המטרה של פרוטוקול זה היא למדוד את זמן העברה של fluorescently עם תוויות מזון דרך המעי של הזחל דג זברה אופנה תפוקה גבוהה.
דג זברה משמשים מודל אלטרנטיבי אורגניזמים לבדיקת בטיחות התרופה. מערכת העיכול (GI) של דג זברה יש קווי דמיון גנטי עצביים, תרופתי לזה של היונקים. סובלנות העיכול במהלך הבדיקה הקלינית של מועמדים סמים נפוצים, עלולה להוות איום רציני לבריאות האדם. בדיקת רעילות GI במודלים בתרבית של פרה יכול להיות יקר במונחים של זמן, מבחן מתחם והתעסוקה. השיטה תפוקה גבוהה המובאת כאן עשוי לשמש כדי לחזות GI בעיות בטיחות. לעומת מודלים בתרבית של, שיטה זו מאפשרת להערכה יתרה של תופעות מורכבות מבחן ב- GI המעבר תוך שימוש כמויות נמוכות של המתחם. בשיטה זו, דג זברה זחל (7 ימים לאחר ההפריה) ניזונים מזון המכיל תווית פלורסנט. לאחר האכלה, כל דג זחל ימוקם טוב של צלחת 96-חרוט-תחתון-ובכן, קיבלה במבחן תרכובת (מומס במים) או הרכב. כפי בטן המעבר מתרחש, פלומות מצטבר בתחתית הבארות, קצב שבה זה קורה מנוטרת על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית מתחתית הבאר שוב ושוב לאורך זמן באמצעות ספקטרופוטומטרים על צלחת. חישוב הממוצע של זריחה של הזחלים בקבוצת הטיפול נתון, ערכים אלה מוצגים בגרף יחד עם שגיאת התקן, עבור כל זמן המדידה, מניב עיקול המייצג מעבר הממוצעת על מזון לאורך זמן. השפעות על הבטן זמן העברה מזוהים על-ידי השוואת האזור מתחת העקומה עבור כל קבוצת הטיפול לזה של הקבוצה שטופלו הרכב. שיטה זו זוהה שינויים בזמן דג זברה GI טרנזיט הנגרם על ידי תרופות עם תופעות ידועות GI קלינית; זה יכול להיות מועסק לחקור עשרות טיפולים עבור GI אפקטים לכל יום. ככזה, תרכובות בטוח יכול להיות במהירות עדיפות בתרבית של בדיקה, אשר מזרזת ביצוע גילוי של proffers לקידום 3Rs.
דג זברה (רזבורה rerio) משמשים מודל בביולוגיה חוליות ולחזות רעילות התרופה ו/או יעילות; יישומים חדשים בתחומים אלה להגיח מדי שנה. היתרונות של דג זברה על מודלים בתרבית של כוללים שלהם פוריות, גודל קטן, השקיפות דרך organogenesis. דג זברה משמשים כדי לחזות סמים המועמד חריפה רעילות, כמו גם כדי להעריך את מתחם השפעה על תפקוד האיבר, למשל, דום לב, עינית, מערכת העיכול (GI)1,2. דג זברה פיתוח ופיזיולוגיה דומים לאלה של יונקים דרכים רבות3 ויש 80% של גנים הקשורים מחלות אנושיות homolog דג זברה4.
GI בדרכי של דג זברה יש פיזיולוגיה דומה בתרבית של GI בדרכי אך יש אדריכלות פשוט5. דג זברה יש לי קיבה לא; הנורה במעי הקדמי משמש מחסן מזון. ביטוי גנים במעי דג זברה יש קווי דמיון רבים את זה של היונק5. כמו של יונקים, מערכת העצבים המעית של דג זברה שולט תנועתיות המעיים, ומראות העצבוב במעיים של בעלי חוליות אחרים,6,7. על סמך הדמיון האלה, הפרעות תפקודי של המעי האדם נחקרו בדג זברה, תוך שימוש בשיטות נגזר מודלים בתרבית של8.
סובלנות העיכול במהלך הבדיקה הקלינית של מועמדים סמים נפוצים, עלולה להוות איום רציני לבריאות האדם. סקירה של תוכניות חברת רוקחות וורט’ינגטון במהלך 2005 – 2010 חשף GI בטיחות כגורם העיקרי 9% של מחקר קליני הפסקות9. בדיקת רעילות GI במודלים בתרבית של פרה יכול להיות יקר מבחינת זמן, תרכובת, ודיני. וזמינותו תפוקה גבוהה חזוי להובלה GI יכול לספק גמישות למתחם רעילות בדיקות ולספק ההשפעה 3Rs. שיטה מציע וזמינותו של כזה מוצג על-ידי הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך. יכול להיות מועסק assay תפוקה גבוהה זו בתחילת פיתוח תרופות עדיפות למועמדים, ולתרום ההפחתה של בטיחות GI בדיקות מינים גדולים יותר.
