Summary
ZW10 Interacting Protein (ZWINT) beteiligt sich am mitotischen Spindel-Checkpoint und der Pathogenese des Karzinoms. Hier stellen wir eine Methodik zur Immunostainierung von ZWINT in menschlichen Lungenkrebsgeweben vor, gefolgt vom digitalen Scannen ganzer Dias und Bildanalyse. Diese Methode kann qualitativ hochwertige digitale Bilder und zuverlässige Ergebnisse liefern.
Abstract
Ziel dieser Studie ist es, eine Methodik zur Immunfärbung menschlichen Lungengewebes einzuführen, gefolgt von einem digitalen Volldia-Scanning und einer Bildanalyse. Digitales Scannen ist eine schnelle Möglichkeit, einen Stapel von Dias zu scannen und digitale Bilder mit hoher Qualität zu erzeugen. Es kann konkordante Ergebnisse mit konventioneller Lichtmikroskopie (CLM) von Pathologen produzieren. Darüber hinaus ermöglicht die Verfügbarkeit digitaler Bilder, dass dieselbe Folie gleichzeitig von mehreren Personen beobachtet werden kann. Darüber hinaus können digitale Bilder von Dias in einer Datenbank gespeichert werden, was eine langfristige Verschlechterung von Glasdias vermeidet. Die Grenzen dieser Technik sind wie folgt. Zunächst benötigt es hochwertiges vorbereitetes Gewebe und die ursprüngliche Immunhistochemie (IHC) gleitet ohne Beschädigung oder überschüssige Dichtstoffrückstände. Zweitens sollten Tumor- oder Nichttumorbereiche von erfahrenen Pathologen vor der Analyse mit Software angegeben werden, um Verwirrung über den Tumor oder Nichttumorbereiche während der Bewertung zu vermeiden. Drittens muss der Bediener die Farbwiedergabe während des gesamten Digitalisierungsprozesses in der Ganzschiebebildgebung steuern.
Introduction
ZW10 interagierendes Protein (ZWINT) ist ein notwendiger Bestandteil des Kinetochore-Komplexes, der am mitotischen Spindel-Checkpoint1,2,3beteiligt ist. Es wurde berichtet, dass die Erschöpfung von ZWINT zu einer abnormen vorzeitigen Chromosomentrennung1,2,3führt. Jüngste Studien haben ergeben, dass ZWINT an der Pathogenese mehrerer Tumoren beteiligt ist, indem die Proliferation von Tumorzellen gefördert wird4,5. Wir berichteten zuvor über die Überexpression von ZWINT bei Lungenkrebs5. Es ist allgemein anerkannt, dass die Analyse von Dias durch Pathologen mit CLM zeitaufwändig und nicht quantitativist 6,7,8. Darüber hinaus könnte die Verschlechterung der gelagerten Glasgweise es unmöglich machen, zuvor erstellte Dias zurückzuziehen. Die neue Methode der computerbasierten, digitalen Ganzdia-Bildgebung (WSI) kann diese Einschränkungen überwinden6,7,8.
Zu diesem Zweck beschreiben wir eine Methodik der Immunostainierung von ZWINT in menschlichen Lungenkrebsgeweben, gekoppelt mit ganzdia-digitalem Scannen und softwarebasierter Bildanalyse. Der Hauptvorteil dieser Methodik ist die Erstellung von konkordanten Ergebnissen mit CLM. Diese Technologie kann weit verbreitet in den Bereichen der pathologischen Bewertung von Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E) und IHC, Fluoreszenz-in-Situ-Hybridisierung (FISH), Gewebemikroarrays (TMA) und Arzneimittelentdeckung und -entwicklung eingesetzt werden.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Ethikkomitee des Zhongnan Hospital der Wuhan University und des Renmin Hospital der Wuhan University genehmigt.
