Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’étiquetage des murins in vivo des protéines de surface de cellules glomérulaire avec de la biotine. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène de la protéine d’intérêt.
Abstract
Protéinurie résulte de la rupture du filtre glomérulaire qui est composé de l’endothélium fenêtrée, membrane basale glomérulaire et podocytes avec leurs membranes de fente. La structure délicate du filtre glomérulaire, en particulier le diaphragme de fente, s’appuie sur l’interaction entre les protéines de surface de diverses cellules. Étudier ces protéines de surface de cellules a été jusqu'à présent limitée à des études in vitro ou l’analyse histologique. Nous présentons ici une biotinylation murine en vivo étiquetage méthode, ce qui permet l’étude des protéines de surface de cellules glomérulaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène d’une protéine d’intérêt. La détermination semi-quantitative de l’abondance de surface cellulaire glomérulaire est disponible avec cette nouvelle méthode et toutes les protéines accessibles à la perfusion de biotine et immunoprécipitation peut être étudiée. En outre, isolement des glomérules avec ou sans biotinylation permet davantage l’analyse de RNA glomérulaire et protéines, mais aussi la culture primaire de cellules glomérulaire (c.-à-d., culture de cellules primaires podocyte).
Introduction
Une protéinurie est une caractéristique des lésions glomérulaires et accompagne habituellement les perturbations du filtre glomérulaire1. Le filtre glomérulaire est composé de l’endothélium fenêtrée et membrane basale glomérulaire podocytes. La délicate structure moléculaire du filtre glomérulaire est très dynamique et soumise à la protéine de surface cellulaire traite les deux reins sains et malades,2,3,4,5,6 . Endocytose des protéines de surface cellulaire s’est avéré essentiel pour la survie des podocytes7. Néphrine et podocalyxin sont des protéines transmembranaires exprimées sur les podocytes. Néphrine est l’épine dorsale de la membrane glomérulaire fente, tandis que podocalyxin est une sialoglycoprotéine revêtements le pied secondaire des podocytes8,9,10. Trafic d’endocytose a déjà démontré pour néphrine et podocalyxin3,11,12,13,14.
Au meilleur de nos connaissances, l’endocytose des protéines de surface cellulaire n’a pas encore été décrite dans les cellules endothéliales glomérulaires dans la littérature. Cependant, les cellules endothéliales expriment en général toutes les protéines nécessaires pour les différents types d’endocytose (c.-à-d. l’endocytose clathrine dépendant, dépendante du radeau)15,16. Donc, le trafic de surface de cellules endothéliales peut être étudié avec cette méthode en utilisant, par exemple, vasculaire endothéliale (VE)-cadhérine et la molécule d’adhérence intracellulaire (ICAM-2) comme une cellule de surface protéine marqueur pour les cellules endothéliales glomérulaire17 .
Malheureusement, il n’y a aucun modèle précis in vitro pour le filtre glomérulaire trois couches délicat dans quelle cellule traite de la protéine de surface peut être étudiée. L’objectif de cette méthode est donc d’étudier protéine glomérulaire traite en vivo. En outre, ce protocole contient des informations sur la façon d’isoler les glomérules, permettant ainsi des analyses glomérulaire ARN, protéines ou cellules plus loin. Un isolement glomérulaire similaire techniques ont été décrites par différents groupes18,19.
Auparavant, nous et autres avons utilisé ex vivo marquage des protéines de surface de cellules glomérulaire par biotinylation2,3,4,20,21. Toutefois, cette méthode ex vivo , glomérules isolés ont été exposés à des contraintes mécaniques, qui peuvent influer sur le trafic endocytose. Alternativement, l’immunofluorescence marquage des protéines de surface de cellules glomérulaires a largement été utilisé dans la littérature2,20,22. Avec cette méthode, toutefois, seul un petit nombre de protéines peut être analysé dans une diapositive et analyse quantitative d’images d’immunofluorescence est souvent difficile.
Cette méthode novatrice en vivo propose un outil fiable pour étudier les cellules glomérulaires protéine de surface abondance et traite avec précision en sains et malades reins, et il peut être utilisé comme un ajout aux tests d’immunofluorescence.
