التحول المتبعة بوساطة استخدام أسلوب الأزهار تراجع يمكن أن تستخدم بنجاح لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة من طراز اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا. نحن نقدم على بروتوكول تعديل من أن نبات التمويل، النظر في عادات مختلفة للنمو والخصائص الفسيولوجية اكستريموفيتي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
النباتات النمو والتحول فلورال-تراجع المتبعة بوساطة من اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بارفولا شرينكيلا اكستريموفيتي تكييف الإجهادات اللاأحيائية المختلفة، بما في ذلك عدة تؤكد سمية أيون. على الرغم من الموارد المجينية عالية الجودة المتاحة لدراسة كيفية تكييف النباتات للبيئة تؤكد، قيمته كنموذج الجينوم وظيفي وأداة كان محدودا بسبب الافتقار إلى نظام التحول ممكناً. في هذا البروتوكول، ونحن تقرير كيفية توليد المعدلة وراثيا مستقرة س. بارفولا خطوط باستخدام أسلوب الأزهار تراجع المتبعة بوساطة. قمنا بتعديل البروتوكول التحويل المستخدمة التمويل (أ) لحساب الصفات الفريدة من س. بارفولا، مثل عادة مزهرة غير محددة ومحتوى شمع ابيكوتيكولار عالية على أوراق. باختصار، كانت طبقات البذور بارفولا س. عند 4 درجة مئوية لمدة خمسة أيام قبل الغرس. كانت تزرع النباتات في كبيرة ضوء ح 14 و 10 ح الظلام و 130 µmol م-2s-1 كثافة ضوء، عند 22 درجة مئوية إلى 24 درجة مئوية. تم اختيار ثمانية إلى تسعة مصانع منذ أسابيع مع إينفلوريسسينسيس متعددة للتحول. كانت انخفضت هذه إينفلوريسسينسيس في حل تسلل من GV3101 tumefaciens المتبعة يحمل بلازميد pMP90RK . ونحن إجراء جولتين من غمس الزهور مع الفاصل زمني من ثلاثة إلى أربعة أسابيع لزيادة كفاءة التحويل. تم جمع بذور T1 وتجفف لمدة أربعة أسابيع في حاوية مع ﻣﺟﻓﻓﺍﺗ قبل الإنبات على الشاشة لمرشح تحويل خطوط. واستخدمت المقاومة إلى باستا للشاشة النباتات T1. نحن رش الحل باستا ثلاث مرات بفاصل زمني لمدة ثلاثة أيام بدءاً من المحطتين أسبوع الحد من إيجابيات كاذبة. وأجرى اختبار إسقاط باستا على الباقين على قيد الحياة محطات فردية لتحديد ترانسفورمانتس إيجابية حقيقية. وكان كفاءة التحويل 0.033%، مما أسفر عن 3 – 4 النباتات المعدلة وراثيا كل بذور T1 10,000 روج.
المقدمة
في هذا البروتوكول، يصف لنا النمو وإنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة لنموذج اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا. توافر نظام التحويل الفعال السمة مميزة لأي نموذج الوراثية تنوعاً. النباتات التي تزدهر في البيئات المتطرفة، المشار إليها اكستريموفيتيس، توفر موردا بالغ الأهمية لفهم التعديلات النبات للضغوط البيئية. بارفولا شرينكيلا (سابقا بارفولا ثيلونجيلا وبارفولوم يوتريما) نموذج اكستريموفيتي واحد مثل هذا، مع توسيع نطاق الموارد المجينية1،2،3،،من45. ومع ذلك، بروتوكولات التحول لم بعد تم ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. نمو النبات
-
تعقيم البذور (اختياري)
- يعد التبييض 50% في الماء المقطر مزدوجة (ddH2س) مع 1 أو 2 قطرات من المنظفات غير الأيونية (انظر الجدول للمواد) في أنبوب 50 مل. عكس الأنبوبة عدة مرات لخلط الحل.
ملاحظة: فمن الأفضل إجراء تعقيم البذور في تدفق الصفحي مجلس الوزراء مع سطح معقمة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. - إضافة حل التبييض ل ~ 100-200 س. بارفولا البذور في أنبوب 1.5 مل. مزيج دقيق وترك الأنبوب الجلوس لمدة 5 دقائق.
- إزالة المبيض من الأنبوب وإضافة الإيثانول 70%. تغسل البذور التي بيبيتينج عدة مرات، ثم قم بإزالة الحل الإيثانول فورا.
- تغسل البذور في....
