Summary
وصف بروتوكول المبينة هنا تحليل الفلورة واستعادة بيوسيتين وإعادة البناء عالية الجودة من إينتيرنيورونس CA2 هيبوكامبال بعد التسجيلات الكهربية داخل الخلايا في المختبر، السماح للخلايا العصبية توصيف وتشريح الخلايا العصبية الدقيقة في نهاية المطاف دراستها.
Abstract
كيف يعالج نشاط الشبكة القشرية المعلومات من أهمية بالنسبة لعدد كبير من الأسئلة العلمية الأساسية والسريرية. ويحدد البروتوكول الموصوفة هنا اللبنات الأساسية لهذه الدوائر. في نهاية المطاف سوف توفر دراسات متعمقة للمناطق القشرية علماء آخرين مع عناصر الدائرة بحاجة لفهم كيفية تستحوذ على الدماغ والعمليات ويخزن المعلومات وما يذهب على نحو خاطئ في المرض، في حين الكهربية والمورفولوجية بيانات تستخدم على نطاق واسع من علماء الأعصاب الحسابية في بناء الشبكات النموذجية التي تستكشف تجهيز المعلومات. البروتوكول المبينة هنا ويصف كيفية الخلايا مملوءة بيوسيتين المسجلة في منطقة CA2 الحصين استردادها وثم أعيد بناؤها في 3D. بالإضافة إلى ذلك، يصف البروتوكول المظاهرة من البروتين الكالسيوم أو الببتيد المحتوى في إينتيرنيورونس مسجل.
Introduction
قشرة والحصين هياكل هذا التعقيد أن تصنيف الخلايا العصبية فرعية1،2،،من34، خرائط الاتصالات بينهما5،6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 وكيف تدعم هذه الدوائر الوظائف المعرفية12،13،،من1415 لا تزال قيد الدراسة المكثفة وموضوعا للمناقشة المستمرة. على سبيل المثال، لفهم تفاصيل وتعقيدات الدوائر وتنسيق البيانات التي تم الحصول عليها من دراسات مختلفة كثيرة، أنها مفيدة للغاية لتكون قادرة على تحديد ووصف العناصر، ولكن يظل موضوعا للمناقشة كيف كثيرة مختلفة توجد فئات من الخلايا العصبية، أو حتى ما إذا كان من الممكن لتحديد كافة الخلايا العصبية أنها تنتمي إلى فئة معينة. الأدوات الحاسوبية التي يمكن بناء واختبار الدوائر بدرجات متفاوتة من التعقيد حاليا نمواً16،،من1718، ولكن المركزية لهذه المساعي الحاجة إلى دراسات تفصيلية لأنواع الخلايا ومن خصائص الاتصالات بينهما. وتم جمع كمية كبيرة من المعلومات عن الدوائر المحلية من اللحاء الجديد الفئران الكبار فعلا باستخدام البروتوكول الموصوفة هنا10،19،،من2021، 22-على الرغم من أن "الرسم التخطيطي الأسلاك" بعيدة عن الاكتمال، وامسح بعض أنماط أو ظهرت قواعد. وعلاوة على ذلك، على الرغم من اختلاف بعض التفاصيل، هذه القواعد المشتركة بين نوعين من أنواع الثدييات (الفأر والقط) وعبر عدة مناطق نيوكورتيكال، مما يتيح وضع اللبنات الأساسية التي من المحتمل أن تكون تنطبق بالتساوي على البشرية اللحاء الجديد. يتم استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لتوسيع فهمنا للخريطة الوظيفية للدوائر القشرية بتحديد الخلايا العصبية presynaptic وبوستسينابتيك المشاركة في الاتصالات في المناطق التي لم تدرس بالتفصيل من قبل، باستخدام بروتوكول تتيح الحفاظ على الأنسجة ممتازة والانتعاش المصبوغة ملحوظا في أنسجة المخ الكبار. تم جمع البيانات عن خصائص الخلايا العصبية في هذا حقلاً فرعياً والدوائر المحلية في CA2 مع هذا الأسلوب عن طريق الجمع بين التسجيلات الكهربية داخل الخلايا (التسجيلات إرفاقها مع ميكروليكتروديس حادة) مع بيوسيتين ملء، الفلورة وإجراءات غذائها ومفصلة للغاية--الخلايا العصبية عمليات إعادة البناء، مما يتيح إجراء مقارنة مباشرة مع المجاورة كاليفورنيا مناطق23،،من2425.
الأسلوب الموصوفة في هذه المقالة قد وضعت على مر السنين للحصول على تشريح الخلايا العصبية مفصل يتيح التصنيف الصحيح للخلايا وذات جودة عالية ودقة عمليات إعادة البناء لكلا بهم الجذعية ومحواري العرش، البيانات التي يمكن أن تكون يرتبط الكهربية البيانات التي تم جمعها من تسجيلات المقترنة باستخدام أقطاب كهربائية حادة. البروتوكول غذائها وقد الأمثل للحفاظ على أولتراستروكتوري من الخلايا العصبية والحصول على استرداد ممتازة الجذعية (بما في ذلك العمود الفقري) والعرش محواري. على سبيل المثال، يعطي مبدأ تقنية التثبيت المزدوج بغمر أولاً في حل مثبت وثانيا بعد تحديد في أكسيد الاوزميوم على النقيض جيدة للفحص المجهري الخفيفة26. تتم إضافة كمية صغيرة من جلوتارالديهيدي وحمض البكريك الحل إلى الحل مثبت لتعزيز اختراق جسم والحفاظ على أولتراستروكتوري الخلايا النحو المقترح في دراسة سابقة27. كما يوفر permeabilization الدماغ الشرائح باستخدام طريقة تجميد أذاب جنبا إلى جنب مع حماية البرد مع السكروز، بدلاً من منظفات تقليدية، الحفاظ على الأمثل للأنسجة لتحليل مفصل المورفولوجية للخلايا مسجل. وباﻹضافة إلى ذلك، تحسين التصور خاصة من الهياكل الدقيقة جداً بتقليل تلوين الخلفية، مع إينكوبيشنز مع بورهيدريد الصوديوم (نأبه4) وفوق أكسيد الهيدروجين (H2O2). إضافة كلوريد النيكل (نيكل2) الفجل البيروكسيديز (HRP) كرد فعل للحصول على منتج رد فعل صباغ أسود يزيد أيضا من التباين.