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Protocol
Souris ont été obtenues comme une race interne de l’établissement de soins animaux locaux ou des laboratoires de Janvier en France. Les enquêtes ont été menées conformément aux lignes directrices énoncées dans le Guide pour soins et Use of Laboratory Animals (US National instituts de santé Publication n ° 85-23, révisée en 1996). Toutes les expériences animales ont été effectuées selon les autorisations institutionnelles pertinentes (gouvernement de l’état LANUV AZ:84 numéro de référence-02.04. 2016.A435).
1. préparation des Instruments, des Solutions et équipements
- Préparer 1 L de solution saline tamponnée au phosphate, additionnée de 1 mM chlorure de magnésium (MgCl2) et le chlorure de calcium (CaCl2) 0,1 mM (PBSCM) et la filtrer à travers un filtre stérile.
- Préparer 5 mL de PBSCM stérile par souris pour perfusion et placez-le sur la glace.
- Pour chaque souris, préparer 5 mL de PBSCM stérile additionné de biotine de 0,5 mg/mL.
- Pour chaque souris, préparer les 5 mL de PBSCM stérile et ajouter 0. 8 x 108 billes magnétiques (e.g., 200 µL d’une solution de perles/mL8 4 x 10, sans prétraitement) pour embolisation des glomérules. Préparer cette solution sous le banc de culture cellulaire pour garder les billes magnétiques dans l’original un tube stérile. Placez cette solution sur la glace.
- Préparer une solution de refroidissement en ajoutant glycine 100 mM à PBSCM (5 mL / souris) et le maintenir sur la glace.
- Préparer une solution de collagénase (0.378 U/mL collagénase A en PBSCM stérile). Par souris, pipetter, dans un tube de 2 mL, 1 mL de la solution de collagénase et placez-le sur la glace.
- Pour laver, préparer PBSCM stérile (voir étape 1.1) dans 50 mL de tube et placez-le sur la glace.
- Une perfusion, utiliser une seringue avec un débit de 2,0 mL/mn.
- Préparez une seringue de 10 mL avec une aiguille de 21G. Placez la pointe de l’aiguille dans un cathéter long de 20 à 30 cm (diamètre intérieur, ID = 0,58 mm). Raccorder le cathéter (ID 0,58 mm) avec un cathéter court de 10 cm (ID 0. 28 mm) et couper l’extrémité du cathéter plus petit oblique pour une insertion facile dans l’aorte de souris.
- Pour les procédures de ligature pendant la chirurgie, couper les trois fils de soie de 5-7 cm (4-0, 6-0) par souris.
- Pour la chirurgie, préparer 3 pinces chirurgicales, 2 ciseaux chirurgicaux, 2 pinces, 2 pinces fines, 1 ciseaux fine et écouvillons. Préparer l’anesthésie (p. ex., anesthésie intrapéritonéale kétamine 100 mg/kg de poids corporel et de xylazine 5 mg/kg de poids corporel).
- Pour l’isolation des glomérules des deux reins, utiliser une passoire de cellule de 100 µm, deux tubes de 50 ml et un receveur de l’aimant.
- Préparer les CHAPS tampon de lyse : 20 mM (3-[(3-cholamidopropyl)) diméthylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) ; 20 mM Tris (hydroxyméthyl)-aminomethan (Tris) pH 7,5 ; 50 mM sodiumchorlide (NaCl) ; 50 mM sodiumfluoride (NaF) ; 15 mM Na4P2O7; pH de 0,1 mM Tétraacétique (EDTA) l’acide 8.0 ; sodiumorthovanadate 2 mM ; et 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
- Cool centrifugeuses à 4 ° C.
2. chirurgie sous le Microscope
- Anesthésier la souris (par exemple, avec la kétamine/xylazine par voie intrapéritonéale, reportez-vous à l’étape 1.11). Effectuez le test d’orteil-pincée pour confirmer une anesthésie appropriée.
- Désinfecter la partie ventrale de la souris avec de l’isopropanol 70 %.
- Effectuer une coupe médiane à travers la peau du bassin au sternum et retirez la peau de l’aponévrose abdominale à l’aide de la pince à épiler. Couper la peau des deux côtés dans le milieu de l’abdomen avec des ciseaux chirurgicaux.