1. Vorbereitung von IHC-Folien
- Fixieren Sie die Lungengewebeprobe, indem Sie das menschliche Lungengewebefragment (ca. 3 x 3 cm) in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Saline (PBS) für 24 h bei Raumtemperatur (RT) eintauchen.
- Dehydrieren Sie das Gewebe in 80%, 95% und 100% Ethanol für 15 min, 20 min, bzw. 20 min, bei Raumtemperatur. Schließlich tauchen Sie das Gewebe in 100% Xylol 3x für jeweils 20 min bei Raumtemperatur ein.
- Zum Einbetten das Gewebe 30 min in Paraffin (63 °C) eintauchen. Paraffin wechseln und das Gewebe für weitere 45 min wieder eintauchen. Schließlich das Paraffin noch einmal wechseln und das Gewebe für weitere 1 h hineintauchen.
- Schneiden Sie das Gewebe mit einem Drehmikrotom in 5 m dicke Abschnitte und legen Sie es auf 20 g/ml poly-L-Lysin-beschichtete Dias.
- Zum Entwachsen die Dias 2 h in einen 65 °C-Ofen geben und dann die Abschnitte 15 min in Dimethylbenzol eintauchen, gefolgt von einem Einweichen in 100% Xylol für 15 min.
- Hydratisieren Sie die Dias mit den Gewebeabschnitten 2x für 5 min in 100% Ethanol, gefolgt von einer Behandlung mit seriell verdünntem Ethanol von 5 min in 95% Ethanol, 5 min in 80% Ethanol, 5 min in 70% Ethanol und 5 min in 50% Ethanol.
- Führen Sie Antigen-Reparatur.
- Zitronensäure-Reparaturflüssigkeit (20x) auf 1x mit doppeldestilliertem H2O (ddH2O) verdünnen.
- Legen Sie die Dias mit den Gewebeteilen und der 1x Zitronensäure-Reparaturflüssigkeit (300 ml) in eine Antigen-Reparaturbox und erhitzen Sie sie dann in der Mikrowelle mit hoher Leistung für 2 min, gefolgt von einer Erwärmung bei geringer Leistung, um das Kochen für 6 min aufrecht zu erhalten.
- Lassen Sie die Abschnitte auf natürliche Weise auf Raumtemperatur abkühlen.
- Ersetzen Sie die Zitronensäure-Reparaturflüssigkeit mit 0,01 M PBS, waschen Sie die Abschnitte jeweils 5 min im Rotationsshaker bei Raumtemperatur 3x.
- Beseitigen Sie die endogene Peroxidase.
- 30% von H2O2 bis 3% mit ddH2O verdünnen, den Dias hinzufügen (sicherstellen, dass es alle Gewebe abdeckt), und die Dias in einer nassen Box bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
Hinweis: Die Nassbox ist eine Kunststoffbox von 10 x 15 cm und kann Wasser enthalten. - Waschen Sie die Schlitten 3x, jeweils für 5 min, mit 0,01 M PBS im Drehschüttler bei Raumtemperatur.
- 30% von H2O2 bis 3% mit ddH2O verdünnen, den Dias hinzufügen (sicherstellen, dass es alle Gewebe abdeckt), und die Dias in einer nassen Box bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
- Blockieren Sie das unspezifische Antigen.
- Verdünnen Sie das konzentrierte normale Ziegenserum auf 10% Ziegenserum mit PBS mit 0,1% Tween 20 (PBST).
- 10% Ziegenserum zu den Dias geben und 30 min in der Nassbox bei 37 °C bebrüten.
Hinweis: Das Ziegenserum sollte alle Gewebe in den Dias abdecken.
- Färben Sie das Gewebe.
- Inkubieren Sie die Dias mit Kaninchen anti-human Anti-ZWINT Antikörper (1:50) bei 4 °C über Nacht.
- Waschen Sie die Dias 3x, jeweils für 5 min, mit 0,01 M PBST (1 ml von 0,1% Tween 20 in 1.000 ml PBS) im Drehschüttler bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Dias mit Sekundärantikörpern (Anti-Kaninchen-Erkennungssystem, 1:200) 30 min bei 37 °C.
