Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

Resumo

Este protocolo fornece uma metodologia Fiji-baseada, user-friendly junto com instruções diretas que explicam como analisar confiantemente o comportamento do actomiosina em pilhas individuais e em tecidos epithelial curvados. Nenhuma habilidade de programação é necessária para seguir o tutorial; todas as etapas são executadas de forma semiinterativa usando a interface gráfica do usuário de Fiji e plugins associados.

Resumo

Os ovos imaturos da Drosophila são chamados de câmaras de ovos, e sua estrutura se assemelha a órgãos primitivos que sofrem alterações morfológicas de uma rodada a uma forma elipsóide durante o desenvolvimento. Esse processo de desenvolvimento é chamado de oogênese e é crucial para gerar ovos maduros funcionais para garantir a próxima geração de moscas. Por estas razões, as câmaras de ovo serviram como um modelo ideal e relevante para compreender o desenvolvimento de órgãos animais.

Diversos protocolos in vitro da cultura foram desenvolvidos, mas há diversas desvantagens a estes protocolos. Um envolve a aplicação de várias coberturas que exercem uma pressão artificial nas câmaras de ovos imaged, a fim de imobilizá-los e aumentar o plano de aquisição imaged da superfície circunferencial das câmaras de ovos analisadas. Essa abordagem pode influenciar negativamente o comportamento da maquinaria de actomiosina fina que gera o poder de girar as câmaras de ovo em torno de seu eixo mais longo.

Assim, para superar esta limitação, nós cultura câmaras de ovo de Drosophila livremente na mídia, a fim de analisar de forma confiável a maquinaria de actomiosina ao longo da circunferência das câmaras de ovo. Na primeira parte do protocolo, fornecemos um manual detalhando como analisar a maquinaria de actomiosina em um plano de aquisição limitado na escala celular local (até 15 células). Na segunda parte do protocolo, fornecemos aos usuários um novo plugin baseado em Fiji que permite a extração simples de uma camada fina definida da superfície circunferencial das câmaras de ovos. O seguinte protocolo descreve então como analisar sinais da actomiosina na escala do tecido (> 50 pilhas). Finalmente, nós apontemos as limitações destas aproximações nas escalas locais do celular e do tecido e discutimos seu desenvolvimento futuro potencial e aplicações possíveis.

Introdução

O desenvolvimento contínuo de novas tecnologias de imagem e software com aplicações nas ciências da vida tem proporcionado um enorme impacto na compreensão dos princípios básicos da vida. Um dos principais desafios é a visualização confiável dos processos de desenvolvimento em combinação com sua imagem ao vivo em vários tecidos. Os tecidos são partes de órgãos e corpos e, como tal, a maioria não são facilmente acessíveis para a imagem. Portanto, protocolos que permitam sua dissecção e cultivo in vitro foram desenvolvidos para Visualizar eventos biológicos que refletem suficientemente a situação in vivo dentro de um corpo vivo.

Ao longo das ....

Protocolo

Nota: O protocolo a seguir fornece instruções sobre como analisar a actomiosina no celular local e a escala tecidual em câmaras de ovos de Drosophila . A abordagem em escala local permite aos usuários analisar o comportamento detalhado da actomiosina em até 15 células por câmara de ovo e requer a aquisição de TLMs por um curto período de tempo (5 – 10 min) usando imagens de alta velocidade e um microscópio confocal invertido. Ao contrário, a escala do tecido fornece usuários a informação do actomiosina em 50-100 pilhas e exige a aquisição de TLMS por um longo período de tempo (≥ 30 minutos) usando a imagem latente de baixa velocidade e um mic....

Resultados

Este protocolo permite que os cientistas investiguem o comportamento das redes de actomiosina nos tecidos epiteliais. Isso só é possível quando uma análise detalhada do comportamento da actomiosina na escala celular local (algumas células) é combinada com uma análise semelhante na escala tecidual (muitas células). No entanto, os tecidos epiteliais são frequentemente curvados e a extração de uma fina camada desses tecidos não foi antes facilmente possível, como mostrado nas câmaras de ovos.......

Discussão

Etapas críticas e solução de problemas para a dissecação e cultivo de câmaras de ovo

Se muitas moscas são colocadas em um pequeno frasco, o alimento mosca pode virar lamacento após 2 – 3 dias devido a grandes quantidades de larvas de alimentação e moscas adultas ficando presos no alimento mosca. Nesse caso, vire o resto dessas moscas em um novo frasco com alimentos frescos e reduzir seu número. Em particular, excluir as fêmeas que estavam presas na comida.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamina
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140-122	[ +] 10.000 Unidades/mL Penicilina [+] 10.000 µ g/mL de Estreptomicina
Fetal Bovino Serum	Sigma	Solução de	Inativada por Calor
Human	Sigma	I9278
Tubos Falcon de 50 mL	estéril	Eppendorf
Millex-GV	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Pratos de micropoços com fundo de vidro	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Placa de Petri de 35 mm, Micropoço de 14 mm, vidro de cobertura nº 1.5
Fórceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (corante de membrana celular)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (corante de membrana celular)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Lâmina de dissecção de depressão	Fisher Scientific	12-560B
Equipamento microscópico
Steromicroscope	por exemplo, Zeiss		Stemi SV 6
Microscópio confocal invertido	, por exemplo, Zeiss/Olympus
Microscópio de disco giratório	, por exemplo, Zeiss/Andor
Vidro microscópico/vidro de cobertura	, por exemplo, Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit porta-agulhas	Hammacher	9160020
Espinha de cacto	Echinocactus grusonii / cacto
< strong>Drosophila< / em> estoques usados no manuscrito< / strong>
AX3< / sup> / AX3< / sup>; sqh-MRLC :: GFP / sqh-MRLC :: GFP< / em>			Para obter detalhes, consulte Rauzi et al.: Os fluxos contráteis de actomiosina polarizada planar controlam a remodelação da junção epitelial. Natureza 2010, Vol. 468, pág. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			Para detalhes, consulte Viktorinova et al.: A rotação epitelial é precedida pela quebra da simetria planar da actomiosina e protege o tecido epitelial das deformações celulares. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Edição 11, pág. e1007107.

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