Aqui, apresentamos um protocolo para congelar e secção de tecido cerebral de vários animais como uma alternativa economiza tempo de processamento único cérebro. Isto reduz a variabilidade de coloração durante a imuno-histoquímica e reduz o tempo cryosectioning e imagens.
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Artigo de método
Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores
Neste artigo
Resumo
Resumo
Histologia e imunohistoquímica são métodos de rotina de análise para visualizar a anatomia microscópica e localizar as proteínas dentro de tecidos biológicos. Em neurociência, bem como uma infinidade de outros campos científicos, estas técnicas são utilizadas. Imuno-histoquímica pode ser feito em tecido de slide montado ou seções flutuantes. Preparação de amostras de slides montados é um processo intensivo. O seguinte protocolo para uma técnica, chamada de Megabrain, reduziu o tempo levado para cryosection e montagem de tecido cerebral em até 90% combinando vários cérebros em um único bloco congelado. Além disso, esta técnica reduzida variabilidade vista entre rodadas, em um grande estudo histoquímico de coloração. A técnica atual foi otimizada para o uso de tecido cerebral de roedores em análises imuno-histoquímica a jusante; no entanto, pode ser aplicado a diferentes áreas científicas que usam cryosectioning.
Introdução
Aqui, apresentamos o protocolo para um método novo, que chamamos de Megabrain, desenvolvido para cryosection vários roedores cérebros simultaneamente para procedimentos de imuno-histoquímica a jusante. Um Megabrain permite a produção de slides único contendo tecido de vários animais. Esta técnica foi otimizada para corte coronais seções de 9 hemisférios do rato adulto, ou 5 cérebros completo adultos, simultaneamente. Portanto, a técnica é mais aplicável em estudos imuno-histoquímicos grandes ou outras análises feitos no tecido cerebral slide-montado de uma grande coorte de animais.
Imuno-histoquímica envolve o uso de anticorpos específicos ....
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Protocolo
A técnica de Megabrain foi otimizada usando o cérebro todo e hemisected de C57Bl6 ratos adultos machos5, ratos Sprague-Dawley jovens e adultos ratos Sprague Dawley que foram perfundido com solução salina tamponada fosfato (PBS) seguida de 1x de transcardially por de paraformaldeído 4%6. Resultados semelhantes podem ser realizados em outras cepas de camundongo e rato, em ambos os sexos e de diferentes faixas etárias. O estudo para gerar dados para este manuscrito usado juvenis ratos Sprague-Dawley e foi aprovado pelo Comitê de uso e cuidados com animais institucional Universidade do Arizona, e os animais experimentais for....
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Resultados
Um resultado final positivo para este procedimento é um tecido que se encontra no slide, sem bolhas ou lágrimas, na orientação em que estavam congelados. Seções do tecido são espaçadas separados e facilmente identificável devido a boa colocação do cérebro na OCT e boa notação como demonstrado na Figura 1. Supondo que o tecido cerebral foi coletado de animais de idade semelhante, e que o tecido foi devidamente alinhado na OCT, seções coletadas em um slide deve.......
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Discussão
É preciso considerar durante este procedimento que a temperatura da Megabrain e seus arredores deve ser constantemente monitorada para evitar descongelar e recongelar do tecido. O cérebro só pode ser removido do congelador-20 ° C acima de 3 vezes como cada vez é tocado e esquerda no criostato, com uma temperatura mais quente flutuante, o tecido derrete e refreezes, causando uma geleia como textura e tecido anormal integridade10. Portanto, é ideal para cortar o Megabrain tudo de uma vez.
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Divulgações
Os autores têm sem divulgações.
Agradecimentos
Fundos de apoio de missão de PCH com suporte a pesquisa relatada neste manuscrito. Os autores gostaria de agradecer Daniel Griffiths as imagens usadas nas figuras.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Composto CRYO-OCT da Andwin scientific tissue-tek (caixa de 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Moldes de Embutir Descartáveis | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Pinça/Fórceps de Ponta Forte Reta de Alta Precisão Fisherbrand | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Frascos de Cintilação HDPE de 20 mL da Fisherbrand com Tampa de polipropileno | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sacarose, garrafa de polietileno 2,5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | As concentrações de sacarose de 15% e 30% precisam ser compensadas. |
| 2-Metilbutano (Certificado), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Copos de Forma Alta | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Termômetros de Imersão Parcial de Uso Geral em Vidro Fisherbrand (-50 a +50 ° C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Marca Fisher Espátula Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Lâmina de Barbear | Grainger | 4A807 | |
| Lâminas de micrótomo Edge-Rite | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| (1" frost) - branco | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Diluir para 1X antes de usar |
| 15 peças de pincéis de pintura fina | Amazon | B079J12ZRV | |
| caneta PAP | abcam | ab2601 | |
| Chuck Mostrado na Figura 4 foi feito sob medida por um técnico de laboratório, no entanto, tamanhos semelhantes estão disponíveis para encomenda de outras empresas comercialmente. | Ciências de Microscopia Eletrônica | EMS065 |
Referências
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P.
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Reimpressões e permissões