- Waschen Sie die Schlitten 3x, jeweils für 5 min, mit 0,01 M PBST im Drehschüttler.
- Um die Immunfärbung zu visualisieren, fügen Sie die Dias auf 300 l frisches 3,3-Diaminobenzidin ein und waschen Sie die Dias dann bei Raumtemperatur mit Leitungswasser.
Hinweis: Der Färbegrad wird unter dem Mikroskop überwacht (Vergrößerung 10X - 40X). - Gegenstain das Gewebe. Die Dias mit Hämatoxylin-Färbungslösung für 2 min bei Raumtemperatur färben und dann die Dias mit Leitungswasser 15 min waschen.
Hinweis: Der Kern erscheint blau unter dem Mikroskop (Vergrößerung 10X - 40X). Wenn der Grad der blauen Färbung stärker ist, kann salzchlorische Alkoholdifferenzierung für 3 - 5 s verwendet werden, gefolgt von der Spülung des Gewebes zurück zu blau mit Leitungswasser für 15 min, um die prominente Färbung des Gewebes zu erleichtern. - Dehydrieren Sie die Rutschen für 5 min in 50% Ethanol, 5 min in 70% Ethanol, 2x in 80% Ethanol für 5 min, 5 min in 95% Ethanol und schließlich 2x für 5 min jeweils in 100% Ethanol bei Raumtemperatur.
- Zur Transparenz tauchen Sie die Gewebeabschnitte 15 min lang in einen Tank mit 100% Xylol ein und übertragen Sie die Abschnitte 15 min bei Raumtemperatur in einen anderen Tank, der 100 % Xylol enthält.
- Zum Abdichten nehmen Sie 50 - 100 l neutrales Kaugummi und fügen Sie 5% Xylol in das Gemisch ein (Vermischung in Blasen vermeiden). Fügen Sie 15 l der oben genannten Mischung zu den Lungengewebeabschnitten hinzu. Versiegeln Sie die Folie mit Bezugsglas und drücken Sie die Blasen vorsichtig heraus.
2. Automatisches Volldia-Scannen von IHC-Dias
- Lassen Sie die versiegelten Dias 12 h bei Raumtemperatur trocknen, um sie zu trocknen.
- Wählen Sie die Option Helles Feld manuell aus, und geben Sie die manuelle Scanschnittstelle ein.
- Überarbeiten Sie den Namen der Folien, und wählen Sie einen Speicherpfad für die Bilder aus.
- Legen Sie den Scanbereich fest, und wählen Sie die Option Stichproben mithilfe von vom Benutzer festgelegten Schwellenwertenscannen . Der Schwellenwert liegt bei etwa 50, wobei ein Scanbereichserweiterungswert von 200 m erreicht ist.
- Legen Sie den Scanfokuswert fest, wählen Sie den Fokus automatisch aus – er reicht von 1050 bis 2650 – und wählen Sie schließlich den Einschichtmodusaus.
- Laden Sie die IHC-Folien auf die Workstation, und starten Sie den automatischen Scan.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Folien nicht beschädigt sind. Halten Sie die Rutschen sauber und durchscheinend und vermeiden Sie Staub, Konfetti und überschüssige Dichtstoffrückstände auf den Dias. Die Glasrutsche und der Deckelschlupf sollten ohne Markierungen sein. Reinigen Sie die Dias nicht mit Xylol. Die Größe der Folien ist in Tabelle 1angegeben. - Scannen Sie automatisch den gesamten Gewebeabschnitt auf einem Dia mit 20X, 40X oder 100X Vergrößerung.
- Sammeln und speichern Sie die Bilder am Ende des gesamten Dia-Scans.
3. Analyse der Dias durch Imaging Software
- Starten Sie die histopathologische Bildanalysesoftware, und wählen Sie Lokaler Computeraus.
