Summary
Her beskriver vi metoder for optogenetic manipulering av bestemte typer neurons under overvåkning av søvn/våkenhet stater i mus, presentere vårt siste verk på sengen kjernen av stria terminalis som et eksempel.
Abstract
I de senere årene har optogenetics vært mye brukt i mange felt av neuroscientific forskning. I mange tilfeller er en opsin, for eksempel kanal rhodopsin 2 (ChR2), uttrykt ved et virus vektor i en bestemt type neuronal celler i ulike grobunn-driver mus. Aktivering av disse opsins utløses ved anvendelse av lyspulser som leveres med laser eller LED gjennom optiske kabler, og effekten av aktiveringen observeres med svært høy tidsoppløsning. Forskere er i stand til å akutt stimulere neurons mens overvåking atferd eller et annet fysiologisk utfall i mus. Optogenetics kan muliggjøre nyttige strategier for å evaluere funksjon av neuronal kretser i regulering av søvn/våkenhet tilstander i mus. Her beskriver vi en teknikk for å undersøke effekten av optogenetic manipulering av neurons med en bestemt kjemisk identitet under Elektroencefalogram (EEG) og electromyogram (EMG) overvåking for å evaluere søvn fasen av mus. Som et eksempel, beskriver vi manipulering av GABAergic neurons i sengen kjernen av stria terminalis (BNST). Akutt optogenetic eksitasjon av disse neurons utløser en rask overgang til våkenhet når den brukes under REM søvn. Optogenetic manipulasjon sammen med EEG/EMG innspillingen kan brukes til å dechiffrere den neuronal kretser som regulerer søvn/våkenhet stater.
Introduction
Søvn er viktig for optimal kognitiv funksjon. Nylige funn tyder også på at forstyrrelser i søvn er forbundet med et bredt spekter av sykdommer1,2,3. Selv om funksjonene til søvn er hittil i stor grad uløst, har betydelig fremgang blitt gjort nylig for å forstå de nevrale kretser og mekanismer som styrer søvn/våkenhet stater4. I pattedyr, er det tre tilstander av årvåkenhet: våkenhet, ikke-rask øyebevegelse (REM) søvn, og rask øyebevegelse (REM) søvn. Våkenhet er karakterisert ved rask EEG-svingninger (5-12 Hz) av lav amplitude med målrettet og varig motorisk aktivitet. REM søvn er definert av langsom svingninger (1-4 Hz) av høy amplitude (delta bølger), med mangel på bevissthet og målrettet motorisk aktivitet. REM søvn er preget av relativt rask svingninger (6-12 Hz) av lav amplitude og nesten komplett bilateral muskel atonia5.
Borbely foreslo en teori om søvn-våkenhet regulering kjent som de to prosessmodell6,7. En homøostatisk prosess, også referert til som prosess S, representerer søvn trykk som akkumuleres under våkenhet og avleder under søvn. En annen prosess, referert til som prosess C, er en døgn prosess, noe som forklarer hvorfor årvåkenhet nivåer svinger i 24 h syklus. I tillegg til disse to prosessene, allostatic faktorer er også viktig for regulering av Sleep/våkenhet8,9. Allostatic faktorer inkluderer ernæringsmessige tilstander og følelser. Frykt og angst er vanligvis ledsaget av en økning i opphisselse sammen med autonome og Nevroendokrine svar10,11,12. Den limbiske systemet antas å spille en rolle i regulering av frykt og angst, og mekanismer underliggende autonome og Nevroendokrine responser har blitt studert grundig, men veien som limbiske systemet påvirker søvn/våkenhet stater har ikke ennå ikke blitt avslørt. Et stort antall nyere studier med opto-og farmakogenetikk har antydet at neurons og neuronal kretser som regulerer søvn/våkenhet stater er fordelt over hele hjernen, inkludert barken, basal forebrain, thalamus, hypothalamus, og hjernestammen. Spesielt siste fremskritt i optogenetics har tillatt oss å stimulere eller hemme spesifikke nevrale kretser in vivo med høy romlige og timelige oppløsninger. Denne teknikken vil tillate fremgang i vår forståelse av nevrale underlag av søvn og våkenhet, og hvordan søvn/våkenhet stater er regulert av døgn prosesser, søvn trykk, og allostatic faktorer, inkludert følelser. Dette papiret har som mål å innføre hvordan du bruker optogenetic manipulasjon kombinert med søvn/våkne opptak, som kan ha potensial til å oppdatere vår forståelse av connectomes og mekanismer i hjernen som spiller en rolle i regulering av REM søvn, REM søvn, og våkenhet. Forståelse av denne mekanismen som limbiske systemet regulerer sove/våkenhet statene er av overordnet betydning for helsen, fordi søvnløshet er vanligvis forbundet med angst eller frykt for å ikke kunne sove (somniphobia).