ספקטרופוטומטר הרומן שיטה למדידת דג זברה הזחלים GI מעבר הזמן, המובאים כאן, הוא יעיל assay שיכולים לחזות השפעות הטיפול על יונקים GI-פונקציה. למרות וזמינותו יש רגישות נמוכה, יש predictivity חיובי גבוה, שקביל עבור מבחני מהשכבה הראשונה מועסק קיצוץ למטה מספר הטיפולים המועמד בהתבסס על רעילות12. שיטה זו קלה יותר לביצוע, יש תפוקה גבוהה יותר, והוא משתמש לטיפול שלבים מאשר מיקרוסקופ פלואורסצנטי פחות בבעלי חיים.
ישנם אתגרים טכניים הטמון בשיטה זו. לתפוס הזחלים בודדים לאחר האכלה האוכל פלורסנט, להעביר אותם לתוך בארות בודדים הוא מאתגר בהתחלה. עם זאת, עם תרגול, טכנאי מיומן יכול למלא צלחת 96-ובכן פחות מ 15 דקות. אם, בנקודת זמן נתון, הצלחת בטעות מזועזעת החומר הצואתי בחומרה מתחתית הבארות לפני הקריאה, ההצטברות יופיע כדי להקטין. זה יכול להימנע על ידי הזזת את plate(s) בקפידה, מבלי לרעוד. מניסיוננו, תנועה רגילה, כולל זו של מגירה ספקטרופוטומטרים צלחת ממונעת, לא הפריעה וזמינותו. צלחת הקוראים מאובזר עם תנור (קרי, הצלחת אין לשוב חממה בין המדידות), הממוקם ליד וזמינותו מעבדה ספסל יכול למטב להזדמנות התחתון של הפרעה, אבל זה לא היה הכרחי בחוויה שלנו.
הנסיונות השיטה לא כללו ניזון בימים שלפני וזמינותו. בלי אלה בפטריה ‘בפועל’, מספרים נמוכים של הזחלים לצרוך מספיק אוכל פלורסנט במהלך המועד מותר לפני יישום הטיפול. בניסיונות האלה, וריאציה בתוך קבוצות הטיפול היה גדול יותר, יותר נתונים היה שמיש עקב הצטברות אות נמוך/לא לאורך זמן. אפילו עם תרגול האכלה, הזחלים קצת לא צורכים כמויות מספיקות של האוכל פלורסנט, לא כולל נתונים הזחלים מקטין וריאציה בתוך קבוצות ומגביר את היכולת לזהות השפעות הטיפול. החל גודל הקבוצות גדול יותר (קרי, 24 לעומת 12) מאפשר מספר מספיק של הזחלים תורם נתונים שימושיים לניתוח.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה כי מעבר המזון היה כמעט מוחלטת על ידי 24 שעות ביממה בהזחלים שטופלו אטרופין (לא מוצג), אולם הנתונים microplate מנקודת הזמן האחרון לשקף התחתון האות האחרונה בקבוצה אטרופין, בהשוואה לקבוצת הרכב. לעומת זאת, זריחה microplate הסופי גבוה יותר היה קשור טיפולים מואצת זמן העברה, אף-על-פי הזחלים שטופלו הרכב יש ככל הנראה בוטל הגליקמי שלהם לפני נקודת בפעם האחרונה. בהתבסס על ההקצאה אקראית לטיפול של הזחלים ניזונים מזון פלורסנט, אנו מניחים הצריכה המקבילה של האוכל פלורסנט, בממוצע, בין קבוצות הטיפול. נתון זה, ובהתבסס על הדפוסים המתוארים לעיל, פלורסצנטיות מן החומר צואה יורדת עם הזמן המושקע של הזחל GI בדרכי או מעבר מהיר מוסיף פלורסצנטיות הצואה איכשהו. הגורם האמיתי אינו ידוע, לא נחקר, אולם עדיין וזמינותו הוא מסוגל מדידה והשוואה בין זמן העברה בין קבוצות.
העבודה של שיטה זו של איתור ההשפעות הרעילות GI של מולקולה קטנה תרכובות הוא יישום אחד. יישומים אפשריים אחרים כוללים מידול המחלה (למשל, תסמונת המעי הרגיז), טיפול הרומן גילוי מחלות כגון, או לגילוי תרכובות pro-קינטי. יתר על כן, יחד עם מודלים מהונדס, שיטה זו יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של גנים טרנזיט GI נורמלי, כמו גם המעבר הפרעות, כולל נוירון המעית לקוי. הזחל דג זברה מציעה פלטפורמה מהאורגניזם בקנה מידה זה קירוב של התא culturing, אך מאחר שישנן מספר רקמות, סוגי תאים רבים תפקודה יחד דג זברה, מערכות בביולוגיה שאלות ותשובות וענה בעזרת זה מודל.
עם התקדמות הטכנולוגיה, יישומים חדשים הימנו, יעילות התנהלות של בדיקות רעילות דג זברה ימשיך לשפר. דג זברה זחל שיטות טיפול מבחני ממשיכים לשפר במונחים של תפוקה גבוהה יותר13,14. השיטה הרומן המובאת כאן היא דוגמה אחת של שיפור שעשוי להפוך דג זברה לימודי טוב יותר.
The authors have nothing to disclose.
סיימון Cassar של carpetbones.com עיצבת ויצרת דמות אנימציה מבהירים ההליך בהחיים של GI טרנזיט וזמינותו.
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |