Summary
نقدم بروتوكولا لتقييم مستويات التعبير المتداولة ميكرورنا (ميرناس) في عينات البلازما من مرضى السرطان. على وجه الخصوص، قمنا باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً لتعميم استخراج ميرنا والنسخ العكسي. وأخيراً، قمنا بتحليل فريق من 24 ميرناس المحدد باستخدام مسبار مسبقاً رصدت في الوقت الحقيقي لوحات مخصصة.
Abstract
هناك اهتمام متزايد في خزعة سائلة لتشخيص مرض السرطان والتشخيص والرصد العلاجي، وخلق الحاجة إلى المؤشرات الحيوية موثوق بها ومفيدة للممارسة السريرية. نقدم هنا، بروتوكولا لاستخراج، عكس تدوين وتقييم مستويات التعبير المتداولة ميرناس من عينات البلازما للمرضى المصابين بسرطان القولون والمستقيم (CRC). ميكرورناس (ميرناس) هي فئة من الكشف غير الترميز من النيوكليوتيدات 18-25 في الطول التي تنظم التعبير عن الجينات المستهدفة على المستوى متعدية الجنسيات، وتلعب دوراً هاما، بما في ذلك وظيفة الأوعية الموالية والمناهضة، وفي الفيزيولوجيا المرضية الأجهزة المختلفة. ميرناس مستقرة في السوائل البيولوجية مثل المصل والبلازما، مما يجعلها مثالية تعميم المؤشرات الحيوية للسرطان في التشخيص والتشخيص والعلاج في عملية صنع القرار، والرصد. تعميم استخراج ميرنا أجرى باستخدام طريقة سريعة وفعالة تتضمن منهجيات العضوية ويستند إلى العمود. لميرنا ريتروترانسكريبتيون، استخدمنا إجراء متعدد خطوة التي تعتبر بوليادينيليشن في 3 'والربط للمحول في 5' من ميرناس ناضجة، تليها ميرنا عشوائي قبل التضخيم. نحن تحديد 24-ميرنا لوحة مخصصة اختبار بالكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR) ورصدت تحقيقات ميرنا على لوحات مخصصة الصفيف. ونحن إجراء qRT PCR لوحة يعمل على نظام PCR الوقت الحقيقي. واختير ميرناس التدبير المنزلي لتطبيع استخدام البرمجيات جينورم (ف 3، 2). تم تحليل البيانات باستخدام التعبير جناح البرمجيات (v 1.1)، وأجريت التحليلات الإحصائية. الأسلوب ثبت أن تكون موثوقة وقوية من الناحية الفنية ويمكن أن تكون مفيدة لتقييم مستويات العلامات البيولوجية في العينات السائلة مثل البلازما أو المصل.
Introduction
تمثل اتفاقية حقوق الطفل الثالث الأكثر شيوعاً تشخيص الأورام الخبيثة والسبب الرابع للوفيات المتصلة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. وحتى الآن، تمت الموافقة بيفاسيزوماب (ب)، وجسم [مونوكلونل] ضد عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، وسيتوكسيماب (ج) أو بانيتوموماب (ع) من الأجسام المضادة الموجهة ضد مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، على العلاج الخط الأول بالاقتران مع نظم العلاج الكيميائي (CT).
الطفرات في الجينات رأس ك و رأس ن هي المؤشرات الحيوية مفيدة سريرياً فقط قادرة على تحديد المرضى الذين هم الأقل احتمالاً الاستفادة من قيراط المستندة إلى EGFR مكافحة على الرغم من أن عدة دراسات أجريت للبحث عن المؤشرات الحيوية التي تنبؤية للاستجابة ليقوم ب CT، لا يزال هناك نقص كبير في المخدرات فعالة وموثوقة لاستخدامها في الممارسة السريرية1.
ميرناس يتم الكشف الصغيرة (18-25 النيوكليوتيدات في الطول) التي تنظم ترجمة الجينات المستهدفة، وتلعب دوراً حاسما في العديد من عمليات فيسيوباثولوجيكال، بما في ذلك امبريوجينيسيس والتسرطن. هذه الجزيئات مستقرة جداً في السوائل بيولوجية مثل البلازما/مصل الدم والبول والبصاق، مما يجعلها قوية المؤشرات الحيوية لاستخدامها لأخذ العينات غير الغازية2. يمكننا استخدام لوحة للمشاركة في مسار الأوعية ميرناس، تهدف إلى تحديد جديد تعميم المؤشرات الحيوية قادرة على التنبؤ بالنتائج السريرية في المرضى مع اتفاقية حقوق الطفل المتنقل (بترول) تعامل مع نظام التصوير المقطعي المستندة إلى ب.