Den BNST er antatt å spille en viktig rolle i angst og frykt. Gad 67-uttrykker GABAergic neurons er en stor befolkning på BNST12,13. Vi undersøkte effekten av optogenetic manipulasjon av disse neurons (GABABNST) på søvn/våkenhet stater. En av de største fremskritt i nevrovitenskap de siste årene har vært metoder som muliggjør manipulering av neurons med spesielle kjemiske identiteter in vivo, med høy romlige og timelige oppløsninger. Optogenetics er svært nyttig for å demonstrere årsakssammenheng mellom neural aktivitet og spesifikke atferdsmessige responser14. Vi beskriver optogenetics som en metode for å undersøke funksjonell tilkobling av definerte nevrale kretser i regulering av søvn/våkenhet stater. Ved å benytte denne teknikken, har stor fremgang er oppnådd i forståelsen av neuronal kretser som regulerer søvn/våkenhet statene15,16,17,18,19 . I mange tilfeller er opsins spesielt innført i neurons med bestemte kjemiske identiteter i selektive hjerneområder av en kombinasjon av grobunn-driver mus og grobunn-induserbart AAV-mediert genoverføring. Videre, fokal uttrykk for foto-sensitive opsins som channelrhodopsin 2 (ChR2)20 eller Archaerhodopsin (ArchT)21 kombinert med en grobunn-LOXP eller FLP-frt systemet tillater oss å manipulere en selektiv neuronal befolkning og spesifikke neural Pathway22.
Vi beskriver her eksperimenter på GABAergic neurons i BNST som et eksempel. For å uttrykke opsins i en utpekt neuronal befolkning, passende grobunn driver mus og grobunn-avhengige virus vektorer er mest brukt. Transgene eller knock-in linjer der opsins uttrykkes spesielt neuronal populasjoner er også nyttig. I de følgende forsøkene, brukte vi GAD67-grobunn knock-i mus23 der bare GABAergic neurons Express GROBUNN recombinase med en C57BL/6J genetisk bakgrunn, og en AAV vektor som inneholder ChR2 (hChR2 H134R) smeltet sammen med EYFP eller EYFP som en kontroll med en "FLEx (flip-forbruker) Switch"24. Prosedyren beskriver spesielt optogenetic eksitasjon av GABAergic neurons i BNST under overvåking av søvn/våkenhet stater25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter her ble godkjent av Animal Experiment og bruk komité ved Universitetet i Tsukuba, i samsvar med NIH retningslinjer.
1. Animal Surgery, virus injeksjon, elektrode for EEG/EMG, og optisk fiber implantation
Forsiktig: Passende sikringen og handling teknikker burde være valgt basert på det biosafety plan flate av det virus å bli anvendt. AAV skal brukes i en isolert P1A gradert rom for injeksjon, og røret bærer AAV må steriliseres med en autoklav etter at alle volumet er brukt opp. Operasjonsstedet og alt implantat materiale skal være rent og sterilt under bruk.
Merk: Se figur 1.
