本文介绍了一种用于持续记录和分析小龙虾心脏活动与运动活动的无创生物监测系统。该系统由近红外光学传感器、视频追踪模块以及用于评估反映小龙虾生理状态并在心率波动期间表征其行为的心跳分析软件组成。
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本文内容
摘要
摘要
小龙虾是一种重要的水生生物，既可作为无脊椎动物行为学和生理学研究的实用生物学模型，也可作为水质状况的有效生物指示剂。尽管小龙虾无法直接指明导致水质恶化的具体物质，但它们能够通过心脏活动和行为活动的急性变化，在数秒内迅速向人类发出水质恶化的预警。
本研究介绍了一种非侵入性方法，由于该方法将简便性与可靠性集于一个模型之中，因此足够简单，可在各种条件下实施。
这种将生物体引入环境评估过程的方法，能够对周围环境中突发的水质恶化提供可靠且及时的预警，从而防止水质急剧下降。因此，本研究探讨了一种基于小龙虾生理学和行为学参数记录的无创系统，用于检测水生环境的变化。该系统目前已应用于一家本地啤酒厂，用于控制 饮料生产用水的质量，但也可用于任何水处理和供水设施，实现水质的连续实时评估，以及开展小龙虾心脏生理和行为的常规实验室研究。
引言
水生生物的应用研究，无论是作为各种实验室研究的模式生物1,2，还是作为监测工业及自然/环境水质的工具3,4，均已得到广泛研究。然而，无论人们是否属于科学界或其他职业领域，这一主题对人类而言仍具有显著的重要性。尽管目前已存在多种先进的方法用于监测某些特定参数（即所谓的"生物标志物"）5,6,7,8，但选择指示生物时最重要的要求仍包括三个简单因素：(i) 简便性，(ii) 可靠性，以及 (iii) 普遍可获得性。
小龙虾作为淡水动物的重要代表，因其在全球范围内广泛分布，且在大多数情况下9具有足够大而坚硬的头胸甲，便于操作，因而具有显著特点。这种甲壳类动物属于高等无脊椎动物，其重要的生理系统和相应器官已得到充分发育，同时仍保持相对简单的结构10。
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方案
1. 螯虾的选择
- 为了成功将本方法应用于小龙虾，应选择具有足够头胸甲尺寸（即头胸甲长度至少为30 mm）的成年个体用于传感器安装，目视检查其无疾病症状，并确认在触碰时能同时举起双螯。上述参数表明小龙虾处于适宜的健康状态。
注意：若试验中需使用多只小龙虾并使其暴露于相同条件下，实验组的组建应基于以下多个参数：(i) 相近的体重和体长；(ii) 相近的心率；(iii) 明显的夜间活动性；(iv) 正常的摄食行为；(v) 处于蜕皮间期17。有时仅通过心率测量、视觉或触觉检查难以判断小龙虾是否接近蜕皮期；因此，分析其血淋巴总蛋白含量可能具有帮助。预计当小龙虾接近蜕皮期时，其血淋巴蛋白含量高于蜕皮间期18。
2. 螯虾心脏活动与行为的记录
- 为了无创测量小龙虾的心率，需预先为此实验步骤准备传感器。在此之前，将一只小龙虾放入盛有水的水箱中，使其适应环境数天，以作为传感器准备的前置步骤。19 也需要几天时间。
- 将红外发光二极管（LED）与光电晶体管进行同轴耦合。将光学传感器电路安装在电路板上，其需要5 V电源供电。连接LED时，在红外传感器电路板上放置一个200 Ω电阻；连接光电晶体管....
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结果
因此，我们获得了小龙虾心脏活动与行为活动的组合数据，并以 txt 格式文件记录和保存（图3）。该文件除包含实验小龙虾的数量、日期和采样率外，还包括三列数据：（1）以 hh:mm:ss 格式表示的连续时间；（2）自动计算得出的心率，单位为每分钟心跳次数（beats per minute）；（3）运动状态，以无运动（0）或有运动（1）表示。当小龙虾无活动时，对应运动的单元格记为零；当其发生移动时，相应单元格则显示为1。在连续记录过程中，数据文件每天在00:00（即午夜12:00 AM）自动生成。将运动信息纳入分析至关重要，因为运动可能引起心率的变化（图4）。在第10秒时，通过蠕动泵将食物气味（研磨、过滤并稀释的摇蚊幼虫）送入盛有小龙虾的水箱中。在第14秒，小龙虾识别到刺激，由于所谓的朝向反应（orienting response），其心率略有下降。在第20秒时，心率开始上升，导致心跳间期缩短。在第26秒，小龙虾向刺激源移动，食物气味引起的生理兴奋以及运动的启.......
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讨论
已有广泛观点认为，测量某些生理参数（如心率、呼吸频率或二者同时测量）是记录小龙虾反应的一种比评估行为反应更可靠的方法，因为行为反应并不总是立即出现11。然而，显然在评估小龙虾对环境变化的真实反应时，最有效的方法是将心脏活动与行为记录相结合，因为这种方法能够揭示小龙虾心跳变化的原因，以及这些变化究竟是由于周围环境中的化学变化引起，还是由于运动启动所致。在进行水质监测时，必须消除所有外部因素对小龙虾生理指标变化的影响，包括那些会显著影响心率但并不对生物监测系统构成警报的突然运动。
另一种有助于实现更精确、更详尽的心跳评估的方法是分析螯虾心脏活动的变时性和变力性参数，这些参数主要与螯虾心脏信号中的特定波形相关19。此类分析证实，即使心跳每分钟仅变化几个节拍，某些次要参数仍可反映出螯虾心脏活动的显著变化19。
尽管使用上述方法具有诸多优势，但围绕小龙虾监测的研究正朝着最大限度减少对小龙虾触觉操.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由捷克共和国教育、青年和体育部项目“CENAKVA”（编号：CZ.1.05/2.1.00/01.0024）和“CENAKVA II”（编号：LO1205，国家可持续发展计划I项下）、捷克布杰约维采南波希米亚大学资助机构（项目编号：012/2016/Z）以及捷克科学基金会（编号：16-06498S）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 红外LED二极管 | KINGBRIGHT ELECTRONIC | KP-3216F3C | |
| 光电晶体管 | EVERLIGHT | ELPT15-21C | |
| 电阻器 | ROYAL OHM | 0805S8J0201T5E | |
| 电阻器 | ROYAL OHM | 0805S8F2200T5E | |
| 电容器 | KEMET | C0805C334K5RACTU | |
| 电缆 | TECHNOKABEL | FTP KAT.5E 4X2X0,14C | |
| 连接器 | HARTING | 21348100380005 | |
| 连接器 | HARTING | 21348000380005 | |
| 介电凝胶 | KRAYDEN | Sylgard 535 | |
| 模数转换器 | TEDIA | UDAQ-1416CA | |
| 胶水 | KUPSITO.SK | 7338723044 | |
| Kinect视频摄像头 | ABCSTORE.CZ | GT3-00002 | |
| 分析软件 | 捷克布杰约维采南波希米亚大学 渔业与水体保护学院 复杂系统研究所 | 软件链接：www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring 用户名：frov 密码：CF2018 |
参考文献
- Bownik, A., Sokołowska, N., Ślaska, B. Effects of apomorphine, a dopamine agonist, on Daphnia magna: Imaging of swimming track density as a novel tool in the assessment of swimming activity. Science of the Total Environment. 635, 249-258 (2018).
- Jeong, T. Y., Yoon, D., Kim, S., Kim, H. Y., Kim, S. D.
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重印与许可