- Changer les outils chirurgicaux. Appliquer une coupe médiane de xiphoid à la vessie à travers la couche de muscles abdominaux et les diviser en quatre quadrants à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux. Fixer le côté supérieur de deux pinces vers le cou de la souris avec deux pinces chirurgicales.
Remarque : L’abdomen est maintenant ouvert. - Mettre les organes viscéraux côté avec un écouvillon stérile et couper le ligament hépatique-phrénique avec des ciseaux.
- Préparer une ligature (avec un fil en soie 4-0, 6-0) autour de l’aorte proximale de l’artère rénale sur la hauteur de la glande surrénale avec deux pinces fines. Serrer la ligature aorte proximale pour l’abolition de la circulation sanguine avec des pincettes.
- Libérer l’aorte distale du fascia, matières grasses et d’autres tissus et préparer une ligature autour de l’artère hépatique/mésentérique crâniale de l’artère rénale à l’aide de fines pinces chirurgicales.
- Préparer une ligature (avec un fil en soie 4-0, 6-0) autour de l’aorte distale de l’artère rénale et la veine cave supérieure et l’aorte de serrage à la hauteur de la bifurcation.
- Couper un petit trou dans l’aorte distale de l’artère rénale afin que le trou soit la moitié du diamètre de l’aorte. Mettre le cathéter dans l’aorte et le fixer avec la ligature préparée.
Attention : Évitez les bulles dans le système de perfusion pour éviter une embolie. - Commencer la perfusion avec le PBSCM glacée à un débit de 2 mL/min.
- Découper un trou dans la veine rénale au niveau de l’artère rénale avec des ciseaux chirurgicaux, puis serrez la ligature autour des artères mésentériques et hépatiques.
Remarque : Les reins devraient tourner pâles après le début de la perfusion.
3. in Vivo Biotinylation
- Changement la seringue bulles de PBSCM glacé additionné de biotine de 0,5 mg/mL pour la surface étiquetage et perfuse les reins avec 5 mL à un débit de 2 mL/min.
NOTE : Mélanger les solutions PBSCM (p. ex., en tournant les tubes de 50 mL) doucement pour éviter la formation de bulles dans la solution. Après l’aspiration de la solution dans la seringue, évacuer les bulles ou l’air de la seringue. Utiliser une canule supplémentaire (21G) sur la seringue pour remplir l’espace dans la canule qui est connectée au système de cathéter. Enfin, tenir la seringue dans la canule avec le cathéter sans bulles. - Remplacez la seringue sans bulles PBSCM glacé additionné de glycine 100 mM à étancher les glomérules et perfuse avec 5 mL à un débit de 2 mL/min.
- Changer la seringue bulles de PBSCM glacé additionné de 200 μL perles magnétiques/mL et perfuse les reins à 2 mL/min.
Remarque : Sur la surface du rein, embolisation des glomérules avec perles magnétiques brunes seront visible.
4. isolement des glomérules de deux reins
- Enlever les reins à l’hile et la capsule. Placez les reins sur glace dans 15 mL de PBSCM dans une boîte de Petri de cellulaire de 10 cm. Euthanasier la souris avec dislocation cervicale sous anesthésie après la récolte les reins. Les procédures de chirurgie et de la perfusion durent environ 20-22 min.
- Dépecée reins le plus petit possible avec une nouvelle lame à double tranchant. Déplacer le tissu dans un tube de 2 mL avec 1 mL de collagénase A (voir l’étape 1.6) et faire digérer à 37 ° C pendant 30 min. Avant et après la digestion, mélanger doucement avec une 1000 μL couper la pipette.
- Rincer les tissus digérés à travers un tamis de cellule 100 μm à l’aide de PBSCM glacée. Utilisez le grattoir de cellules pour l’émincer la fosse de tissu restant la crépine de la cellule et le rincer à glacée PBSCM par la suite pour un volume total de 50 mL.
- Centrifuger la suspension à 4 ° C x 500 g pour 5 min. Retirez le surnageant et resuspendre le culot avec un peu moins de 1,5 mL de PBSCM glacée tout en vortex le culot. Ensuite, mettre la suspension glomérulaire dans un nouveau tube de 2 mL.
5. lavage
- Le récupérateur de l’aimant permet de tirer les glomérules de côté. Attendre 1 min avant que les glomérules ont déménagé vers l’aimant.