- Desinfisere kirurgisk utstyr med autoklav.
- Bedøve mus med isoflurane ved hjelp av en bedøvelse fordamper. Observer til musen har nådd ønsket dybde av anestesi, bestemt av tap av respons på knipe halen med tang. Påfør øye salve på øynene for å hindre at de tørker.
- Desinfisere kirurgisk felt med jod løsning eller 70% EtOH (3x) og tørr tilstrekkelig. Tillat viruset å tine på isen som operasjonen blir utført. Dekk til operasjonsområdet med absorberende laboratoriebenk papir.
- Fest musen hode i stereotactic apparater med øre barer og en neseklype. Etter å ha bekreftet hodet holdes stabilt, lage en midsagittal snitt i hodebunnen for å sikre posisjonene til bregma og lambda er plassert på samme nivå på en horisontal linje.
- For å unngå et posisjonerings gap, justerer du riktig nivåer av neseklype og øre linjer opp og ned. Bregma og lambda refererer til skjæringspunktet mellom de sutura saggitalis og sutura coronalis eller sutura lambdoidal, henholdsvis (figur 2).
- Bruk Serafin klemmer for å holde huden for å opprettholde tilgang til kraniet. Etter eksponering av skallen, desinfisere overflaten av skallen med jod eller 5% H2O2, for å aktivere skallen sting inkludert bregma og lambda å bli visualisere mer tydelig.
- Forbered AAV vektor injeksjon:
- Vask innsiden av en 10 mL sprøyte (se tabell over materialer) sekvensielt med 70% EtOH, 100% EtOH, og sterilisert vann, 5 ganger hver. Fest sprøyten i klemmen på en microinjection pumpe arm og påse at all oppløsning i sprøyten er utladet.
- Forsiktig aspirer 2 μL mineralolje uten luftbobler, og aspirer deretter det angitte volumet av virus løsningen. Etter aspirasjon, manipulere stempelet knappen og bekrefter at virus løsning kommer på tuppen av nålen.
Merk: Injeksjonsvolumet av viruset løsningen ble bestemt i pilot eksperimenter ved hjelp av samme mus belastning og samme virus produkt. Forholdet mellom volumet av virus løsning og omfanget av infeksjonen området bør anslås på forhånd.
- Injiser AAV vektor:
- Juster tuppen på microinjection nål på bregma og Legg merke til koordinatene som det opprinnelige punktet. Flytt spissen til det angitte injeksjonsstedet (for BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolateral ± 1,0 mm, dorsoventral-4,2 mm) og plasser tuppen av nålen på posisjonen. Sett et merke på skallen og bore hull på ca 2 mm i diameter ved hjelp av en tannlege Drill med en 0,7 mm hard kutter. Vær forsiktig så du ikke skader Dura eller hjernevev.
- Etter å ha fjernet blod fra rundt hullene med en bomullspinne, langsomt flytte nålen inn i posisjonen til BNST. Injiser langsomt den angitte mengden av virus oppløsning (0,07 μL/min) med en mekanisk microinjector. Etter å ha fullført injeksjonen, la nålen i 5 min slik at løsningen til tilstrekkelig infiltrere BNST vev. Forsiktig ta ut nålen.
- For bilateral injeksjon, Gjenta trinn 1.8.1-1.8.2 på den andre siden. Gjennom hele prosedyren, holde skallen fuktig med anvendelser av steril saltvann.
Merk: Vi brukte egendefinerte EEG/EMG-implantater (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) med fire EEG-elektroder (4 mm), to EMG-elektroder (2 mm; kuttet 4 mm elektroden til 2 mm med knipetang) og 6 elektroder (4,5 mm) (figur 2a).
- Lodde to ledninger i rustfritt stål (se tabell over materialer) som 1 mm av isolasjonen er strippet av begge ender til EMG elektroder. Juster midten av elektrodene til bregma og Merk posisjonen til hver EEG-elektrode (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm), og Bestem plasseringen av implantatet (figur 2b).