البروتوكول التالي يصف الإجراءات المستخدمة للتأكد من الحفاظ على النسيج ممتازة ومفصلة للغاية العصبية 3D عمليات إعادة البناء بعد التسجيلات داخل الخلايا في المختبر. وصف إعداد شريحة، حادة التسجيلات المزدوجة داخل الخلايا باستخدام أقطاب وإجراءات النسيجي اللاحقة المستخدمة في المختبر قد ذكر سابقا28. على الرغم من أن البروتوكول ينطبق على الخلايا مليئة إينتراسيلولارلي بيوسيتين 450 – 500 ميكرومتر شرائح سميكة، يمكن استخدام نفس البروتوكول عقب التسجيلات كامل الخلية. ومع ذلك، سيؤدي إلى استخدام شرائح أرق في عمليات إعادة البناء أقل اكتمالا من الخلايا.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للنظام الأساسي "وزارة الداخلية البريطانية" فيما يتعلق بالحيوان عام 1986 قانون الإجراءات العلمية.
1-تحديد الكالسيوم ملزمة البروتين أو محتوى البروتين إينتيرنيورونس والتصور بيوسيتين عقب التسجيلات الكهربية وشغل بيوسيتين
ملاحظة: في نهاية التسجيلات الكهربية، ثابتة الشرائح التي تحتوي على خلايا مليئة بيوسيتين بين عشية وضحاها قبل إجراءات النسيجي. سيتم استبدال الحل مثبت مع تغيير واحد من 0.1 متر العازلة الفوسفات في صباح اليوم التالي، إذا نفذ بقية الإجراء في يوم آخر، للحيلولة دون تلف الأنسجة. يجب أن يتم تثبيت الحل (بارافورمالدهيد 4%، 0.2% المشبعة حمض البكريك الحل، الحل glutaraldehyde 0.025% في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (PB)) جديدة في يوم التسجيلات للحصول على أفضل النتائج.
- في نهاية التسجيل الكهربية، بعناية التقطت فوق الشريحة التي تحتوي على الخلايا مسجل مع الرسام ووضعه في وعاء يحتوي على السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام).
ملاحظة: تفاصيل البروتوكول المستخدم لإعداد شريحة والتسجيلات داخل الخلايا باستخدام أقطاب حادة قد سبق وصفها28. - في غطاء دخان، بعناية تلتقط شريحة الدماغ مع الرسام ولفه على قطعة صغيرة من ورق الترشيح نوعية جيدة. وضع قطعة أخرى من الورق تصفية ترطب على الشريحة ثم ضع قطعتين من ورق الترشيح الرطب في وعاء بلاستيك صغير يحتوي على 5-10 مل من حل مثبت ومخزن في الثلاجة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تعد حلاً الجيلاتين في الماء المقطر. 20 مل ماء المقطر في كوب على طبق ساخن والحرارة عليه إلى 60 درجة مئوية. إضافة تدريجيا 2.4 غرام جيلاتين بالماء والانتظار حتى يذوب والسماح لها تبرد إلى 35 – 40 درجة مئوية قبل استخدامها لمنع تلف الأنسجة.
- استبدال الحل مثبت مع 2 مل من 0.1 م الجريدة الرسمية. ضع الشريحة في طبق بتري وقطع الأنسجة الزائدة أي بعيداً مع شفرة المبضع. مكان الأنسجة قلصت في طبق بتري (قطرها 9 سم، الارتفاع 1.4 سم)، وضمان أن تقع شقة مع لا طيات أو شقوق، وإزالة الزائدة المخزن المؤقت باستخدام الرسام جافة.
- تغطية الأنسجة بمحلول الجيلاتين الدافئ ومكان طبق بيتري على كتلة مجمدة لتبرد بسرعة الحل.
- استخدام مصباح زاوية-اتزان توفير التباين، ابحث عن طريق إلى جانب الطبق والحفاظ الشريحة مسطحة باستخدام الضغط الخفيف من الرسام ما يرام حتى يبدأ الجيلاتين لتعيين.
ملاحظة: الجيلاتين يمكن إعادة ذاب إذا لا تكمن الأنسجة المسطحة. قد تتم إزالة أي عيوب على سطح الجيلاتين الناجمة عن إزالة الرسام كما أنه يقوي من ذوبان الطبقة السطحية بلطف بتحريك لمبة مصباح قريبة من السطح لبضع ثوان. - تحريك طبق الجيلاتين الإعداد للثلاجة وترك عند 4 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
- في غطاء دخان، قطع كتلة صغيرة (~ 1 × 1 سم) التي تحتوي على الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين للطبق باستخدام شفرة المبضع، رفع الكتلة باستخدام ملعقة صغيرة ووضعها بعناية في الحل مثبت نفسه ولكن الطازجة المستخدمة لتحديد الشرائح لمدة 30 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية .
- أغسل كتلة الجيلاتين في 5 مل PB 0.1 متر ثلاث مرات، والجاف باستخدام قطعة من نسيج الورقة وعصا الجانب كتلة يصل (أي، مع الأنسجة في الجزء العلوي) إلى فيبرتوم تشاك استخدام superglue.
- إزالة الغراء الزائد بقطعة من ورق الترشيح واستخدام شفرة مشرط لقطع زوايا كتلة، تاركة شكل الماس.
- الفرع الشريحة في 50 ميكرون سمك استخدام فيبرتوم ووضع كل مقطع بعناية في قنينة زجاجية تحتوي على السكروز 10%.
- بدقة التقاط مقطع من القنينة، وضعه شقة في غطاء طبق بيتري. استخدام مجهر تشريح وشفرة المبضع طازجة، إزالة الجيلاتين من حول المقطع والعودة القسم إلى قنينة تحتوي على 2 مل الطازجة السكروز 10%
ملاحظة: من المهم لإزالة الجيلاتين قدر ممكن في هذه المرحلة للحد من انكماش الأنسجة أثناء الجفاف الخطوة (الخطوة 1.37). - Cryo-حماية المقاطع في حل والغليسيرول السكروز المستندة إلى "الجريدة الرسمية م" 0.1 في درجة حرارة الغرفة التي تفرخ لهم لمدة 10 دقائق في محلول السكروز 10%، 20 دقيقة في محلول والغليسيرول السكروز-6% 20% مرتين وأخيراً 30 دقيقة في حل والغليسيرول السكروز-12% 30% مرتين في إطار التحريض المستمر.