قمنا بتحليل مجموعة من 52 بترول المرضى الذين يعالجون على أساس ب CT داخل متعددة مستقبلية معشاة ذات شواهد المرحلة الثالثة للمحاكمة "الإيطالية للمحاكمة في متقدمة سرطان القولون والمستقيم" (ITACa). تمت الموافقة على هذا البروتوكول "اللجنة المحلية لأخلاقيات" (اللجنة Etico منطقة Vasta ه المعهد العلمية روماجنولو الواحد لو الاستوديو ه la Cura dei توموري (IRST) إيرككس، رقم 674) في 19عشر أيلول/سبتمبر 2007. وأعطى جميع المرضى المستنيرة قبل جمع عينة الدم. لكل مريض، جمعت عينات الدم الوريدي قبل العلاج وفي التقييم السريري الأول (بعد 8 أسابيع) لتقييم التعبير ميرنا الأساس والتحوير في أثناء فترة العلاج بالنسبة للمريض نتائج.
من خلال بحث الأدب، اخترنا ميرناس 21 يرتبط بعملية الأوعية التي هي معروفة لتكون قابلة للكشف في البلازما البشرية: ف له-مير-107، وقد-مير-126-3، ف قد-مير-145-5، ف قد-مير-194-5، قد-مير-199a-5 ف، قد مير-200b-3 ف، وقد-مير-20b-5 ف ، وقد-مير-21-5 ف، ف قد-مير-210-3، وف له-مير-221-3، ف قد-مير-24-3، ف قد مير-27 ألف-3 ف، قد-مير-29 باء-3 ف، قد-مير-335-5، ف قد-مير-424-5، ف قد-مير-497-5، ف قد مير-د 520-3 ف، قد-مير-92a-3 ف، قد-مير-17-5 وف له-مير-155-5. نحن أيضا بتحديد ف له-مير-223-3 وقد-مير-484 للتطبيع الذاتية3،،من45،6، وسل-مير-39 تنقيته من C. ايليجانس كمسمار في تطبيع خارجية. وأجريت جميع البيانات نورماليزيشنز باستخدام الأسلوب ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
ويعرض الكشف عن تعميم ميرناس بعض الصعوبات التقنية لأنه توجد الجزيئات عند مستويات منخفضة جداً في البلازما وعلى التضخيم كيميائيا صعبة نظراً لتسلسل قصيرة بها. لهذه الأسباب، نحن تحديد إجراء الذي يعتبر استخراج العضوية مع الفينول ومنهجية تستند إلى عمود ألياف زجاجية. تعميم استخراج ميرنا موضوع ساخن في ميدان خزعة سائلة، واخترنا مجموعة تجارية قد أظهرت أن تكون واحدة من الأكثر موثوقية من حيث كمية ونوعية غلة المستردة7،8. علينا تحديد بروتوكول لعكس نسخ ميرناس بإضافة محول في 5 'وذيل poly(A) إلى 3' لميرنا ناضجة لتعزيز انتقائية وخصوصية من رد فعل.
نظراً لمتانة الأسلوب، ونحن تصميم لوحات مخصصة مع تحقيقات مسبقاً رصدت ل RT-PCR لتقييم كل عينة في التكرارات وحلل 2 المرضى داخل كل لوحة، كما هو مبين في الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت غطاء دخان معقمة وفقا للممارسة المختبرية الجيدة (GLP).
1-البلازما جمع وتخزين
- جمع 3 مل عينة الدم المحيطي في أنبوب يدتا K3E.
- الطرد المركزي الأنبوب في درجة حرارة الغرفة في س 1,880 ز لمدة 15 دقيقة.
- استرداد البلازما طافية في مختبرين من 450 ميليلتر.
- تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: عملية أنبوب الدم المحيطي ضمن ح 2 من المجموعة. عدم الإزعاج عند استعادة البلازما من الأنبوب، طبقة الخلايا اللمفاوية.
2-استخراج تعميم ميرناس من "عينات البلازما" (جدول المواد)
-
إعداد جميع الحلول المطلوبة وذوبان الجليد للخطوات استخراج العينات.
