小鼠肾上腺的分离、固定与免疫荧光成像

摘要

本文介绍一种从小鼠中分离肾上腺组织、固定组织、切片并进行免疫荧光染色的方法。

摘要

免疫荧光是一种利用荧光素标记抗体检测组织中抗原的成熟技术，具有广泛的应用范围。抗原的检测可用于多种细胞类型的表征与鉴定。肾上腺位于肾脏上方，外包一层间充质细胞，是一种内分泌器官，由两种具有不同胚胎起源的组织构成：外层皮质起源于中肾的中胚层，内层髓质则起源于神经嵴。肾上腺皮质分泌类固醇激素（即， 盐皮质激素、糖皮质激素、性激素），而肾上腺髓质则产生儿茶酚胺（即， 肾上腺素，去甲肾上腺素）。在进行肾上腺研究时，能够区分具有不同功能的特异性细胞至关重要。本文提供了本实验室开发的一种实验方案，描述了一系列用于获得免疫荧光染色以鉴定肾上腺细胞类型的连续操作步骤。我们首先聚焦于小鼠肾上腺的解剖，显微镜下剔除肾周脂肪组织，随后进行组织固定、处理及石蜡包埋。接着介绍使用旋转式切片机对组织块进行切片。最后，我们详细阐述了本实验室建立的肾上腺组织免疫荧光染色方案，旨在最大限度减少非特异性抗体结合和自发荧光，以获得最佳信号。

引言

免疫组织化学是一种利用针对细胞内特定分子的抗体，并结合后续染色技术来检测组织成分的方法¹。该免疫组织化学实验流程需要对组织进行特定的固定和处理，这些条件通常根据所使用的特定抗原、组织类型和抗体通过经验确定²。固定对于保持组织的"原始"状态至关重要，从而确保细胞和亚细胞结构以及表达模式的完整性。此外，还需进行进一步的处理和包埋操作，以制备可用于免疫组织化学等组织学研究的薄切片。

免疫染色可采用显色或荧光检测方法。显色检测需要利用酶将可溶性底物转化为不溶性的有色产物。虽然该酶可直接与识别抗原的一抗相连，但更常见的是将其连接至识别一抗的二抗上即，二抗）。该技术灵敏度高，酶促反应产生的有色产物具有光稳定性，成像仅需使用明场显微镜即可。然而，当需要同时观察两种共定位蛋白时，显色免疫染色可能并不适用，因为一种颜色的沉积可能会掩盖另一种颜色的沉积。在此类共染色情况下，免疫荧光技术已被证明更具优势。免疫荧光技术的诞生归功于 Albert Coons 及其同事，他们开发出一种利用荧光素标记抗体识别组织抗原的系统，并可在紫外光下观察切片组织中的荧光信号。³荧光检测基于与荧光染料偶联的抗体，该抗体在激发后会发射光信号。由于存在多种在不同波长处发射光信号（无或仅有少量重叠）的荧光染料，该检测方法非常适合用于多种蛋白质的研究。....

方案

所有方法均按照密歇根大学动物使用与护理委员会批准的机构规程进行。

1. 手术准备

1. 手术前一天，配制4%多聚甲醛（PFA）/磷酸盐缓冲液（PBS）。若使用冷冻分装样品，需提前解冻一份，并于4 °C保存。
   注意：4% PFA的稳定性不超过48小时。
   警告：PFA具有毒性，避免接触皮肤和眼睛，并应弃置于适当的废液容器中。
2. 手术当天，使用70%乙醇（EtOH）对剪刀和镊子等手术器械进行消毒，并将其置于纸巾上晾干。
3. 将装有1×PBS（每孔1 mL即可）的24孔板放入冰桶中。
   注意：肾上腺组织在手术后将保存于该多孔培养板中。

2. 肾上腺解剖分离

1. 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的标准方案对小鼠实施安乐死。需采用第二种辅助安乐死方法以确认动物死亡（例如断头）。
   1. 若采用异氟烷过量法进行安乐死，将小鼠置于充满异氟烷蒸气的密闭舱内，直至呼吸停止，随后将小鼠移出密闭舱，平放在操作台面上并实施颈椎脱位。
      注意：大多数安乐死方法会引起动物应激反应，因此不适用于应激相关研究，因为这些方法可能引入垂体-肾上腺轴激活和髓质儿茶酚胺释放等混杂变量。在此类研究中，建议采用断头法。
2. 将小鼠仰卧放置，用70%乙醇对腹....