- Implantat optiske fibre:
- Fest en optisk fiber dobbsko til manipulator og roter manipulator armen slik at den har en vinkel på ± 30 ° mot en horisontal linje (denne prosessen er bare nødvendig for å unngå interferens mellom elektroder og optiske fibre, for eksempel i tilfelle av BNST stimulering). Sett fiber spissen på bregma og Registrer koordinatene.
- Flytt spissen til den målrettede innsettingslinjen, og Merk posisjonen på hodeskallen. Legg også til flere merker i nærheten av innsettingsstedet for anker skruene. Drill skallen på hvert sted med en tannlege Drill for å sette inn optisk fiber og fikse skruen. Fest skruen på skallen. Vær forsiktig så du ikke bryte Dura eller skade noen vev med skrue.
- Sett optisk fiber forsiktig til det kommer over BNST med en manipulator. Dobbsko skal hvile på de resterende kraniet (figur 1B).
- Påfør photocurable Dental sement (se tabell over materialer) for å dekke fiber og skruen. Reaksjonstiden for å stivne limet bør spesifiseres av produsentens Manual (vårt materiale trenger eksponering for lys i minst 10 s med spesifikke bølgelengde Foto-generator. Det er unødvendig å tørke limet etter dette).
- I dette trinnet, sørg for at ingen materialer (skrue eller lim) okkupere monterings plass for elektrodene. I tillegg, unngå å gjøre noen avbrudd i sement for dobbsko koble til optisk fiber og kabel. Gjenta trinn 1.10.1-1.10.4 på motsatt side for bilateral stimulering.
- Bore hull for EEG/EMG-elektroder. Sett tuppen av elektrodene inn i hullene. Hold implantatet og påfør Cyanoacrylate klebemiddel til mellomrommet mellom skallen og elektrodene. Sett inn igjen med oppmerksomhet for ikke å forstyrre noen materialer.
- Dekk omkretsen av elektrodene og optiske fibre med Cyanoacrylate lim etterfulgt av anvendelse av Cyanoacrylate Accelerant på limet. Dette trinnet unngår forårsaker eventuelle avbrudd ved dobbsko-til-optikk kabel og elektrode-til-bly wire tilkoblings sone (figur 1C).
Merk: Cyanoacrylate klebemiddel og dens Accelerant er skadelige for musen øyet. Vær oppmerksom på ikke å forårsake søl av disse kjemiske stoffene. Vær også forsiktig så du ikke sterkt berører elektrodene og fibrene for å unngå uventede avvik umiddelbart etter lim herding. - Utsett musen nakkemusklene og sett ledningene for EMG elektroden under muskelen. Juster lengden på EMG-elektroden slik at den finner like under de nuchal musklene. Lys forbindelse mellom spissen av elektroden og muskel-konseptet er nok til å fange EMG signalet.
- Påfør Cyanoacrylate lim for å fylle implantater og stivne limet med akselerasjon væske. Deretter setter du musen på en varmepute for å bli frisk til postural refleks vises. Juster temperaturen på varmeputen til dyre hvile kroppstemperatur (36,0 ° c i ZT 0-12 ved C57BL6 mus, ikke overstige 38,0 ° c).
Merk: En antibiotika er ikke nødvendig for steril kirurgi. - Følg de lokale institusjonelle retningslinjene for postoperativ analgesi. Oppbevare det mus inne en hjem bur for en det å bli frisk periode av det vil si 7 dager.
2. EEG/EMG overvåking med foto-eksitasjon av målrettede neurons i bestemte Sleep States
Forsiktig: Denne protokollen inkluderer bruk av laser utstyr i klasse 3B eller LED-enheter. Forskere bør være oppmerksom på sikkerhetsinformasjon. Beskyttende øye briller er nødvendig.