- إضافة ميليلتر 375 من 2-ميركابتوثانول لحل x denaturating 2 وتخلط جيدا.
- إضافة مل 21 من الإيثانول 100% الصف ACS إلى ميرنا يغسل الحل الأول ومزيج جيد.
- إضافة 40 مل إيثانول 100% الصف ACS إلى الحل أغسل 2/3، ومزيج جيد.
- تسمح الكوة ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة ومن ثم تبدأ الخطوات استخراج بلازما.
-
استخراج العضوية
- نقل 400 ميليلتر من عينة البلازما في أنبوب 2 مل رناسي مجاناً.
- إضافة 400 ميليلتر من 2 x denaturating الحل ومزيج من فورتيكسينج والطرد المركزي بإيجاز.
- إضافة 4 ميليلتر من 1 نانومتر سبايك في مزيج من فورتيكسينج والطرد المركزي بإيجاز.
- إضافة 800 ميليلتر من حمض الفينول-كلوروفورم.
- دوامة 60 ثانية وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة (إيه وان زيرو، 000 x ز) لمدة 15 دقيقة.
- نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد. عدم الإزعاج في الطور البيني. علما أن حجم المستردة وتجاهل الأنبوبة المحتوية على المرحلة غير أكقويووس.
ملاحظة: 2 × يشوه الحل يتم تخزينها في 4 درجات مئوية، وقد ترسخ في درجة الحرارة هذه. قبل الاستخدام، الحارة إلى 37 درجة مئوية، وحرضت أحياناً عن 10-15 دقيقة يكون الحل الدقيق الانسحاب في المرحلة السفلي التي تحتوي على حمض الفينول كلوروفورم، ليس المخزن المؤقت أكقويووس التي تقع فوق الخليط. يسخن حل شطف أو المياه خالية من نوكلاس إلى 95 درجة مئوية. كن حذراً للحرارة حجم مناسب للحل (100 ميليلتر كل عينة + 10% الزائدة).
-
الصغيرة رنا تخصيب
- إضافة إلى حجم 1/3 من الإيثانول 100% إلى المرحلة مائي من الخطوة 2.2.6 ومزيج دقيق.
- ضع خرطوشة تصفية إلى أنبوب جمع طازجة لكل عينة.
- نقل ميليلتر يصل إلى 700 من ليستي من الخطوة 2.3.1 والايثانول في تصفية خرطوشة وأجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 30 ثانية.
- إذا كان هناك > 700 ميليلتر من خليط اليسار، المكان فيلتراتي في أنبوب جديد وكرر الخطوة 2.3.3؛ كرر حتى اجتاز كل هذا الخليط من خلال تصفية خرطوشة.
- قياس الحجم الإجمالي للتدفق عبر.
- إضافة إلى حجم 2/3 من الإيثانول 100% فيلتراتي، ومزيج دقيق.
- ضع خرطوشة تصفية ثانية في أنبوب مجموعة جديدة.
- نقل ميليلتر يصل إلى 700 من حجم العينة إلى الخرطوشة والطرد المركزي في 10,000 س ز لتجاهل س. 30-التدفق عبر.
- كرر الخطوة 2.3.8 حتى اجتاز كل هذا الخليط من خلال تصفية خرطوشة.
- تنطبق ميليلتر 700 ميرنا يغسل الحل 1 خرطوشة تصفية والطرد المركزي خرطوشة تصفية مع أنبوب جمع في 10,000 س ز لتجاهل س. 15-التدفق عبر. ضع خرطوشة تصفية في أنبوب جمع نفسه.
- تطبيق 500 ميليلتر من حل الغسيل 2/3 لتصفية خرطوشة والطرد المركزي خرطوشة تصفية مع أنبوب جمع في س 10,000 ز لتجاهل س. 15-التدفق عبر. ضع خرطوشة تصفية في أنبوب مجموعة جديدة.
- ضع خرطوشة تصفية في أنبوب جمع طازجة وكرر الخطوة 2.3.11 مع 500 ميليلتر الحل أغسل 2/3. تجاهل في التدفق من خلال ونقل الخرطوشة تصفية إلى أنبوب جمع طازجة.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب مع خراطيش تصفية في x 10,000 ز لمدة 1 دقيقة.
- نقل الخرطوشة تصفية إلى أنبوب جمع طازجة 1.5 مل وإضافة 100 ميليلتر من حل شطف مسخن (95 درجة مئوية) أو المياه خالية من نوكلاس.
- أجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 30 ثانية لاستعادة ميرناس وتخزينها في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: قد تشكل ترسبات بيضاء في الحل أغسل 2/3. هذا هو يدتا الزائدة من الحل. تجنب وضع هذه البلورات خلال الخطوات بيبيتينج.
3-إجراء النسخ العكسي وميرنا قبل التضخيم (جدول المواد)
-
القيام برد فعل بوليادينيليشن
- ذوبان الجليد جميع الكواشف على الجليد، ثم بإيجاز ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي لزيادة ونقصان لأسفل المحتويات. وباﻹضافة إلى ذلك، ربط ذوبان 50% 8000، يسمح لها بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
- إعداد مزيج رد فعل في أنبوب الطرد مركزي 0.5 مل، الحصول على وحدة تخزين نهائي من 3 ميليلتر من رد فعل كوكتيل لكل عينة. استخدم في المجلدات التالية، بالإضافة إلى 10% من حجم الزائدة لكل كاشف.
- إضافة ميليلتر 1.7 من المياه خالية من رناسي 0.5 ميليلتر من 10 × Poly(A) المخزن المؤقت، 0.5 ميليلتر من ATP 10 مم وأخيراً 0.3 ميليلتر 5 إنزيم بوليا يو/ميليلتر.
- بإيجاز ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي خليط كوكتيل تدور أسفل المحتويات.
- نقل 2 ميليلتر من العينة لكل من لوحة رد فعل أو رد فعل الأنبوبة جيدا وإضافة 3 ميليلتر من رد فعل كوكتيل. بإيجاز ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي لزيادة ونقصان لأسفل المحتويات.
- ضع اللوحة/الأنابيب في cycler حرارية وقم بالخطوات التالية.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة (الخطوة بوليادينيليشن).
- احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (توقف رد الفعل)، مع عقد التالية عند 4 درجة مئوية.
-
القيام برد فعل عملية ربط.
- إعداد مزيج رد فعل في أنبوب الطرد مركزي مع وحدات التخزين التالية لكل عينة و 10% من حجم الزائدة.
- إضافة ميليلتر 0.4 من المياه خالية من رناسي، ميليلتر 3 5 x الحمض النووي ليجاسى المخزن المؤقت, 0.6 ميليلتر من 25 x محول ربط, ميليلتر 4.5% 50 8000 ربط، وأخيراً 1.5 ميليلتر من ليجاسى الجيش الملكي النيبالي.
- بإيجاز ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي خليط كوكتيل تدور أسفل المحتوى.
- إضافة 10 ميليلتر من المزيج لكل أنبوبة جيدا/رد الفعل الذي يحتوي على المنتج تراجع poly(A). مزيج من لوحة شاكر 1,900 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة أو فورتيكسينج بإيجاز وتدور أسفل المحتويات.
- وضع أنابيب لوحة/رد فعل في cycler حرارية بالإعدادات التالية: عقد الحضانة عند 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، مع التالية في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: 50% 8000 ربط عالية اللزوجة. استخدم في درجة حرارة الغرفة، يسفط وصرفها ببطء. بعد كل طموح والاستغناء عن الخطوة، يعقد قطع قطع 10 s للسماح للكاشف لتدفق صعودا وهبوطاً.
-
القيام برد فعل النسخ العكسي.
- إعداد مزيج رد فعل في أنبوب الطرد مركزي، مع وحدات التخزين التالية لكل عينة و 10% من حجم الزائدة.
- إضافة ميليلتر 3.3 خالية رناسي المياه وميليلتر 6 من 5 × RT العازلة، 1.2 ميليلتر من مزيج دنتب (25 مم في كل)، 1.5 ميليلتر من 20 x كبسولة تفجير RT العالمي، وأخيراً 3 ميليلتر من 10 x ميكس إنزيم RT.
- بإيجاز ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي خليط كوكتيل تدور أسفل المحتويات.
- إضافة 15 ميليلتر من المزيج لكل أنبوبة جيدا/رد الفعل الذي يحتوي على المنتج عملية ربط. مزيج من لوحة شاكر 1,900 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة أو فورتيكسينج بإيجاز وتدور أسفل المحتويات.
- وضع أنابيب لوحة/رد فعل في cycler حرارية مع الإعدادات التالية.