- Retirez le surnageant avec une pipette de 1000 μL tandis que le tube 2 mL reste dans le bac à aimant. Pendant le lavage de première et deuxième étapes (voir l’étape 5.3), 250 μL de surnageant reste dans le tube pour éviter la perte des glomérules. Effectuez cette procédure rapidement afin d’éviter de laisser les structures tubulaires à couler au fond du tube.
Remarque : La procédure de nettoyage dureront plus longtemps dans le cas contraire. - Retirer le tube 2 mL de catcher aimant et ajouter 1 mL de PBSCM, pipette de haut en bas (très important), puis vortexer.
- Remettre le tube dans le bac à aimant et recommencer à 5.2.
- Répétez les étapes de lavage jusqu'à ce que la pureté des glomérules a atteint 90 %. Pour ce faire, examinez une aliquote représentative du surnageant sous un microscope (X 40-100).
NOTE : Glomérules apparaîtra en tant que structures rondes contenant des billes magnétiques bruns. Structures allongées sont des fragments tubulaires et billes magnétiques libres apparaissent comme des points ronds bruns. Débris cellulaires peuvent apparaître comme des structures volumineuses. - Si la pureté est atteinte, estimer le nombre de glomérules en dissolvant les glomérules dans 1 mL de PBSCM. Après avoir mélangé, prélever une partie aliquote de 10 μL et compter les glomérules sous le microscope. Calculer le nombre de glomérules avec l’équation suivante : finale nombre de glomérules = nombre de glomérules dans 10 μL aliquot x 100.
- Réussite de l’isolement des glomérules conduit à une gamme de 10 000-40 000 glomérules.
6. protein Extraction et immunoprécipitation (IP)
- Glomérules virés par centrifugation à 4 ° C à 6800 g pendant 5 min. Retirez le surnageant tout en utilisant un capteur aimant et resuspendre le culot dans le tampon de lyse glacee (e.g., 30 000 glomérules dans 300 μl ; CHAPS, voir étape 1.11). Homogénéiser les échantillons avec un homogénéisateur de tissus à haute vitesse pendant 30 s et leur lyse sur glace pendant 30 min.
- Enlever la matière insoluble par centrifugation à 15 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. Pipeter le surnageant qui contient la cellule lysate dans un nouveau tube de 1,5 mL. Jeter le culot.
- Mesurer la concentration des protéines du liquide surnageant à l’aide d’un bicinchoninic (BCA)-base de méthode suivant les instructions du fabricant. Une lyse réussie des 30 000 glomérules cède à une quantité de protéine glomérulaire de 700-1000 µg/mL. S’adapter à des quantités égales de protéines avec tampon de lyse.
- Prélever une partie aliquote de 10 % du volume total pour glomérulaire lysat et ajouter 2 x Laemmli + dithiothreithol (TNT) avant l’incubation pendant 5 min à 95 ° C.
- Pour la période d’enquête, incuber le reste du lysat de streptavidine agarose perles durant la nuit à 4 ° C dans un agitateur généraux.
- Centrifuger l’agarose perles à 1000 x g pendant 3 min à 4 ° C, retirez le surnageant et ajouter 800 μL de tampon de lyse pour laver les perles pour la liaison aux protéines non spécifiques.
- Répéter le lavage 3 fois et éliminer le surnageant complètement.
- Ajouter 30 μL de 2 x Laemmli + TNT et incuber à 95 ° C pendant 5 min.
- Charger le lysat et sondes IP sur une SDD 10 % gel et exécutent le gel SDS à 70 V pendant 30 min, puis à 20 mA par gel pour 1,5 h. blot par la suite, le gel pendant 2 h à 200 mA sur une membrane de nitrocellulose.
- Bloquer la membrane de nitrocellulose, une nuit à 4 ° C, avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans le tampon de lavage.
- Incuber la membrane avec l’anticorps d’intérêt durant la nuit à 4 ° C. Laver avec tampon 3 fois pendant 5 min sur un agitateur de lavage et incuber la membrane avec l’anticorps secondaire HRP-le tag pendant 1 h à température ambiante. Répétez l’étape de lavage.