- وضع المقاطع شقة على مستطيل صغير من رقائق القصدير باستخدام الرسام. إزالة أي سوائل زائدة من الفروع وإضعاف رقائق القصدير بعناية في قطعة.
- اضغط قطعة قريبة من سطح النتروجين السائل بدون لمس السطح لمدة 30 ثانية ثم السماح المقاطع ذوبان الجليد تماما لحوالي 30 س. تكرار التجميد أذاب آخر مرتين.
- إزالة كافة المقاطع مع الرسام ووضعها في قنينة زجاج الذي يحتوي على 2 مل PB 0.1 متر تحت التحريض المستمر يغسل السكروز الزائدة.
- إزالة الجريدة الرسمية مع ماصة باستور واحتضان الفروع في 2 مل ح مائي 1%2س2 عن 30 دقيقة يغسل المقاطع في 2 مل من PB 0.1 م 3 × 5 دقيقة.
- إزالة PB 0.1 م مع ماصة باستور وإضافة بورهيدريد الصوديوم 1% (4من نأبه) في الجريدة الرسمية م 0.1.
ملاحظة: ليس في آب القنينة، كنابة الحل4 يعطي قبالة غاز الهيدروجين. - إزالة بورهيدريد الصوديوم مع ماصة باستور وتغسل المقاطع في دقة 2 مل من الجريدة الرسمية م 0.1 5 × 5 دقيقة.
- استبدال PB 0.1 M مع 10% مصل الماعز العادي (خ ع) في الجريدة الرسمية 0.1 م لمدة 30 دقيقة.
- إزالة المصل الماعز واحتضان الفروع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في خليط من الماوس [مونوكلونل] وارنب [بولكلونل] أجسام تتكون في حل أية بي سي.
ملاحظة: يتم عرض قائمة بالأجسام المضادة الأولية المستخدمة في الدراسات السابقة في الجدول 1 في بوتشير et al. (2014) 29. - احتضان الفروع ح 2 في الظلام في خليط أجسام الثانوي المسمى فلوريسسينتلي (جدول المواد).
- تحميل المقاطع على الشرائح في تصاعد المتوسطة وتغطي مع ساترة.
- التقاط صور للأسفار وسمها في 40 X التكبير (1B الشكلب).
- بعد الأسفار التصوير، ضع الشريحة في طبق بتري زجاجية التي تحتوي على برنامج تلفزيوني وإزالة بعناية ساترة. ثم تغسل الأجزاء خارج الشريحة باستخدام نبضات لطيف لبرنامج تلفزيوني من ماصة باستور. وضع المقاطع في قنينة زجاجية نظيفة تحتوي على برنامج تلفزيوني.
- تنفيذ رد فعل avidin-برنامج الصحة الإنجابية بحضانة أولاً المقاطع في ABC على الأقل 2 ح لتضخيم المنتج رد فعل برنامج الصحة الإنجابية.
- إعداد الحل 3.5 ديامينوبينزيديني (DAB) عن طريق إضافة قرص واحد إلى 5 مل ماء المقطر.
- أغسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقائق ومن ثم مع المخزن المؤقت تريس مرتين للحد الأدنى 10 إزالة المخزن المؤقت تريس بعد الغسيل الأخير.
- بسرعة إضافة قطره واحدة من 8% نيكل2 الحل إلى الحل الدأب، "الماصة؛" الحل والخروج لخلط وإضافة 1 مل من هذا الحل بسرعة عبر المقاطع. احتضان الفروع في الحل الدأب/نيكل2 لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 10 ميليلتر من 1 ٪ ح2س2 إلى الحل الدأب. السماح بأن رد الفعل على المضي قدما في الظلام تحت التحريض المستمر لحوالي 1 إلى 2 دقيقة ومراقبة وسم الخلايا المملوءة مجهر تشريح.
- وقف رد الفعل عن طريق إزالة الدأب/نيكل2/H2س2 الحل وتغسل الأجزاء مع المخزن المؤقت تريس مرتين لمدة 5 دقائق.
- في غطاء دخان، ضع دائرة صغيرة من ورق الترشيح في طبق بتري ويضعف ذلك مع PB 0.1 متر. رفع المقاطع واحد في كل مرة من الزجاج فيال استخدام الرسام، ومكان لهم شقة بعناية على الورقة.
- تغطية المقاطع مع دائرة ترطب أخرى من ورق الترشيح وإزالة المخزن المؤقت الزائدة بلمس المناديل الورقية إلى السطح بلطف.
- تطبيق قطرات 8 – 9 من 1% أكسيد الاوزميوم في الجريدة الرسمية م 0.1 إلى الورقة الأعلى ويغطي الطبق والاحتفاظ بهم في غطاء الدخان لمالا يقل عن 30 دقيقة، ولكن لا يزيد عن 1 ح.
- افتح طبق بتري ورفع الورقة تصفية أعلى. رفع المقاطع بعناية واحد في وقت واحد مع الرسام، وضعها في قنينة زجاج وشطف لهم في الماء المقطر مرتين.
- التخلص من النفايات أكسيد الاوزميوم على نحو ملائم. شطف جميع المعدات يمكن التخلص منها ووضعها في حاويات مناسبة.
- وضع كل باب شقة على الشريحة الزجاجية، وساترة المقاطع. نقل الشريحة إلى طبق بيتري، ضع قنينة زجاجية فارغة فوق ساترة الاحتفاظ به في مكان وتغطي مع 50 ٪ من الكحول. وبعد 15 دقيقة، إزالة الشريحة من الحل وإزالة الأجزاء من الشريحة. مكان المقاطع مرة أخرى على الشريحة ومن ثم ضع الشريحة في الكحول 70% للحد الأدنى 15 تكرار نفس العملية مع 95%، وأخيراً حل الكحول 100%.