结果

图1 展示了上述完整实验方案的示意图。从小鼠中取出肾上腺，于解剖显微镜下去除周围的脂肪组织，随后将肾上腺在4%多聚甲醛（PFA）中固定。此步骤完成后，对肾上腺进行处理并包埋于石蜡中，再用切片机将组织切成薄片，并转移至显微镜载玻片上。切片干燥后，进行免疫荧光染色，随后在显微镜下成像。

去除周围的脂肪组织（图2A）对于后续肾上腺的处理和切片至关重要。成功去除周围脂肪组织的示例如图2B所示，此时肾上腺清晰可辨，无多余脂肪残留。然而，在此步骤中必须注意避免肾上腺干燥，否则可能破坏组织结构。当肾上腺出现皱缩外观时，表明已发生干燥（图2C

讨论

本方案描述了一种分离小鼠肾上腺的方法，以及对切片并包埋于石蜡中的小鼠肾上腺进行制备和染色的步骤。

与其他我们测试过的方案相比，该免疫荧光方案已证明适用于本实验室使用的大多数抗体。然而，在某些情况下，可能需要进行一些调整以改善染色效果。其中一个易于修改和测试的变量是固定时间。在本实验室中，4%多聚甲醛的孵育时间可在1小时至4小时之间变化，而其他实验室的固定时间可延长至12–24小时¹⁶。但在我们的实践中，较长的固定时间会导致背景噪音增加，对本研究中常规使用的多种抗体并不理想。

抗原修复的pH值也可能影响染色的成功。热诱导表位修复（HIER）可使用市售的从酸性到碱性不同pH值的溶液进行，也可使用实验室自制的缓冲液，如柠檬酸盐缓冲液（pH 6）、乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8）、Tris-EDTA（pH 9）、Tris（pH 10）。酶消化处理也可作为抗原暴露的一种选择。将脱蜡切片与含有适当浓度酶（例如蛋白酶K）的溶液孵育一定时间，可作为HIER的替代方法。然而，必须对酶的浓度进行滴.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔细胞培养板	Nest Biotechnology Co.	0412B
一次性针头 25G × 5/8"	Exel International	26403
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich	P6148
Paraplast plus	McCormik scientific	39502004	用于组织包埋的石蜡
Shandon 带盖活检盒 II	Thermo scientific	1001097	用于组织处理的包埋盒
高剖面切片机刀片	Accu-Edge	4685	一次性不锈钢刀片
Peel-a-way 一次性塑料组织包埋模具	Polysciences Inc.	18986	截断式，顶部22 mm正方形，底部锥形至12 mm
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-15	75 mm × 25 mm × 1 mm
二甲苯	Fisher Chemical	X5P1GAL
200 proof 乙醇	Decon Labs, Inc.
Certi-Pad 纱布垫	Certified Safety Mfg, Inc	231-210	3" × 3，无菌无乳胶纱布垫
M.O.M 试剂盒	Vector laboratories	BMK-2202	用于检测小鼠组织上的小鼠一抗
KimWipes	Kimtech	34155	擦拭纸 4.4 英寸 × 8.4 英寸
Super PAP PEN	Invitrogen	00-8899	用于在载玻片上划界的笔
显微镜盖玻片	Fisherbrand	12-544-D	尺寸：22 × 50 × 1.5
DAPI	Sigma	D9542	（配制成20 mg/mL储备液）
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Molecular Probes	P36930	免疫荧光封片剂
X-cite series 120Q	Lumen Dynamics		光源
Coolsnap Myo	Photometrics		相机
Optiphot-2	Nikon		显微镜
切片机	American Optical
组织包埋仪	Leica	EG1150 H
组织脱水机	Leica	ASP300S
正常山羊血清	Sigma	G9023
小鼠抗TH抗体	Millipore	MAB318	一抗
兔抗SF1抗体	Ab proteintech group (PTGlabs)	custom made	一抗
Alexa-488 标记的山羊抗小鼠IgG	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	二抗
Dylight-549 标记的山羊抗兔IgG	Jackson ImmunoResearch	111-505-003	二抗
无水柠檬酸	Fisher Chemical	A940-500
NIS-Elements Basic Research	Nikon		成像软件