- Visualiser le lysat et immunoprécipitation des sondes sur la membrane au moyen d’un agent de chimiluminescence super-résolution avec une caméra CCD.
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Representative Results
Pour isoler des glomérules avec précision, il est nécessaire de perfuse reins murins avec PBSCM tout d’abord. Une perfusion de PBSCM tourne reins pâles (Figure 1A). Embolisation des glomérules avec billes magnétiques seront visible comme des points bruns sur la surface du rein (Figure 1B). Isolement des glomérules avec le récupérateur de l’aimant peut montrer la contamination avec des tubuli rénale (Figure 1C). Avant une analyse plus approfondie des glomérules, une pureté de > 95 % des glomérules doit se faire en lavant les glomérules plus complètement (Figure 1D).
In vivo biotinylation repose sur la capacité d’étiqueter cellulaire des protéines de surface avec de la biotine. Pour ce faire, les reins murins sont perfusés avec PBSCM ou non-cellule-membrane perméable biotine. Comme illustré à la Figure 2, biotine étiquettes les boucles capillaires en biotine et sous perfusion, mais pas dans les reins de souris de contrôle. Afin d’étudier les protéines de surface de cellules glomérulaires étiquetés par perfusion de biotine en vivo , immunoprécipitation de la fraction de biotine d’extraits glomérulaires est effectuée. Figure 3 A démontre que les protéines transmembranaires glomérulaire néphrine et podocalyxin sont immunoprécipitée au sein de la fraction de la biotine. Cependant, chez les souris témoins, aucun néphrine ou podocalyxin n’est détecté dans la fraction d’immunoprécipitée des protéines biotinylées. Comme témoin négatif, la protéine intracellulaire extracellulaire-signal réglementés kinases p42 et p44 (ERK) ne se trouvent pas dans la fraction d’immunoprécipitée des protéines biotinylées des contrôles et reins perfusés biotine souris. Pour confirmer que la néphrine de protéine de surface cellulaire est effectivement biotinylé par cette méthode, néphrine est précipitée de contrôle et les reins de souris de biotine et sous perfusion. Pour visualiser la biotine, la fraction immunoprécipitée est tachée de streptavidine. Figure 3 B montre biotinylé néphrine en biotine et sous perfusion, mais pas les animaux témoins. Lysats contrôles indiquent des quantités égales de protéines dans les animaux témoins et biotine et sous perfusion. Protéine endothéliale vasculaire endothéliale (VE)-cadhérine est immunoprécipitée au sein de la fraction de la biotine, comme illustré à la Figure 3C. Chez les souris témoins, aucun VE-cadhérine n’est précipité, tandis que la VE-cadhérine est présent dans les lysats des animaux témoins et biotine et sous perfusion. La molécule d’adhérence intracellulaire 2 (ICAM-2) est précipitée de biotine et perfusé avec des animaux, et aucun ICAM-2 ne se trouve chez les animaux témoins. Lysats de contrôle et de la biotine et perfusé avec animaux montrent des quantités égales d’ICAM-2 (Figure 3C). Actine servi sous le contrôle de chargement.
Cette méthode peut être utilisée pour quantifier les quantités de protéines de surface de cellules glomérulaire dans des modèles de néphropathie (p. ex., néphrotoxiques néphrite, NTN). Dans la phase précoce de NTN [jour 1 (1D) après injection de sérum NTN], protéinurie augmente rapidement. Dans la phase ultérieure de NTN [jour 18 (18d)], protéinurie diminue de manière significative. Figure 4 illustre l’abondance surface cellulaire néphrine début NTN (1D). L’essai in vivo biotinylation avec (Figure 4A) montre une réduction de néphrine surface cellulaire chez les animaux NTN par rapport aux témoins. L’analyse densitométrique montre une réduction significative de la néphrine biotinylé (57 %) chez les animaux NTN par rapport aux témoins (Figure 4C). Analyse quantitative des néphrine total à l’actine ne révèle aucune différence significative entre les contrôles et les souris NTN (Figure 4B). En utilisant un marquage spécifique de p57, podocyte cellulaire, podocyte numéros affichent une quantité égale animaux NTN et contrôle (Figures 4 et 4E). Figure 5 affiche les résultats de l’abondance surface de cellule néphrine dans fin NTN (18d). Figure 5 A montre l’essai in vivo biotinylation avec contrôle et des souris NTN indiquant une récupération de néphrine surface cellulaire. Analyse densitométrique n’affiche aucune différence significative de cellule néphrine surface en contrôle et souris NTN (Figure 5B). Néphrine totale a été réduite de 25 % chez les souris NTN (Figure 5C). Podocyte nombres ont diminué chez les souris NTN par rapport aux témoins d’environ 19 % (Figures 5 et 5E).
