셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

요약

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

초록

생물 학적 과정의 다양 한 일반적으로 인접 셀 간의 인터페이스에 상호 작용 하는 단백질에 의해 중재-세포 상호 작용을 포함 한다. 관심,만 몇 가지 분석의 특히 살아있는 세포에 직접 그런 상호 작용 할 수 있다. 여기, 선물이 표현-셀 연락처에 이웃 세포의 표면에 단백질의 바인딩을 측정 하는 시험. 이 분석 결과 두 단계로 구성 됩니다: confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 셀 연락처에서 형광 변동 분광학 측정 뒤에 다른 형광 단백질을 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 셀의 혼합. 우리 셀 접속점에 걸쳐 녹말 체 선구자 같은 단백질 1 (APLP1)의 상호 작용을 측정 하 여 생물학으로 관련 된 맥락에서이 분석 결과의 타당성을 보여줍니다. 우리는 형광 기반 기술 (형광 교차 상관 분광학, 교차 상관 번호와 밝기 분석 검사)를 사용 하 여 필요한 악기 교정 데이터 수집에 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 우리는 데이터 분석 및 식별 하 고 외부, 스 퓨 리 어스 신호 변이 때문에 photobleaching 또는 셀 운동 등을 수정 하는 방법에 중요 한 단계를 논의.

일반적으로 제시 분석 결과 호모-또는 같은 또는 다른 종류의 셀 사이의 셀 연락처에서 heterotypic 단백질-단백질 상호 작용에 적용 하 고 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 구현 될 수 있습니다. 중요 한 요구 사항은 몇 분 동안 관심사의 단백질의 방산 역학 조사 하기에 충분 해야 하는 시스템의 안정성 이다.

서론

많은 생물학 과정 세포 세포 상호 작용, 예를 들어, 셀 접착^1,2,3, 셀 셀 퓨전⁴ 및 세포 인식⁵사이트에서 발생합니다. 이러한 이벤트는 특히 중요 한 다세포 생물의 세포-세포 커뮤니케이션, 예를 들어, 면역 반응 동안에 대 한 개발 중입니다. 이 프로세스는 일반적으로 즉, 이웃 세포의 원형질 막 (오후)에 표면에 지역화 되 고 규제에서 공간과 시간을 정확 하 게 세포 세포 접촉에서 특정 상호 작용을 받을 단백질에 의해 중재 됩니다. 대부분의 경우에서 이러한 상호 작용 직접 호모-또는 heterotypic 단백질-단백질 트랜스 상호 작용, 하지만 또한 이온 또는 extracellular 링커¹로 작동 하는 ligands를 포함 될 수 있습니다. 비록 기본적인 중요성의, 살아있는 세포의 기본 환경에서 직접 이러한 특정 단백질-단백질 상호 작용을 조사 하는 분석 실험의 부족이 이다. 많은 방법 중 필요 셀 중단 (예, 생....

프로토콜

1. 시료 준비:-셀 혼합 분석 결과

참고: 다음 프로토콜 부착 셀 혼합 절차를 설명합니다. 그것은에 경작 하는 셀에 대 한 수정할 수 있습니다.

1. 6 잘 플레이트, 예를 들어, 800000 HEK 293T 세포 (Neubauer 챔버 계산으로 계산), transfection 전에 하루에 셀의를 적절 한 수 씨 수 시드 및 transfection 사이의 시간에 따라 수정 하 고 다른 셀 형식에 대 한 조정 수 있습니다. 기본적인 실험 (즉, 관심과 부정적인 컨트롤의 단백질)을 수행 하려면 적어도 4 우물을 준비 합니다. 37 ° c, 5% CO₂ Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 매체에 문화 세포 보충 소 태아 혈 청 (10%)와 L-글루타민 (1%).
2. 제조업체의 지침에 따라 셀 transfect ( 재료의 표참조).
   1. 기본 실험을 수행 하려면 transfect, 플라스 미드는 '그린' (예를 들면, 단위체 향상 된 녹색 형광 단백질 (mEGFP), 또는 노란 형광 성 단백질 (mEYFP))에 '레드' (예를 들어, mCherry, 융합 하는 관심사의 단백질에 대 한 별도....

결과

첫 번째 테스트 단백질 단백질 상호 작용 분석 결과 대 한 즉, sFCCS/ccN & B 측정 (그림 1), 괴기 하 게 고유한 형광 단백질을 표현 하는 셀의 혼합 수행 해야 되지 것으로 예상 되는 단백질에 세포 세포 접촉을 (즉, 부정적인 컨트롤)에서 상호 작용 합니다. 따라서, HEK 293T 세포 myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-팜-mEYFP) 또는-mCardinal 표현 했다 혼합 하 고 sFCCS-셀 접촉 (그림 2A)에 걸쳐 수행 되었다. 이상적인 경우, 각 채널에 형광 신호는 오후에 있는 단백질의 방산 모션 때문에 안정적인 평균 주위 변동 되어 초점 볼륨에 있는 단백질의 수의 통계 유사. 상호 작용 하지 않는 단백질에 대 한 변동 두 채널에 서로 .......

토론

여기에 설명 된 실험 절차-셀 연락처, 형광 변동 분광학 기술을, 즉 sFCCS 및 ccN & B에서 트랜스 상호 작용 단백질-단백질의 조사를 수 이러한 방법은 두 괴기 하 게 분리 된 FPs 하나 또는 다른 융해 단백질을 표현 하는 각각 두 개의 인접 셀의 연락처에 대 한 관심의 protein(s) 융합에 의해 방출 되는 형광 변동에 대 한 통계 분석을 포함 한다. 트랜스 복합물의 존재는 이웃 PMs에서 단백질의 공동 보급의 정도 조사 하 여 정량은. 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 자세한 프로토콜,이 문서 분석 결과의 성공적인 신청의 실험적인 증거를 신경 접착 단백질 APLP1에 제공합니다. 우리는 APLP1 관련, 셀 연락처에서 homotypic 트랜스 상호 작용을 거쳐 보여줍니다. 또한, 아연 이온 트랜스 상호 작용에 대 한 multivalent 플랫폼을 제공 하 고, 따라서, 향상 된 트랜스 바인딩을 유도 하는-셀 연락처에서 APLP1 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM 성장 배지	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ 및 Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ 및 Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect 형질주입 시약	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	모든 플라스미드 6-웰 플레이트에 대한 자세한 설명은 참고 문헌 12 (Dunsing et al., MBoC 2017)를 참조하십시오
	Starlab	CC7672-7506
35- mm 유리 바닥 접시	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 컨포칼	Carl Zeiss	NA
MATLAB 소프트웨어 패키지	MathWorks	2015년ᄂ
Neubauer 세포 계수 챔버	Marienfeld	640110

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