- يعد التبييض 50% في الماء المقطر مزدوجة (ddH2س) مع 1 أو 2 قطرات من المنظفات غير الأيونية (انظر الجدول للمواد) في أنبوب 50 مل. عكس الأنبوبة عدة مرات لخلط الحل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قمنا بتطوير بروتوكول تحويل التي تمكن من حصاد البذور0 ر خلال 150 يوما، استخدام أسلوب الأزهار تراجع معدلة من أن التمويل (أ). ويبين الشكل 1 موجزاً للجدول الزمني والنباتات بارفولا س. التي تمثل المرحلة المثلى لتنفيذ هذا التحول عن طريق الأزهار تراجع. نحن تحديد معامل س. بارفولا مع زهور 70 –80 في inflorescences متعددة في 60 – 80 يوما بعد الإنبات في المرحلة المستهدفة للتحول. وأزيلت عدد صغير من الزهور مفتوحة أو المخصبة الموجودة من .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الدولة الفسيولوجية للنبات يؤثر إلى حد كبير كفاءة التحويل25. استخدام النباتات صحية ونشطة للتحول شرط رئيسي لنجاح عملية التحول في بارفولا س. وسيكون الماء أو النباتات وأكد الخفيفة الزهور أقل مقارنة بالنباتات صحية مثالية للتحول (الشكل 1، مركز لوحة). س. بارفولا يمكن أن تنمو كثافة ضوء µmol أقل من 130 م-2 s-1، ولكن النباتات التي تميل إلى أن تكون فرايلير؛ ستؤدي هذه النباتات إلى أكثر إحباط الزهور بعد تراجع الأزهار. س. بارفولا يمي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل على جائزة مؤسسة العلوم الوطنية 1616827 المجلس.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agar | VWR International ، Radnor ، PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent ، BD Diagnostics |
| B5 Vitamins | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO | G1019 | Gamborg ' s محلول فيتامين |
| المجفف | W A Hammond Drierite ، Xenia ، OH | 22005 | يشير إلى DRIERITE 6 mesh |
| متجه الوجهة لتحويل النبات | TAIR | Vector: 6531113857 | pKGWFS7 |
| كوفيت التثقيب الكهربائي | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 9104-5050 | كوفيت التثقيب الكهربائي ، غطاء دائري ، فجوة 0.2 سم |
| مختبرات | BIO-RAD ، هرقل ، كاليفورنيا | 1652100 | حبات الأسمدة MicroPulser Electroporator |
| Osmocote Garden ، ماريسفيل ، أوهايو | N / A | Osmocote Smart-Release Plant Food ؛ زهرة & أمبير | |
| طقم استخراج هلام | iNtRON Biotechnology ، بوسطن ، ماساتشوستس | 17289 | MEGAquick-spin مجموعة تنقية الحمض النووي للجزء |
| الكلي Gentamicin | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO | G1914-5G | كبريتات الجنتاميسين |
| جلوفوسينات الأمونيوم (11.3٪) مبيدات الأعشاب (BASTA) | باير للعلوم البيئية ، مونتفيل ، نيوجيرسي | N / A | Finale مبيدات الأعشاب |
| Kanamycin | VWR International ، رادنور ، بنسلفانيا | 200004-444 | كاناميسين أحادي الكبريتات |
| MES | Bioworld ، دبلن ، أوهايو | 41320024-2 | MES ، فري حمض |
| ملح MS | MP Biomedicals ، سانتا آنا ، كاليفورنيا | 092621822 | خليط الملح القاعدي المعدل من Hoagland |
| N6-benzylaminopurine (BA) ؛ | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري | B3274 | 6-محلول بنزيلامينوبيورين |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | كلوريد الصوديوم |
| المنظفات غير الأيونية | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري | 9005-64-5 | توين 20 & nbsp ؛ |
| طقم عزل البلازميد | Zymo Research ، Irvine ، CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase Enzyme Mix | Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II مزيج الإنزيم |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO | R3501-1G | Rifampicin ، مسحوق ، ≥ 97٪ (HPLC) |
| حاضنة اهتزاز | ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| مزيج التربة | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International ، Radnor ، PA | IC15206705 | |
| أنابيب مخروطية معقمة 50 مل | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، فلوريدا | 1500-1811 | 50 مل أنابيب غطاء لولبي مخروطي الشكل ، كوبوليمر ، رفوف ، |
| سكروز | VWR International ، رادنور ، PA | 57-50-1 | السكروز ، ACS |
| محلول خافض للتوتر السطحي | بذور Lehle ، Round Rock ، TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| الاستنساخ القائمة على Topoisomerase | Life Technologies ، Carlsbad ، CA | K240020 | مجموعة استنساخ pENTR / D-TOPO ، مع طلقة واحدة TOP10 مختصة كيميائيا E. القولونية< / em> |
| Tryptone | VWR International ، Radnor ، PA | 90000-282 | BD Bactto Tryptone ، مستخلص الخميرة BD Biosciences |
| VWR International ، Radnor ، PA | 90000-722 ؛ | مستخلص خميرة BD Bacto ، BD Biosciences |
المراجع
- Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
- Oh, D. -H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241(2012).
- Whited, J. The ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