- Öffnen Sie die Datei, in der die Scandaten gespeichert sind.
- Wählen Sie die entsprechende Zoomstufe zwischen 2X und 40X aus.
- Passen Sie die Farbe an, um den optimalen Kontrast über Toggle color adjusteinzustellen.
- Kreisen Sie manuell und benennen Sie die Teile, die für jedes Bild von Interesse sind.
Hinweis: Sie können z. B. einen Bereich umkreisen und als Tumorbereichbenennen. - Wählen Sie Plugins und QC. Zu diesem Zeitpunkt wird der Szenario-Generator angezeigt.
- Wählen Sie Dichte-Quant und passen Sie die Erkennungsleiste an.
Hinweis: Dieser Vorgang sollte sorgfältig durchgeführt werden. Der Balken der blauen Toleranz wird verwendet, um die Farbe des Zellkerns anzupassen. Der Balken der braunen Toleranz wird verwendet, um die Sättigung der Füllfarbe im Bild anzupassen. Die Ergebnisse der Bilder nach Anpassungen sollten mit den ursprünglichen Gegenstücken übereinstimmen. - Passen Sie die Score-Ebenen an, um die Färbeintensität der eingekreisten Bereiche denen der Originalbilder zu ähneln.
Hinweis: Dunkelbraun zeigt starkes Positiv, bräunliches Gelb ist mäßig positiv, hellgelb ist schwach positiv und Weiß ist negativ. - Speichern und benennen Sie das Modell als Datei. Wenden Sie das Modell auf andere Folien an, und wählen Sie Ausgewählte Anmerkungenaus.
- Lassen Sie die Software automatisch den H-Score für die eingekreisten Bereiche im Bild berechnen.
4. Quantifizierung der Partituren mit dem H-Scoring System9,10
- Berechnen Sie den Prozentsatz der Immunfärbung und die Färbungsintensität (0: negativ, 1+: schwach, 2+: moderat, 3+: stark).
- Verwenden Sie ein Bewertungssystem (H-Score), um die pathologische Bewertung des Tumors und der angrenzenden Nichttumorbereiche zu berechnen.
Hinweis: H-Score = (% der Zellen mit schwacher Intensität x 1) + (% der Zellen mit moderater Intensität x 2) + (% der Zellen mit starker Intensität x 3). Daher ist der maximale H-Score 300, wenn 100% der Zellen mit starker Intensität quantifiziert werden.
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Representative Results
Wir haben die Expressionskonzentrationen von ZWINT in 28 Paaren von nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC)-Proben (Tumor und angrenzendes Nichttumorgewebe) gemessen, darunter 14 Plattenepithelkarzinome (SCCs) und 14 Adenokarzinome (ADCs) durch IHC. Das ganzdiale digitale Scannen der Dias lieferte digitale Bilder von hoher Qualität (Abbildung 1A). Die Ergebnisse zeigten, dass der H-Wert des Lungenkrebses signifikant höher war als der von angrenzenden nicht-krebskranken Geweben (P < 0.0001, zweischwanziger t-Test) (Abbildung 1A und 1B). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Expressionsebene von ZWINT in SCCs signifikant höher war als in ADCs (Abbildung 1C).
Abbildung 1 : Immunhistochemische Färbung für Lungenkrebsgewebe. Diese Zahl wurde von Yuan et al. geändert. 5 mit Genehmigung von Dove Press. (A) Dieses Panel zeigt repräsentative immunhistochemische Bilder von Lungenkrebspatienten (Vergrößerungen: 10X und 40X). (B) Dieses Panel zeigt den H-Score von Lungenkrebs und angrenzenden nicht-krebskranken Geweben. (C) Dieses Panel zeigt den H-Score von ADCs und SCCs. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. * P < 0,05; P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| MIN (mm) | MAX (mm) | |
| Breite | 25 | 26 |
| länge | 75 | 76 |
| dichte | 0,9 | 1.2 |
Tabelle 1: Foliengrößen.