Figure 1 : La perfusion rénale et l’isolement des glomérules. (A) vue au microscope dans le situs murin après perfusion avec PBSCM. Le cathéter dans l’aorte est indiqué par une flèche. Une perfusion de PBSCM conduit les reins à pâlir. (B) l’embolisation des glomérules avec billes magnétiques apparaissent comme des points bruns sur la surface du rein. (C) découvre que le microscope montrant j’ai) la contamination des glomérules (brunes ronde structures) ; II) avec les tubuli (structures légères allongés) ; et iii) débris de cellules. Pureté des glomérules est d’environ 50 %. Billes magnétiques libres apparaissent comme des points bruns (grossissement 100 X). (D) découvre à travers le microscope montrant une pureté de 95 % des glomérules (grossissement 100 X). Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2: biotine détecté dans la boucle capillaire glomérulaire. Image représentant immunofluorescence des glomérules de souris (C57BL/6) perfusé avec PBSCM (contrôle) et biotine (biotine). Biotine (vert) est visualisé par la streptavidine dans la boucle capillaire glomérulaire uniquement chez les souris de biotine et sous perfusion. Souris de contrôle ne montrent pas biotine glomérulaire coloration. Wt1 (rouge) est détecté dans les noyaux des podocytes dans les deux souris. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3: In vivo biotine marquage des protéines de surface de cellules glomérulaires. (A) Western blot analyse des protéines de surface cellulaire immunoprécipitée (IP) de biotinylé (IP : streptavidine agarose perles) et lysats (lysats) des reins de perfusion PBSCM (contrôle) et les souris de biotine perfusés (biotine). Les protéines transmembranaires néphrine et podocalyxin sont détectés uniquement dans des échantillons d’immunoprécipitée des reins de souris de biotine et sous perfusion. Chez les souris témoins, néphrine et podocalyxin ne sont pas détectés dans les sondes immunoprécipitée des reins de souris de contrôle. Dans les lysats des animaux témoins et biotine perfusés, podocalyxin et total néphrine sont exprimées également dans les deux groupes. La protéine intracellulaire extracellulaire-signal réglementés kinases p42 et p44 (ERK) ne sont pas détectés dans immunoprécipitée sondes de contrôle et des reins de souris biotine et sous perfusion. Dans les lysats des deux groupes de souris, ERK est détectée en parts égales. L’actine est colorée comme un contrôle de chargement. (B) Western blot analyse d’immunoprécipitée néphrine (IP : α-néphrine) PBSCM perfusés (contrôle) et les souris de biotine perfusés (biotine). Dans les reins perfusés biotine, néphrine est visualisé avec streptavidine coloration, alors qu’aucun détection pour néphrine ne se trouve chez les souris témoins. La fraction immunoprécipitée de néphrine (IP : α-néphrine, WB : néphrine) ainsi que la fraction lysate (lysat, WB : néphrine) colorées pour néphrine voir la quantité égale de néphrine. L’actine est utilisée comme un contrôle de chargement. Analyse par transfert Western (C) de la protéine de surface cellulaire immunoprécipitée biotinylé (IP : streptavidine agarose perles) et lysats (lysats) des reins de PBSCM perfusés (contrôle) et les souris de la biotine et sous perfusion (biotine). La protéine transmembranaire marqueur vasculaire endothéliale (VE)-cadhérine et la molécule d’adhérence intracellulaire 2 (ICAM-2) sont détectés uniquement dans la fraction d’immunoprécipitée des animaux de biotine et sous perfusion. Chez les souris témoins, aucun VE-cadhérine ou ICAM-2 ne sont détectés. Actine agit comme un contrôle de chargement. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’abondance de la protéine glomérulaire néphrine dans début néphrotoxiques glomérulonéphrite (NTN). (A) Western blot analyse de surface néphrine (IP : α-néphrine, WB : streptavidine) et total néphrine (IP : α-néphrine ou lysat, WB : néphrine) en contrôle et néphrotoxiques sérique chez les souris traitées (NTN 1D). Actine agit comme un contrôle de chargement. Par rapport aux témoins, NTN souris traitées montrent réduite néphrine surface cellulaire (IP : α-néphrine, streptavidine WB) par rapport aux témoins. B l’analyse Quantitative du total néphrine/actine contrôle et NTN 1 souris d [contrôle n = 4, NTN n = 6, différence non significative (ns)]. (C) Densitometric analyse de cell surface néphrine (biotinylé néphrine/total néphrine) contrôle et souris NTN (* p < 0,01, contrôler n = 4, NTN n = 6). (D) l’immunohistochimie de p57 montrant les podocytes en contrôle et NTN 1 souris d. (E) analyse Quantitative des cellules positives p57 par touffe de surface (μm2). (40 glomérules par souris quantifié, ns). La tache occidentale données montrent moyen ± SD. Podocyte comtes moyen ± SEM. Unpaired t-test avec correction de Welch. Echelle = 50 µm. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : L’abondance de la protéine glomérulaire néphrine dans fin néphrotoxiques glomérulonéphrite (NTN). (A) Western blot analyse de surface néphrine (IP : α-néphrine, WB : streptavidine) et total néphrine (IP : α-néphrine ou lysat, WB : néphrine) dans le sérum de contrôle et néphrotoxiques traité des souris (NTN 18d). Par rapport aux contrôles, NTN 18 souris d montrent une quantité égale de cellules néphrine surface (IP : α-néphrine, WB : streptavidine). NTN traité des souris exposées jour 18 moins néphrine total et actine agit comme un contrôle de chargement. (B) la densitométrie n’affiche aucune différence significative dans la cellule néphrine surface entre contrôles et NTN 18 souris d (contrôle n = 4, NTN n = 3). (C) Densitometric analyse de néphrine total à l’actine. Chez les souris NTN au jour 18, il exprime moins néphrine comparée aux témoins (contrôle n = 4, NTN n = 3, ** p < 0,001). (D) l’immunohistochimie de p57 montrant les podocytes en contrôle et NTN 18 souris d. Il y a des cellules positives moins p57 (rouge) chez la souris d NTN 18 comparées aux témoins. Billes magnétiques apparaissent comme des points noirs. (E) l’analyse Quantitative des cellules positives p57 surfacique touffe glomérulaire (μm2) (*** p < 0,0001, contrôler n = 2, NTN n = 2, 40 glomérules par souris quantifié). La tache occidentale données montrent moyen ± SD. Podocyte comtes moyen ± SEM. Statistical analysis : non appariés t-test avec correction de Welch. Echelle = 50 µm. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode présentée permet la réussite de l’isolement des glomérules d’enquêter glomérulaire ARN ou protéine. En outre, les cultures primaires de cellules glomérulaires peuvent être effectuées depuis les glomérules isolés. Si biotine est appliqué avant l’isolement glomérulaire, marquage des protéines de surface de cellules glomérulaire peut être effectuée. Avec cette méthode, in vivo des cellules glomérulaires traite des protéine de surface peut être étudiée, et la détermination semi-quantitative de l’abondance de la protéine est possible. Les étapes plus critiques pour les tests avec succès abondance de protéine de surface de cellules glomérulaires sont 1) développement manuel spécialisé en chirurgie surtout la canulation de l’aorte de la souris, 2) bulle-connexion gratuite de seringues afin d’éviter l’air embolisation de la les glomérules et 3) travaillant dans des conditions glacées après une perfusion de PBSCM a commencé.
Pour cette technique, manuel spécialisé en chirurgie de la souris est indispensable. Canulation de l’aorte est particulièrement important, car la dissection du navire évitera la perfusion des reins. La coupe dans l’aorte devrait être assez grande (environ 50 % du diamètre du vaisseau) à créer suffisamment d’espace pour introduire le cathéter. Si le cathéter est coupé en diagonale, introduction du cathéter dans l’aorte sera plus facile. En plus de la dissection, le cathéter introduit doit être placé haut dans l’aorte afin de ne pas obstruer les artères rénales. Les artères rénales seront par ailleurs pas être perfusés avec biotine et billes magnétiques.