- في أعقاب خطوة الجفاف، نقل المقاطع إلى قنينة زجاج الذي يحتوي على الكحول 100% على شاكر في غطاء دخان. استبدال الحل الكحول بأكسيد البروبيلين (ج3ح6س) وتغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل الأخير، تبقى ~ 2 مل أكسيد البروبيلين في القنينة وإضافة الراتنج (نسبة 1:1). ضمان أن يتم حله الراتنج وإبقاء الأبواب تحت التحريض المستمر لمدة 30 دقيقة.
- وضع كل مقطع في بلانكيت ألومنيوم التي تحتوي على راتنجات الإيبوكسي باستخدام عصا خشبية واحتضان بين عشية وضحاها.
ملاحظة: لا تترك المقاطع في الراتنج أطول من 24 ساعة لتجنب مخاطر إلحاق أضرار في بعض المقاطع. - مكان بلانكيت على صفيحة ساخنة لحوالي 10 دقيقة تلتقط كل قسم بعصا خشبية ووضعها على شريحة نظيفة. الاحتفاظ بالتوجه لكل مقطع متناسقة باستخدام مجهر تشريح. ضع ساترة على المقاطع. ضع الشريحة في الفرن ح 48 في 56 درجة مئوية لعلاج.
2-3D إعادة البناء العصبية
ملاحظة: يتم استخدام البرمجيات نيورولوسيدا. الإرشادات الواردة أدناه تنطبق فقط على نظام تعمير العصبية محددة (جدول المواد). تتم مطابقة المقاطع التي تم الحصول عليها من القطع قبل إعادة البناء باستخدام مجهر.
- ضع شريحة على المسرح وآمنة مع مقطع المرحلة وفتح برنامج التعمير العصبية. انقر فوق علامة التبويب الاكتساب وحدد الصورة الحية.
- قياس سمك كل مقطع باستخدام 100 × النفط الهدف العدسة. قم بتدوين القيمة على z-المتر في أعلى وأسفل كل قسم وحساب سمك الفرع كالفرق بين القيمتين.
- استخدام هدفا منخفضة-التكبير للتركيز على المقطع الصفحة الرئيسية التي تحتوي على خلايا الجسم. ثم استخدم هدفا 100 x والتركيز على جسم الخلية وانقر في وسط لوضع علامة النقطة المرجعية.
- حدد من علامة التبويب تتبع ، مدير قسم المسلسل. ثم حدد إنشاء قسم جديد (+ رمز) في إطار إدارة قسم المسلسل . قم بإدخال العدد من الأبواب. اسم كل قسم في اﻻحداثي الصحيح وأدخل سمك قطع تقاس في "الخطوة 2، 2".
- لتتبع سوما في 3D باستخدام 100 X الهدف، حدد كفاف من علامة التبويب تتبع وحدد كفاف الجسم الخلية . استخدام الجويستيك لنقل التركيز إلى أعلى جداً من جسم الخلية. ضع النقاط بواسطة النقر فوق حول محيط الجزء الموجود حاليا في التركيز. انقر بالزر الأيمن وحدد كفاف الوثيق لإنهاء هذا المخطط الأولى. كرر هذه العملية في زي مختلف المواقف حتى يتم الوصول إلى الجزء السفلي من جسم الخلية (الشكل 2).
ملاحظة: تحديد تصور 3D في التبويب التتبع لتصور الجسم خلية في 3D. - لتتبع الجسم خلية في 2D باستخدام 100 X الهدف، حدد الجسم خلية من الخلايا العصبية القائمة في علامة التبويب تتبع التركيز على منتصف الجسم خلية. ضع النقاط بواسطة النقر فوق حول محيط الجسم الخلية. لإكمال الجسم خلية، انقر بالزر الأيمن واختر إنهاء جسم الخلية.
- لتتبع أربور الجذعية، حدد تغصن أو تغصن قمي في قائمة الخلايا العصبية . أولاً تتبع قطعة قصيرة، الأولى لكل تغصن باستخدام عجلة الماوس لضبط قطر المؤشر بحيث تتطابق مع قطر تغصن. تتبع على طول كل dendrites استخدام الجويستيك للانتقال عبر هذا الباب وعجلة الماوس لضبط القطر من اقتفاء أثر.
- التحقق من المحاذاة لاقتفاء أثر مع الصورة الحية المجهر، وتعديل إذا لزم الأمر، لا سيما بعد التحرك باستخدام الجويستيك. في علامة التبويب تتبع ، حدد محاذاة التتبع، انقر فوق التعقب وثم انقر فوق في الموقع الصحيح.
- عندما يتم التوصل إلى عقده في الشجرة، انقر بالزر الأيمن واختر تريفوركاتينج أو العقدة بيفوركاتينج من القائمة المنسدلة.
- عندما تم التوصل إلى النهاية لفرع، اختر إنهاء من القائمة المنسدلة-لأسفل في القائمة العصبية . حدد نوع النهاية الصحيحة، أي.، إنهاء عالية، وإنهاء العادي أو لآه المنتهي تيسيرا لمطابقة عبر المقاطع.
- تقليل التكبير في المجهر مجرد dendrites كافة في المقطع الحالي وقد تم تتبع، حدد علامة التبويب الحرة الفرح والانتقال إلى قسم الذي يطابق مباشرة أعلى أو أسفل المقطع المكتملة.
- لتحديد نقاط مطابقة بين dendrites في قسم الذي يطابق القسم المكتمل، انقر فوق علامة التبويب نقل وتحديد نقاط المباراة. حدد العدد من النقاط بحاجة إلى أن تكون مطابقة (ثلاثة أو أكثر من نقاط المفضل) ومن ثم اضغط موافق. انقر فوق إنهاء لفرع المكتملة وثم انقر فوق الفرع. كرر هذه العملية لكل نقطة في المباراة. كرر هذه العملية على 100 X التكبير التأكد من مطابقة دقيقة.
- إضافة فروع مطابقة للمقطع السابق مباشرة بواسطة النقر بالزر الأيمن على إنهاء. حدد إضافة إلى إنهاء عند خطوط الفرع مع فرع تتبع المكتملة والتتبع كما هو موضح سابقا.