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Discussion
Ganzdia-Scanning wird zu einem heißen Thema für sein robustes Scannen und die Produktion von qualitativ hochwertigen Bildern für klinische und Forschungszwecke11,12,13. Bilder können mit Dia-Scanning-Mikroskopen innerhalb von Minuten erstellt werden11,12,13. Mit dieser Methode erhielten wir hochwertige Bilder für ZWINT IHC-Dias und verglichen den H-Score zwischen Tumor- und Nichttumorgeweben. In dem hier vorgestellten Protokoll sind die wichtigsten Schritte die Vorbereitung der hochwertigen IHC-Dias, die Bildaufnahme und die Spezifikation der Tumor- und Nichttumorbereiche vor der pathologischen Bewertung13,14 , 15 , 16.
Die aktuelle Methode hat einige Vorteile im Vergleich zu (CLM). Das digitale Scannen ist schnell genug (ca. 20 Dias/Stunde), um einen Stapel von Dias zu scannen und hochwertige digitale Bilder zu erzeugen. Es kann konkordante Ergebnisse mit CLM produzieren, dauert aber relativ weniger Zeit. Die Verfügbarkeit digitaler Bilder ermöglicht es, dass dieselbe Folie gleichzeitig von mehreren Personen beobachtet werden kann. Digitale Bilder von Dias können in einer Datenbank gespeichert werden, was eine langfristige Verschlechterung von Glasdias vermeidet.
Zu den Einschränkungen dieser Technik gehören die Notwendigkeit von hochwertigem Gewebe und IHC-Dias6,8,11 und technisches Know-how, um die Tumor- oder Nichttumorgewebeproben vor der Analyse mit Bildgebungssoftware zu spezifizieren. , um Verwirrung über den Tumor oder NichttumorBereiche während der Bewertung6,7zu vermeiden. Der Bediener muss auch die Farbwiedergabe während des gesamten Digitalisierungsprozesses in der Ganzschieber-Bildgebung17überwachen.
Diese Methode kann aktiv in FISH, TMA, und Arzneimittelentdeckung und Entwicklung angewendet werden6,18. Tabata et al. haben die Verwendung von WSI in primären pathologischen Diagnosen untersucht19. Sie analysierten retrospektiv 1070 WSI-Proben aus neun Krankenhäusern in Japan und bestätigten die Validierung der Verwendung von WSI in Primärdiagnosen. Einer der Hauptvorteile von WSI ist, dass es die gleichzeitige Anzeige der Folien durch mehrere Studentenermöglicht 20. Daher könnte die Validierung von Ganzdia-Scanbildern zur Entwicklung der digitalen Diagnostik für Bildungs- und Forschungszwecke beitragen6,18,21.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde von der National Natural Foundation of China (Nr. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 und 81501352) und der Natural Foundation of Hubei Province (China) (Nr. 2017CFB631) unterstützt. Die Autoren danken Guo Qin, Chang Min, Li Hui und ihren Kollegen von Wuhan Google Biological Technology Co., LTD für ihren technischen Support. Die Autoren danken auch Muhammad Jamal für die Sprachbearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pannoramic MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more. |
| QuantCenter | 3D HISTECH | Downloaded from the official website of the company | The framework for 3DHISTCH's image analysis applications. |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation. |
| Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody | Abcam | Cat: ab197794 | Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue. |
| Anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Goodbio Technology | Cat:GB23303-1 | Secondary antibody for IHC staining. |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan Goodbio Technology | Cat:G0002 | A solution containing a phosphate buffer. |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | Microscope for detection of H&E or IHC slides. |
| Dimethylbenzene | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent | Cat:1330-20-7 | A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study. |
| Hematoxylin Staining Solution | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1039 | It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue. |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications. |
| Citric acid repair liquid | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1202 | Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure. |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes. |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability. |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C. |
| CaseViewer Software | 3DHISTECH |
References
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