Biotine est une vitamine de petite qui se lie avec une forte affinité aux protéines de streptavidine. En raison de sa petite taille (244 Da), biotine n’altère pas la fonction des protéines conjuguées et est filtrée par le glomérule. Par incubation avec la streptavidine, protéines biotinylées facilement se distingues des protéines non balisés par perles d’agarose ou d’autres méthodes. Lient des esters de N-hydroxysuccimide (NHS) de la biotine à amine (-NH2) groupes de protéines, qui sont abondantes sur les chaînes latérales des résidus de lysine, par exemple. Sulfo-NHS-LC-biotine est l’eau soluble et cellule-imperméable, si les membranes cellulaires sont intacts. Sulfo-NHS-LC-biotine a été démontré d’étiqueter les protéines de surface de cellules23. Liaison des esters de NHS de biotine pour groupes amines dépend de pH (7-9) et l’utilisation de tampons d’amines libres (p. ex., PBSCM). PBSCM avec un pH de 7,4 a donc servi à perfuse les reins des souris avec de la biotine, car il combine les propriétés physiologiques idéales avec une solubilité optimale et la fonction de biotine. Pour étancher les protéines après marquage, perfusion de PBSCM avec de la glycine est réalisée, permettant la biotine d’être lié aux groupes amine de la glycine. Pour éviter les processus cellulaires après la mort de l’animal, il est important d’effectuer une perfusion avec une solution glacée et continuer à travailler sur la glace.
Semblables aux ex vivo biotinylation méthodes, les contraintes mécaniques de traitement des glomérules pendant en vivo biotinylation protocoles mai également endocytose impact, rapide, signalisation des événements et l’intégrité de la RNA. Il est donc essentiel que toutes les étapes de traitement sont effectuées sur la glace pour réduire les risques de l’activité enzymatique cellulaire.
Modèles animaux albuminuriques comme néphrotoxiques sérum néphrite (NTN) dommages souris reins gravement. En particulier, NTN se traduit par l’expansion mésangiale, sclérose glomérulaire et des lésions tubulaires, conduisant à la fibrose rénale à un stade avancé de la maladie (42 jours)24. Perfusion altérée des glomérules scléreuses dans les modèles de la maladie peut conduire à des résultats biaisés de l’abondance de la protéine. Glomérules sclérosées ne vont probablement pas être perfusés avec des billes magnétiques et ne peuvent donc pas devenir isolés dans cette méthode. Dans les modèles de maladies entraînant une sclérose glomérulaire sévère, utilisant des techniques pour isoler des glomérules par différentes étapes tamisage peut être une alternative à la méthode de billes magnétiques utilisée dans ce protocole25. Toutefois, si les glomérules sont sévèrement sclérosées, voire une perfusion avec de la biotine pourra être compromise. En outre, ex vivo biotinylation, dans lequel extrait les glomérules sont baigné ex vivo en biotine solutions21, ne sera probablement pas avantageuse dans ces modèles. Vous pouvez également utiliser d’immunofluorescence pour détecter abondance de protéine dans les glomérules gravement malades peut-être être avantageuse, car il ne repose pas sur une perfusion de glomérules.
La détermination semi-quantitative de l’abondance de protéine à l’aide de cette technique fonctionne bien en utilisant la densitométrie. Cependant, de petites différences dans l’abondance des protéines peuvent être manqués comme résultat de la limite de détection de densitométrie.
La technique décrite peut être transférée à d’autres organes d’animaux qui sont perfusés, pourvu que les structures d’intérêt sont accessibles par des techniques d’isolement ou de la protéine de surface d’intérêt est spécifique à une seule cellule type ou organes de la structure. Même si toutes les protéines de surface sont biotinylated par cette technique, utilisant un anticorps spécifique pour l’immunoprécipitation conduira à la fraction d’expression de la protéine de surface cellulaire de la protéine spécifique (tel qu’illustré pour néphrine dans la Figure 3B).
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Blanka Duvnjak pour son aide technique exceptionnel. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 à M.W. et QU280/3-1 à Q.I. Le bailleur de fonds n’avait aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données, analyse des données, décision de publier et préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
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