- مرة واحدة وقد تم تتبع جميع dendrites لكل قسم، تتبع إكسون استخدام نفس العملية عن طريق تحديد محور عصبي من القائمة العصبية .
- اذهب إلى قسم المنزل ، محاذاة إعادة الإعمار مع الصورة الحية المجهر وتحديد معالم من علامة التبويب التتبع تحديد حدود منطقة الحدودية/كونتور/طبقة محددة مسبقاً وانقر للتتبع على طول محيط. حدد نهاية مفتوحة كفاف. تتبع جميع الطبقات المرجوة والخطوط العريضة في المنطقة.
- استخدام 3D تصور في التبويب التتبع لتصور عمليات إعادة البناء في 3D.
- لتسجيل الفيديو من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (1 فيديو)، فتح إعادة بناء ثلاثي الأبعاد وفتح إنشاء أفلام. تعيين ملف وجهة والمطلوب سرعة دوران. من المستحسن تعيين الاستدارة إلى 270°. حدد بدء التسجيل، سجل لبضع ثوان، ثم انقر فوق استدارة تلقائي. حدد إيقاف التسجيل عند الاقتضاء. تحرير الفيديو مع برنامج (جدول المواد) تحرير فيديو.
- لتصدير الملفات إلى ملفات Tiff أو JPEG، حدد الملف | تصدير | تتبع الصادرات كصورة. اختر نسبة ميكرومتر/بكسل وحدد صالح. حدد لون خلفية وحدد الملف. اسم الملف، وحدد Tiff أو JPEG واضغط حفظ. تصدير الملفات إلى ناقل الملفات، حدد الملف | تصدير | تتبع الصادرات كناقل الملفات.
- استخدام برمجيات تحليل تعمير العصبية لإجراء تحليلات شكلي.
- لتحليل الجذعية الأشجار والحصول ديندروجرام، افتح الملف في مستكشف نيورولوسيدا. حدد تحليل | هيكل وحدد ديندروجرام من القائمة المنسدلة (الشكل 3).
- للقيام بتحليل شكلي شاملة لعمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (فرع التعقيد، كميات من فروع واتفاقات، المساحة السطحية)، افتح الملف في البرنامج. في علامة التبويب عرض ، انقر فوق تحديد الكل. حدد علامة التبويب تحليل . ثم حدد بنية و تحليل هيكل فرع.
3-حل المشاكل
- تغيير إعدادات الكاميرا. للحصول على أفضل النتائج، تعيين وقت التعرض إلى أقل من 100 مللي واكتساب وإزاحة قريبة من 0 قدر الإمكان.
- إذا لم يعرض برنامج التعمير العصبية تلقائياً ملامح تتبع كهيئة خلية ثلاثية الأبعاد في تصور 3D في علامة التبويب تتبع ، حدد تحديد كائنات في علامة التبويب تتبع ، اضغط باستمرار على المفتاح Ctrl في لوحة المفاتيح و انقر على جميع معالم رسمها، انقر بالزر الأيمن وثم حدد تعيين هيئة خلية في القائمة المنسدلة.
- لضبط z-معالم غصن الفردية، وحدد الشجرة (تحديد كائنات في علامة التبويب تتبع ) وتعيين المنسدلة z-تسوية جميع النقاط عن طريق القائمة بزر الماوس الأيمن. حدد تعديل موقف z، ثم حدد قيمة z التحول وأدخل القيمة المطلوبة.
- إعادة تنظيم عمليات إعادة البناء باستخدام 'الانتقال إلى' في علامة التبويب ' نقل' عندما يكون ذلك ضروريا لتحريك مسافة كبيرة فوق التعقب.
- إضافة نقاط إضافية عند أي نقطة أثناء عملية إعادة الإعمار. حدد الفرع حيث العقدة توضع في (تحديد كائن في تتبع علامة التبويب وانقر فوق الفرع)، انقر بزر الماوس وحدد إدراج عقده في "الشجرة المحددة". ثم انقر فوق في الموقع الصحيح على الفرع.
- عند إعادة بناء العصبية معقدة، تتبع فروع مطابقة فردياً ولصق لهم في وقت لاحق لتحديد أسهل من الفروع. تتبع الفروع في القسم الجديد على حدة ثم قم بإرفاق هذه الفروع إلى فروع المطابقة في المقطع السابق التي تحوم حول إنهاء الفرع إلى أن تقسم، انقر بالزر الأيمن واختر لصق، ثم تحوم فوق إنهاء هذا الفرع هو أن تقسم إلى وانقر فوق.
- إذا كان يتم تتبع فرع تحت نوع الشجرة خاطئة، حدد الشجرة، انقر بالزر الأيمن وحدد تغيير نوع شجرة، وحدد نوع الشجرة الصحيحة.
- إذا كان يتم بشكل غير صحيح وضع نقطة، أداء Ctrl + Z، أو انقر فوق الزر تراجع في قائمة التتبع لإزالة النقطة الأخيرة. ومع ذلك، لن يعمل هذا الإجراء إذا تم استخدام الجويستيك للانتقال عبر المقطع قبل محاولة إزالة نقطة. وفي هذه الحالة، قد تتم إزالة هذه النقطة عندما يتم إنهاء الفرع. حدد الفرع (الصحافة تحديد الكائن واضغط على الفرع)، تحوم فوق نقطة لإزالتها، انقر بالزر الأيمن واختر إزالة نقطة.
- إذا كان غير متأكد ما إذا كانت تتم مطابقة فرعين، أما 1) استخدام تصور ثلاثي الأبعاد في علامة التبويب تتبع للتحقق من ما إذا كانت الفروع مطابقة في z-الطائرة، أو 2) استخدام ميزة إظهار المرافقة في إدارة قسم المسلسل لعرض المقاطع فورا أعلاه وأسفل المقطع الحالي باللون الرمادي.
- إذا كان يتم عكس مقطع، انتقل إلى أدوات في علامة التبويب " التتبع " وحدد ضبط القياس XY وتغيير المحور س إلى-1. ثم حدد الصحيح Z-انكماش وتغيير محور ع إلى-1. ثم تتبع الفروع كالمعتاد. تذكر لعكس هذه التغييرات عند الانتقال إلى مقطع الذي كان الاتجاه الأصلي. تغيير في العاشر--وذد المحور المحور لن تغير فرع إنهاء التسميات، حتى تأخذ الرعاية عند الربط أن يجري استخدام النهايات الصحيحة.