- Før du kobler laser kabelen til optisk fiber, justere laser intensitet med en scaler. Feste spissen av laser kabelen til en ubrukt optisk fiber med en dobbsko og Bekreft at det ikke er plass i krysset mellom fiber og kabel.
- Slå på hovedbryteren til laseren og vent 20 min for å varme opp.
- Avgi laseren til intensiteten kontrolløren og justere laser intensitet til 10 mW/mm2. Endre laser modus til transistor logikk og bekrefte at lyspulser slippes ut fra fiber styres av mønsteret regulator som er satt til 10 ms for varighet, 40 MS for resten, 20 ganger for syklus, og 20 ganger gjenta (det vil si 20 Hz av 10 MS lyspulser for 20 s).
- Etter utvinning perioden, flytte mus til eksperimentell kammer for innspilling EEG/EMG. Hus mus ved en konstant 23 ° c med en 12 h lys/mørk syklus med mat og vann tilgjengelig Ad lib.
- Koble til implantert elektrode og kabeladapter som er bundet til en slip ring for å unngå forviklinger. Det anbefales å dekke krysset med lys-ugjennomtrengelig materiale som aluminiumsfolie for å hindre laser lekkasje. Hvis et bilateral eksperiment er nødvendig, bruker du en slip ring med et bifurcate feste for kablene.
- I denne protokollen, vurderer vi ventetid til våkenhet fra REM søvn eller REM søvn, slik at opptakstiden bør begrenses i optimalisert zeitgeber tid (ZT0 er definert som tiden når lyset er på). Denne protokollen ble gjennomført mellom ZT4-ZT10. La musene forbli fritt i det eksperimentelle kammeret i minst 1 time som Akklimatisering.
- Under den eksperimentelle perioden, overvåke EEG og EMG signaler i samme skjerm og evaluere musen tilstand som våkenhet, REM søvn eller REM søvn. Bruk forsterknings kontrollen for hver bølge for å gjøre det enklere å skille mellom hver enkelt delstat.
- For måling av REM søvn til våkenhet ventetid, observere stabil REM sove for 40 s eller stabil REM søvn for 30 s, og slå på bryteren på mønsteret generator for photostimulation (denne protokollen genererer 20 Hz av 10 MS lyspulser for 20 s). Bekreft laser utslipp til implantert optiske fibre.
- Record EEG/EMG signaler til sovende tilstand endres til våkenhet. Hvis to eller flere eksperimentelle forsøk er nødvendig, begrense optogenetic manipulasjon til en gang om dagen fordi photostimulation er en kunstig intervensjon som kan påvirke søvn/våkenhet arkitektur.
- Etter eksperimentet, dypt bedøve og perfuse med sterilt saltvann og paraformaldehyde (PFA) for prøvetaking hele hjernen for immunhistokjemiske analyse26.
3. analyse av latency tid fra REM Sleep til våkenhet
- Etter opptak EEG/EMG signaler, overføre signal data til en datamaskin for scoring sove/våkenhet tilstander. Denne protokollen beskriver metoden for EEG-analyse med opptaks programvare (se tabell over materialer).
- Start Sleep Sign programmet og klikk på kategorien fil og velg Åpne for å velge de innspilte data (. kcd fil). Klikk på Sleep kategorien for å velge epoke tid for å justere tidsvinduet for hver epoke (vi bruker 1 epoke/4 sek).
- Manuelt score søvn/våkenhet stater basert på EEG/EMG signaler, i henhold til følgende kriterier: våkenhet, høy EMG og lav EEG spenning med høy frekvens; REM, lav EMG tone og høy EEG spenning med høy δ (0,5-4 Hz) frekvens; og REM, EMG indikerer muskel atonia og lav EEG spenning med høy θ (6-9 Hz) frekvens. En tilstand som ikke etter hverandre fortsetter i 16 s (dvs. 4 epoker) er ikke definert som en statlig endring fordi det ikke er en stabil tilstand.