- احتضان في 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (النسخ العكسي).
- احتضان في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (توقف رد الفعل)، مع عقد التالية عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: المنتج RT يمكن تخزينها الآن في-20 درجة مئوية، وستظل مستقرة لمدة تصل إلى شهرين.
-
القيام برد فعل مير-أمبير (جدول المواد).
- إعداد مزيج رد فعل في أنبوب الطرد مركزي مع وحدات التخزين التالية لكل عينة و 10% من حجم الزائدة.
- إضافة ميليلتر 17.5 المياه خالية من رناسي و 25 ميليلتر من مزيج سيد مير-أمبير 2 x ميليلتر 2.5 من 20 س مير-أمبير التمهيدي مزيج.
- بإيجاز ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي خليط كوكتيل تدور أسفل المحتويات.
- لكل عينة، نقل ميليلتر 45 من هذا المزيج رد فعل لكل من صفيحة رد فعل جديد أو أنبوب رد فعل جيدا. إضافة 5 ميليلتر من المنتج RT لكل أنبوبة جيدا أو رد فعل. مزيج من لوحة شاكر 1,900 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة أو فورتيكسينج بإيجاز وتدور أسفل المحتويات.
- وضع أنابيب لوحة/رد فعل في cycler حرارية وتشغيل كما هو مبين في الجدول 1.
4-إجراء PCR الوقت الحقيقي
- تمييع كل كدنا عينة 01:10 في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات x 0.1.
- حساب عدد الآبار/replicates لكل عينة. إعداد مزيج رد فعل في أنبوب الطرد مركزي مع وحدات التخزين التالية لكل عينة، إضافة 10% حجم الزائدة.
- إضافة 4 ميليلتر من المياه خالية من رناسي، 10 ميليلتر من 2 x سريعة المتقدمة الرئيسية ميكس (جدول المواد)، وأخيراً 5 ميليلتر من كدنا المخفف.
- مزيج من فورتيكسينج والطرد المركزي بإيجاز لزيادة ونقصان لأسفل المحتويات.
- نقل 19 ميليلتر من رد فعل مزيج لكل منها أيضا، ختم اللوحة والطرد المركزي بإيجاز.
- تنفيذ البروتوكول الحرارية (الجدول 2) على نظام RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بتحليل فريق من الأوعية المتصلة ميرناس المتداولة فيما يتعلق ببقاء خالية من التقدم (PFS)، وعموما معدل البقاء على قيد الحياة (نظام التشغيل) واستجابة موضوعية (أور) في بترول 52 علاج المرضى مع قيراط المستندة إلى ب تقييم مثل هذه المؤشرات الحيوية في عينات البلازما يمثل تحديا بسبب صعوبات تقنية. قمنا باستخدام الأساليب المتبعة لاستخراج ميرنا من عينات البلازما المريض والنسخ العكسي والتضخيم السابقة. بناء على تعليمات الشركة المصنعة ومع عدد قليل من التعديلات المطلوبة، لا سيما في خطوات استخراج، نحن بنجاح تقييم جميع أهدافنا في السكان المريض (الشكل 2).
على وجه الخصوص، قمنا بتحليل 2 المرضى عينات البلازما، ربط خط الأساس والتعبير ميرنا تعديل العلاج مع نتائج المريض.
أجرينا تخفيف المسلسل من الجوف-مير-39 في 0.05 نانومتر، 0.5 نانومتر، 5nM و 05:00 م 800 ميليلتر من البلازما في عينة (400 ميليلتر من البلازما بالإضافة إلى 400 ميليلتر من 2 x denaturating حل) لتحديد تركيز المصطلحات الخاصة في استخدام. كما هو مبين في الشكل 4، وسيطرة خارجية أظهرت دورة عتبة القيم (Ct) التي كانت متطابقة مع تخفيف المسلسل، مما يدل على متانة بروتوكول كامل (أي استخراج والنسخ العكسي والتقييم قرت-PCR). وعلاوة على ذلك، هذه تخفيف المسلسل مكنتنا من تحديد ارتفاع في تركيز التي لن تتدخل العكس النسخ لكل هدف ميرناس.