- يمكن تصحيح انكماش Z الصحيح، إذا لم يكن هناك فرق كبير بين المقطع قطع سمك وسمك المحملة قياس. في علامة التبويب تتبع ، حدد أدوات، ثم تصحيح Z-الانكماش، وأدخل معامل انكماش لمحور ع كتمثيل عشري من سمك قطع مقسوماً على سمك المحملة.
Representative Results
امتلأت الخلايا العصبية في CA2 هيبوكامبال بيوسيتين عقب التسجيلات الكهربية (الأرقام 1Ac، الإعلان و 1Bc، دينار بحريني). الشرائح كانت ثابتة بين عشية وضحاها عقب التسجيلات وكشفت الكيمياء العصبية وتوصيف الخصائص المورفولوجية للخلايا العصبية بعد البروتوكول هو موضح هنا.
تحددها بالبروتين الكالسيوم أو محتوى البروتين من إينتيرنيورونس شغلها حضانة الشرائح مع الأجسام المضادة الأساسي أولاً ثم مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى فلوريسسينتلي. خصائص إطلاق إينتيرنيورونس خلال التسجيلات سوف تملي اختيار الأجسام الأولية المستخدمة. استخدمت AMCA عبدين لتصور إينتيرنيورون مليئة بيوسيتين واستخدمت الماوس المضادة fluorescein isothiocyanate (فيتك) والماعز الأرنب المضادة تكساس الأحمر (TR) لتميز الكيمياء العصبية إينتيرنيورونال (1Bb الشكل).
بعد التصور الأسفار، استخدمت بروتوكولا HRP للكشف عن بيوسيتين (1Ab الشكل). ثم وجه تشريح مفصل غرامة إينتيرنيورونس CA2 في 3D باستخدام برنامج إعادة إعمار العصبية (الشكل 2 و الشكل 3 ألف). يتم عرض شريط فيديو لإعمار خلية سلة المسجلة وشغلها في CA2 بشكل ثلاثي الأبعاد في الفيديو. الخلايا العصبية في عمليات إعادة البناء كانت تعتبر كاملة إذا اقتصرت كلا من العرش الجذعية ومحواري داخل عمق شريحة 450-500 ميكرومتر. وقيمت تلطيخ أربور محواري الفقيرة بوجود فروع مبتوراً بنهايات مفتوحة في الأعلى أو أسفل الشريحة أو تلطيخ التي كانت تقتصر على محور عصبي الجزء الأول والفروع القريبة جداً. ويمثل الرقم 4 أمثلة جيدة وفقيرة HRP المصبوغة التالية بيوسيتين مرئيات.
ويمكن إجراء تحليل شكلي لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (الشكل 3) إظهار تعقيد فرع سوما مساحة والمساحة وحجم العرش الجذعية ومحواري.
الشكل 1 : إعادة بناء الخلايا العصبية من نوعين من الخلايا سلة المسجلة وشغلها في منطقة CA2 هيبوكامبال ويرتبط الكهربية البيانات التي تم الحصول عليها بعد التسجيلات داخل الخلايا في المختبر. وقد تم تعديل هذا الرقم من23،الدراسات السابقة24. حتى الطبقة Oriens، SP الطبقة Pyramidale، ريال الطبقة رادياتوم، حركة الطبقة لاكونوسوم موليكولاري. (أ) Aa: إعادة الإعمار لخلية سلة CA2 مع أربور الجذعية ومحواري مقيد باستخدام أنبوب رسم (1000 X). Dendrites باللون الأسود، واكسون باللون الأحمر. Ab: صورة لسلة مليئة بيوسيتين الخلية يتبع البروتوكول HRP عبدين الموصوفة هنا. التيار المتردد: تتبع الممثل استجابات الجهد هايبربولاريزينج وديبولاريزينج الحقن الحالية لخلية سلة CA2 مع أربور الجذعية ومحواري مقيد. م: سجلت المثال هرم CA2 لتضييق أربور سلة خلية اتصالات استخدام أقطاب حادة. المتوسطات إمكانات مركب متشابك بعد ضادات (ابسب) إظهار الاكتئاب القطار مختصر الظاهر خلال الاستجابات للقطارات من المسامير الثلاثة. (ب) مكتبة الإسكندرية: إعادة الإعمار 2D خلية سلة CA2 مع العرش الجذعية ومحواري واسعة النطاق باستخدام أنبوب رسم (1000 X). شجرة الجذعية هذه الخلية سلة (بالأسود) مدد إشعاعيا من خلال جميع طبقات المنطقة CA2 وهكذا أفقياً في SP في منطقتي CA2 و CA3. تغصن أفقي واحد التوصل أيضا إلى المنطقة CA1. إكسون (باللون الأحمر) إلى منطقتي CA3 CA1. Bb: بيوسيتين شغلها (AMCA تلطيخ) كان سلة الخلية الكهروضوئية-إيمونوبوسيتيفي (فيتك تلطيخ) وبناء القدرات-إيمونونيجاتيفي (تكساس-الأحمر تلطيخ). قبل الميلاد: تتبع الممثل استجابات الجهد هايبربولاريزينج وديبولاريزينج الحقن الحالية لخلية سلة CA2 مع أربور الجذعية ومحواري واسعة. دينار بحريني: المتوسطات ابسب مركب إظهار تيسير تدريب قصيرة واضحة خلال الاستجابات للقطارات من المسامير الثلاثة. يمكن العثور على أمثلة لأنواع أخرى من إينتيرنيورونس التي سجلت في CA2 في25،الدراسات السابقة30. