående kontrol af vektor titers. Et forsøg på at forbedre effektiviteten ved hjælp af bicistronic lentiviral vektorer var ikke vellykket, muligvis på grund af problemer med ringere støkiometrisk eller utilstrækkelig udtryk niveauer. Mens arbejde er løbende at forbedre omprogrammering vektorer, fremstillet de mest effektive metode stadig bruge kombinationer af frisk vektor supernatanten med de tidligere beskrevne retroviral vektorer udtrykker kun én faktor og ingen udvalg markørgen.
GTLM omprogrammering til iEPs er de eneste rapporterede protokol stand til at producere erythroid stamfader-lignende celler fra en engageret celletal. Som forskning værktøj DLR iEP metode derfor har flere fordele sammenlignet med andre erythroid celle modelsystemer som cellen erythroid linjer HiDEPs/HuDEP celler (PMID: 23533656)17. Mens HiDEPs/HuDEP celler er mere praktisk værktøj for storstilet erytrocyt produktion og evaluering genfunktion under terminal erythropoiesen, er den unikke fordel af GTLM omprogrammering til iEPs evnen til at direkte undersøgelse af kernen transkriptionel programmer bestemmelse erythroid celle skæbne. GTLM omprogrammering giver en uvurderlig platform til at studere begge erythropoiesen i mennesker og mus, for eksempel, for at studere switch mellem primitive og endelige erythropoiesen. Forstå denne parameter er af stor interesse i den potentielle behandling af hemoglobinopathies, såsom seglcelleanæmi, hvor forskere bestræbe sig på at vende kontakten i voksne til føtalt hæmoglobin til at afbøde sygdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter til betænkningen.
Acknowledgments
Vi takke Evelyn Wang og Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) til kloning og Harvey Lodish (Whitehead Institute) for at give mange af de plasmider, bruges til at generere retroviral biblioteket. Vi takke Benny Siva og Sofie Singbrant (Institut for Molekylær medicin og Gene Therapy, Lunds Universitet), Göran Karlsson og Shamit Soneji (Institut for Molekylær hæmatologi, Lunds Universitet) for deres roller i beskrivelse af iEP produktion. Vi vil også gerne anerkende og takke Julian Pulecio (Center for regenerativ medicin, Barcelona biomedicinsk forskning Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent's Institut for medicinalforskning og Institut for medicin, St. Vincent's Hospital, University of Melbourne), Ángel Raya (catalansk Institution for forskning og videregående studier, Barcelona), og Jesper G. Ina (Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology og Harvard, Cambridge ) for deres tidligere bidrag til dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af Ragnar Söderberg Foundation (til J.F.); Svenske forskning Rådet (til J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (til J.F.); den svenske Foundation for strategisk forskning (til J.F.); Åke Wiberg Foundation (til J.F.); Marie Curie integration tilskud (til J.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | Culturing media for PhGP cells |
| DMEM with sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30243.01 | Culturing media for tail tip fibroblasts |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Reprogramming media |
| Fetal Bovine Serum HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Growth factor |
| Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Antiboiotic |
| Non-Essential Amino Acids (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL media is suppplemented with this |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Cell dissociation agent |
| Murine Stem Cell Factor (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Added to reprogramming media |
| Recombinant Murine Il-3 | Peprotech | 213-13 | Added to reprogramming media |
| human recombinant erythropoietin (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Added to reprogramming media |
| Dexamethasone | Sigma | 50-02-2 | Added to reprogramming media |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 9000-70-8 | Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use. |
| Blasticidin S hydrochloride | Sigma | 3/9/3513 | Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Used for washing steps |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection Reagent |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection Reagent for PhGP cell line |
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | Used for filtering virus supernatant |
| BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | SKU: 307736 | Used for filtering virus supernatant |
| 100 mm Culture Dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 6-well plate | Falcon | 10799541 | Cell culture |
| Jeweler Forceps #5 | Sklar | 66-7642 | Used for handling small tail fragments |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar | 23-1149 | Used for cutting the tail into small pieces |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| CD117 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures |
| PheonixGP cells | ATCC | CRL-3215 | retroviral packaging cell line |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | retroviral helper vector containing gag and pol genes |
| pMX-Gata1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Tal1 | Cloned in-lab | ||
| pMX-Lmo2 | Cloned in-lab | ||
| pMX-cMyc | Cloned in-lab | ||
| CellSens Standard 1.6 software | Cytospin analysis software |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).