- Klikk og hold venstre museknapp på den første epoken og dra markøren til den spesifikke trenden på mer enn 16 s (4 epoker) er avsluttet. Slipp deretter venstre museknapp og velg riktig tilstand (våkenhet eller REM-søvn eller REM-søvn) i popup-vinduet. Gjenta denne fremgangsmåten for å score alle EEG/EMG-signaler som er registrert i filen.
- Finn den eksakte tiden for stimulering i epoken der EEG viser REM eller REM søvn, og epoken viser staten overgangen etter stimulering punktet. Telle antall epoker mellom periodene like etter stimulering og like før statlig overgang.
- Deretter multiplisere telles antall epoker av 4 s (A). I epoken med stimulering, ta et skjermbilde og måle bredden mellom stimulering punkt og slutten av epoken. Deretter deler du den målte lengden med hele epoke lengden og multipliserer med 4 s (B). Tilsvarende, beregne varigheten av REM sove i epoken med statlig endring, noe som betyr at tiden mellom starten av epoken og staten endre punkt (C).
- Sum A, B og C for å få ventetid fra REM søvn til våkenhet. Den samme fremgangsmåten brukes til analyse av tilstandsovergang fra REM-søvn til våkenhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nåværende studien viste effekten av optogenetic eksitasjon av GABABNST neurons på søvn tilstand overgang. ChR2-EYFP ble fokalt uttrykt i GABA neurons i BNST. En in situ hybridisering histochemical studie viste at ChR2-EYFP var colocalized i neurons uttrykke GAD 67 mRNA signaler, noe som indikerer at disse er GABAergic neurons. Immunhistokjemiske skive prøvene bekreftet plasseringen av optisk fiber, hvis spissen var like over BNST25.
Figur 3a viser representative EEG/EMG-spor før og etter PHOTOSTIMULATION under REM-søvnen. Høy spenning og langsom frekvens EEG uten EMG signaler representerer REM søvn. Photostimulation (10 MS pulser ved 20 Hz i 20 sek) ble påført etter stabil REM-søvn. Stimulering utløser akutt overgang til våkenhet (lav spenning og høy frekvens EEG med aktive EMG-signaler) om 2 s etter stimulering i ChR2-uttrykker mus. Kontroll mus (EYFP) viste ikke overgang etter stimulering (ventetid for å våkne fra REM: EYFP, 295,39 ± 106,61 sek, n = 6; ChR2:2,71 ± 0,59 sek, n = 6; t10 = 2,35, p < 0,05; Figur 3b, øvre). Disse dataene tyder på at eksitasjon av GABABNST NEURONS under REM søvn utløser rask induksjon av våkenhet. På den annen side, photostimulation under REM søvn hadde ingen effekt (EYFP: 36,45 ± 13,08 SEC, n = 6; ChR2:37,29 ± 15,19 sek, n = 6; t10 = 0,04, p = 0,484; Figur 3b, nederst) slik at en overgangseffekt bare oppsto i REM søvn.