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : 3D خلية هيئة التعمير- (أ) تتبع 3D من جسم الخلية. عرض لملامح مختلفة تتبع في مناصب مختلفة z في حين تركز خلال جسم الخلية. (ب) عرض ثلاثي الأبعاد لمعالم مختلفة. (ج) عرض ثلاثي الأبعاد للجسم خلية بزاوية مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحليل مورفوميتري لعمليات إعادة البناء في 3D الخلايا العصبية. (أ) إعادة الإعمار 3D خلية سلة أربور الضيقة CA2. يتم تمثيل كل فرع الجذعية بلون (الأخضر، والأزرق والأحمر والوردي) ومحور عصبي في الضوء الأزرق. (ب) ديندروجرام الخلية سلة تمثل عدد الفروع الجذعية وطول كل قطعة الواردة ضمن المجالات متحدة المركز مع سوما وفترات 100 ميكرومتر من سوما. الألوان على ديندروجرام تقابل تلك من dendrites في المثال (ج) (أ) تحليل شكلي يقوم على الخلايا الهرمية CA2 (مقتبس من دراسة سابقة23). وقد رسم عدد الفروع الجذعية مقابل المسافة من سوما CA2 الخلايا الهرمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : أمثلة جيدة (A) والفقراء (ب (HRP تلطيخ. (أ) كشف الانتعاش بيوسيتين إينتيرنيورون شغلها جيد جداً في CA2. جسم الخلية (CB) هو مظلم الملون ومخططات واضحة. Dendrites هي الخرز وعرض بعض الأشواك (ممثلة بواسطة النجوم الحمراء). أربور محواري (A) كثيفة ويعرض بتونس الصغيرة. (ب) مثال سوء الجذعية ومحواري تلطيخ الخلايا الهرمية 2 في CA2. تلطيخ بناء القدرات الإغماء مع لا مخطط واضح. تلوين الفقراء كثيرا ما يرتبط مع التسجيلات الكهربية أقصر مما إلى حضور عدد قليل جداً من الفروع مليئة بيوسيتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1: 3D التعمير العصبية لخلية سلة CA2 مع تقييد أربور الجذعية (المشار إليها أيضا كخلية سلة أربور الضيقة CA2) مع سوما لها في الطبقة pyramidale، dendrites التي تغطي جميع الطبقات ومحور عصبي في CA2 pyramidale الطبقة والطبقة المتاخمة أورينس ورادياتوم- فروع قليلة جداً تصل إلى oriens الطبقة CA3 الدانية و CA3 الطبقة بيراميدالي. هذه الخلية كانت مليئة بيوسيتين عقب التسجيلات الكهربية وتم تجهيز الأقسام مع عبدين-برنامج الصحة الإنجابية بعد البروتوكول هو موضح هنا. وعثر فقط محور عصبي داخل عمق الشريحة سبب التقطيع،، على الرغم من dendrites سليمة. Dendrites بالوردي الداكن ومحور عصبي في الأبيض. تم إضافة حدود الطبقة والمنطقة في بداية الفيديو. 3D التعمير بجورجيا إيكونوميديس 3D فيديو بواسطة فالك سفينيا. الفيديو المسجلة مع برنامج إعادة إعمار العصبية كما ورد في خطوة 2.17 وتحريرها باستخدام برامج تحرير فيديو. وصلة للفيديو:30. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
| الحلول المستخدمة | تكوين/تعليمات |
| تثبيت الحل | بارافورمالدهيد 4%، 0.2% المشبعة حمض البكريك الحل، الحل glutaraldehyde 0.025% في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (PB) |
| 0.1 متر العازلة الفوسفات درجة الحموضة 7.6 | إضافة 100 مل رصيد المخزن المؤقت 1 م الفوسفات إلى 900 مل ماء المقطر |
| فوسفات مخزنة المالحة (PBS) الأس الهيدروجيني 7.4/7.5 | أضف 10 مل من المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 م، ز 0.2 من بوكل وز 8.76 من كلوريد الصوديوم إلى 990 مل ماء المقطر |
| تريس المخزن المؤقت درجة الحموضة 7.5 | حل ز 5.72 هيدروكلوريد تريس وز 1.66 قاعدة تريس في 50 مل ماء المقطر. ثم جعل يصل إلى 1 لتر بالماء المقطر. |
| الحل مثبت glutaraldehyde وبارافورمالدهيد مخزنة بشكل مؤقت | بارافورمالدهيد 4%، 0.2% المشبعة حمض البكريك الحل، الحل glutaraldehyde 0.025% في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 متر. |
| حل أية بي سي | الحل أن تكون على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام من مجموعة أية بي سي. إضافة 1 قطره حل A و 1 قطره من حل ب إلى 2.5 مل من برنامج تلفزيوني. |
| راتنجات الإيبوكسي دوركوبان: | جعل الأواني 20: 20 غراما من العنصر ألف، 20 غراما عنصر ب، غ 0.6 المكون ج وز 0.4 العنصر د- |
| حماية الرصيد من الانسكابات التي تغطي اللوحة مع دائرة من ورق الترشيح. تزن بدقة الكواشف داخل دورق تريبور بالنسب المذكورة أعلاه. مزيج دقيق من شدة التحريك باستخدام اثنين من العصي الخشبية لمدة 5 دقائق على الأقل. ينبغي أن يصبح الخليط لون بني داكن كثافة موحدة. ضع في الكأس في الفرن في ~ 50 درجة مئوية لمدة أقصاها 10 دقائق لإزالة فقاعات الهواء أكبر عدد ممكن. ملاحظة: سوف تبدأ الراتنج علاج إذا كنت ترك الكأس في الفرن أكثر من 10 دقيقة صب الراتنج في الأواني البلاستيكية أو المحاقن 5 مل والتاريخ لهم وتخزينها في الثلاجة-20 درجة مئوية جاهزة للاستخدام. |
الجدول 1: جدول للحلول.
Discussion
التسجيلات الكهربية في المختبر (الشكل 1 Ac،د و قبل الميلاد، د) جنبا إلى جنب مع histochemical وتمكين الإجراءات المناعي مورفولوجيا مفصلة، ملزمة البروتين الكالسيوم و وسجلت هوية إينتيرنيورونس القشرية الكبار كشف. في منطقة CA2، هذا الأسلوب يسمح بدراسة الدوائر المحلية للمرة الأولى، وكشفت عن الفئات فرعية إينتيرنيورونس التي لا تم وصفها سابقا في CA1 أو CA3: أربور الجذعية واسع ومحواري سلة الخلايا (الشكل 1B)، بيستراتيفيد الخلايا وإينتيرنيورونس SP-ريال.
تم الأمثل للحفاظ على أولتراستروكتوري من الخلايا العصبية والحصول على استرداد ممتازة الجذعية (بما في ذلك العمود الفقري) والعرش محواري البروتوكول هو موضح هنا. الخطوات الحاسمة التي تشمل استخدام أسلوب التثبيت المزدوج لتعزيز التباين للفحص المجهري الخفيفة26 وإضافة حل glutaraldehyde وحامض البكريك إلى الحل مثبت تعزيز اختراق جسم والحفاظ على الخلايا العصبية 27من أولتراستروكتوري. بيرميبيليزيشن تجميد أذاب لطيف يعطي أفضل الحفاظ على بنية دقيقة، بينما أوسميكيشن وتضمينها راتنج الحد من انكماش z-الطائرة28. وباﻹضافة إلى ذلك، تحسين تصور الهياكل الدقيقة جداً (غرامة محاور عصبية مع بتونس الصغيرة على سبيل المثال) التي تفرخ المقاطع مع ح2س2 و نأبه4 للحد من تلوين الخلفية. يمكن أيضا زيادة التباين بالإضافة إلى نيكل2 إلى رد فعل برنامج الصحة الإنجابية.
يوفر الإجراء النسيجي مفصلة هنا نتائج ممتازة من حيث إمكانية تكرار نتائج والموثوقية. ومع ذلك، ستحدد مدة التسجيلات الكهربية جودة بيوسيتين/الأسفار تلطيخ، مع أقصر التسجيلات المرتبطة عادة تلطيخ محواري الفقيرة. اختيار تسجيل البروتوكولات (التسجيلات داخل الخلايا باستخدام أقطاب حادة مقابل لقط تصحيح كامل الخلية) وقد تؤثر أيضا الاحتفاظ بيوسيتين والحفاظ عليها من تشريح غرامة.
رغم الصعوبات التي صودفت في الحفاظ على بنية دقيقة أثناء تجهيز غذائها الموصوفة هنا والوقت المستغرق لإعادة إعمار في التكبير X 100 (1-4weeks تبعاً لدرجة تعقيد إكسون) هي موضع تقدير، ويعطي هذا الأسلوب تمثيل دقيق لأقطار الجذعية ومحواري. الاستخدام أقل تطلبا البروتوكولات للكشف عن وضع العلامات بيوسيتين مفهومة، وهذه غالباً ما تستبعد التصور الواضح لفروع محواري غرامة. المنظفات وتشجيع دخول HRP عبدين للكشف عن بيوسيتين والأجسام المضادة، كثيرا ما تكون ضرورية في أبواب سميكة، ولكن يمكن تعطيل هيكل غرامة. البحث علماء الأعصاب باستمرار لأساليب شبه الآلية لإعادة الإعمار، ولكن للآن ومحاور عصبية خاصة، بيوسيتين-برنامج الصحة الإنجابية مع التعمير اليدوي يظل معيار الذهب31.
مفصلة للغاية العصبية إعادة البناء، لا سيما دقة الرسومات boutons محواري والعقد، ووجود أو عدم وجود المايلين وأعم رسم أربور محواري كاملة، مع تمثيل قطر إكسون دقيقة يتغير على طول لها طول، تقديم مزيد من المعلومات لتحديد دقيق لنوع متميز من إينتيرنيوروني. على الرغم من أن العديد من إينتيرنيورونس قد لا تناسب تماما في فئة معينة، الأسلوب الموصوفة أعلاه توفر بيانات مرتبطة في خصائص الكهربية العصبية، اللدونة القصيرة الأجل المرتبطة بنوع معين من الاتصال ومفصلة الخلايا العصبية إعادة البناء، مما يتيح الرسم التخطيطي الأسلاك، في منطقة CA2، على سبيل المثال، ينبغي أن تدرس بالتفصيل.
غالباً ما يتم تبسيط هيكل غرامة، مفصلة في النماذج الحسابية. بينما مفهومة، وهذا يؤدي إلى فقدان المعلومات التي يمكن أن تكون حاسمة في المستقبل. تحليل لعمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد مفصلة مع البيانات متشابك موازية تسمح إضافة المزيد من المعايير لتصنيف إينتيرنيورونال. يمكن إيداعها في المستودعات العامة البيانات ويستخدمها النموذجيين: استكشاف نتائج التغييرات متفرقة في قطر إكسون وميليناتيون على انتشار إمكانات العمل حسابياً.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا البحث قد تلقت تمويلاً من شركة نوفارتيس فارما (بازل) ومجلس البحوث الطبية تمنح زين أليكس تومسون، والتكنولوجيا الحيوية و "البيولوجية مجلس بحوث العلوم" (BBSRC-BB/G008639/1)، بمجتمع الفسيولوجية، والاتحاد الأوروبي أفق عام 2020 البرنامج الإطاري للبحث والابتكار تحت رقم اتفاق المنحة محددة 720270 (الدماغ البشري المشروع SGA1) وتحت رقم اتفاق المنحة محددة 785907 (الدماغ البشري المشروع SGA2). نحن ممتنون جداً لزين أليكس تومسون لإعداد البروتوكول في مناطق أخرى القشرية، وتأمين التمويل ودعمها المستمر لهذا المشروع. العرفان بالمساهمات التي قدمها أعضاء المختبر الذي ساعد الأمثل في بروتوكول استرداد وإعادة بنائها CA2 neurones: J. ديوتشارس، باويلزيك H.، هيوز أولاً دال، بانيستر ص أ، ك. أبو شقرة، H. Trigg، بوتشير ألف نون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
| Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
| 3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
| Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
| Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
| Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
| Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
| Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
| Gelatin | Sigma | 48723 | |
| Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
| Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
| Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
| Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
| Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
| Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
| Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
| Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
| Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
| Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
| Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
| Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
| Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
| Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
| Equipment used | |||
| Vibratome | Agar Scientific | ||
| C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
| Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
| X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
| Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
| 0.18 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
| 0.25 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
| Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
| Glass vials 14 mL | Fisher scientific |
References
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
- Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
- Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
- Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
- Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
- Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
- Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
- Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
- Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621 (2017).
- Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
- Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17 (2016).
- Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
- Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
- Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
- West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
- Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
- Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
- Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
- Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
- Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
- Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
- Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104 (2014).
- Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83 (2017).
- Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65 (2014).