Figur 1 : Fremgangsmåte for å INJISERE AAV, implantat optiske fibre og EEG/EMG-implantater. (A) eksperimentell prosedyre av virus injeksjon. EYFP-smeltet ChR2 eller EYFP (for kontroll) genet innlemmet i AAV vektor hvis transkripsjon er aktivert ved grobunn recombinase ble bilateralt injisert i BNST. (B) optiske fibre ble satt inn mot BNST i en 30 ° vinkel til horisontal for å hindre kollisjon med elektroden. To skruer ble satt rundt den. (C) EEG/EMG opptaksenhet ble implantert etter sikker plassering av optiske fibre. (D) ved slutten av operasjonen bør hele operasjonsområdet dekkes med Cyanoacrylate klebemiddel og sterkt fast. Pass på at du ikke bruker noen agent i regionen som forbinder elektroden og ferrules. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Custom EEG/EMG elektrode og elektrode pinner innsetting nettsteder. (A) topp: ut av 6 elektrode pinner er de utvendige to pinnene kuttet ned til 2 mm. bunn: EEG/EMG-elektroder. (B) disse ELEKTRODENE og EMG Lednings ledninger blir så loddet. Den kobler sonen bør isoleres med noen isolasjon som Cyanoacrylate lim. Innsetting nettsteder av elektroder er i forhold til bregma (anteroposterior ± 1.5 mm, mediolateral ± 1,0 mm). EMG ledninger er satt inn under nakke muskelen med fjerning av isolasjon beskytte ledningen ved innsetting området (1 mm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Effekten av GABABNST stimulering på statlig overgang i REM søvn og REM søvn. (A) representant EEG og EMG bølge og EEG makt spektrum. Photostimulation (10 MS pulser på 20 Hz i 20 sek) ble brukt til ChR2-uttrykker GABABNST neurons følgende 40 s REM søvn. Våkenhet ble raskt indusert etter en 2 s. Den EEG viste lav spenning og høy frekvens med EMG sprengning. Den EEG makt Spektrogram også viste overgangen fra lav til høy frekvens. (B) Optogenetic EKSITASJON av GABABNST neurons VISTE rask overgang fra REM søvn til våkenhet (øvre), men denne effekten ble ikke sett i tilfelle av å bruke samme manipulasjon i REM søvn (nederst). *p < 0,05, Welch t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi her presenterte en metode for å evaluere effekten av optogenetic stimulering av neurons med spesielle kjemiske identiteter på statlige overganger av søvn/våkenhet og ga et eksempel på manipulering av GABABNST neurons. Våre data viste at optogenetic eksitasjon av GABABNST neurons resulterer i umiddelbar overgang fra REM søvn til våkenhet.
Ulike eksperimentelle design er tilgjengelig på grunn av utviklingen av mange typer optogenetic verktøy. Det er mulig å aktivere eller hemme neuronal aktivitet av bestemte neurons bruke ulike typer opsins, som ChR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT, og iChloC27. ChR2 kanne aktivere neurons et par millisekunder etter Foto-stimulering og denne kan brukes å fremkalle aksjonen potensialer inne en Phase-lås måte av en impuls generator å eksamen det akutt innvirkningen inne spesifikk sove scener. En stabilt aktiverings opsin, som for eksempel stabil Step-funksjon opsin (SSFO), som induserer depolarization av neurons i 15 til 30 min etter stimulering, kan også være nyttig for noen typer eksperimenter designet for å observere en semi-kronisk effekt28. Depolarisert celler med SSFO kan bli mer følsomme for ulike fysiologiske neuronal input og deaktiveres ved å bruke Langbølge lengde lys. Videre kan vi aktivere axons ved implantation av optiske fibre på stedet av en axonal projeksjon. Fiber stimulering kan gi informasjon om funksjonen til en bestemt axonal projeksjon sti.
EEG/EMG innspilling under optogenetic manipulasjon er en mindre invasiv metode for å bestemme de direkte konsekvensene av selektiv eksitasjon/hemming av nevrale kretser på søvn/våkenhet tilstander i mus. Med denne metoden har mange neuronal befolkninger og nevrale kretser vist seg å være involvert i regulering av søvn/våkenhet stater. Mot videre utvikling av denne teknikken, er det mulig å implantatet flere fibre til å manipulere flere veier samtidig, eller dette kan også brukes i kombinasjon med fiber photometory eller miniscopes å overvåke neuronal aktiviteter.
Avslutningsvis er det forventet at optogenetics vil akselerere fremgang i å låse opp mysteriet med søvn regulering av hjernen og utvikling av innovative terapier for ildfast søvnløshet og andre søvnforstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette prosjektet ble delvis støttet økonomisk av Merck & co.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Merck etterforsker Studies Program (#54843), en KAKENHI Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder, "WillDynamics" (16H06401) (TS), og en KAKENHI Grant-in-Aid for undersøkende forskning på innovative områder (TS) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