هذه الطريقة سمحت لنا بربط ميرناس خط الأساس مع السمات المرضية الإكلينيكية. على وجه الخصوص، وجدنا أنه قد-مير-199a-5 س، ف قد-مير-335-5 وقد مير-د 520-3 ف كانت إلى حد كبير أوبريجولاتيد في الوجهين اليسار فيما يتعلق بالآفات على وجه حق (p = 0.03، ف = 0.006 و p = 0، 008، على التوالي). على العكس من ذلك، ف قد-مير-21-5 بكثير دوونريجولاتيد في مرضى تحور رأس (رأس ك، ف = 0.01 و N-RAS، ف = 0.008)، في حين كان قد-مير-221-3 س أوبريجولاتيد (ف = 0.05، ف = 0.01، ك ورأس ن، على التوالي).
مقارنة مستويات التعبير ميرنا بين خط الأساس والتقييم اﻻكلينيكي الأول، لاحظنا أن زيادة في مستويات التعبير ف له-مير-155-5 ارتبط PFS أقصر (p = 0.04) ونظام التشغيل (p = 0.02). على وجه الخصوص، في المرضى الذين يعانون من زيادة بنسبة % إيه ثري زيرو في ف له-مير-155-5، PFS 9.5 أشهر (CI 95%، 6.8 18.7) ونظام التشغيل الأشهر 15.9 (CI 95%، بلغت 8.4-عدم) مقارنة 22.3 (CI 95%، 10.2-25.5) وأشهر 42.9 (CI 95%، بلغت 24.8-عدم) لأولئك مع < 30% زيادة (الشكل 3). القيمة الوسطية للتباين في سلسلة حالة (30%) تم تعيينها كنقطة استقطاع. كانت ديتشوتوميزيد المستويات القاعدية يتناقل من ميرناس إلى "عالية" أو "منخفضة" وفقا لمتوسط القيم9.
رقم 1: تصميم تخطيط لوحة مخصصة. وكانت تحقيقات مسبقاً رصدت في كل بئر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أمثلة على مؤامرات التضخيم قرت-بكر- مؤامرة التضخيم (A) من لوحة مخصصة بكر قرة واحد. وكانت علامات جميع المدانين في كلا العينتين لوحة واحدة. (ب) قرت-بكر فله-مير-17-5 في سلسلة الحالات، إجمالاً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: النتائج التجريبية والسريرية بالنسبة له-مير-155-5 س. (أ) Ct قيم ف له-مير-155-5. ارسم التضخيم من ف قد-مير-155-5 في سلسلة الحالات، إجمالاً. (ب) PFS ونظام التشغيل للمرضى بنسبة % إيه ثري زيرو أو < زيادة 30% في تعميم ف له-مير-155-5. وحسبت PFS في الوقت من تاريخ التوزيع العشوائي لتاريخ أول دليل موثق على تطور الورم، والورم التقييم الأخير أو الموت في حالة عدم تطور المرض. وتم حساب نظام التشغيل كالوقت من تاريخ التوزيع العشوائي لتاريخ الوفاة من أي قضية أو متابعة آخر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: النتائج التجريبية فورسيل-مير-39 تمييع المسلسل. (أ) قرة-بكر لتخفيف المسلسل cel-مير-39 ومع النسبية (ب) Cts. تخفيف أجريت في 5 نانومتر، 0.5 نانومتر، 0.05 نانومتر و 05:00 م في عينات البلازما من المريض نفسه. هذه الخطي المقايسة مكنتنا من تحديد تركيز أفضل استخدام في سلسلة الحالات، إجمالاً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الخطوة | درجة الحرارة | المدة | دورات |
| تنشيط إنزيم | 95 درجة مئوية | 5 دقيقة | 1 |
| تؤذي | 95 درجة مئوية | 3 s | 14 |
| يصلب/تمديد | 60 درجة مئوية | 30 s | |
| وقف رد الفعل | 99 درجة مئوية | 10 دقيقة | 1 |
| عقد | 4 درجة مئوية | عقد | ∞ |
الجدول 1: بروتوكول الحرارية من رد فعل مير-أمبير.
| الخطوة | درجة الحرارة | المدة | دورات |
| تنشيط إنزيم | 95 درجة مئوية | 20 s | 1 |
| تؤذي | 95 درجة مئوية | 3 s | 40 |
| يصلب/تمديد | 60 درجة مئوية | 30 s | |
| عقد | 4 درجة مئوية | عقد | ∞ |
الجدول 2: بروتوكول الحرارية من بكر قرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميرناس صغيرة الكشف (18-25 النيوكليوتيدات في الطول) قادرة على ملزمة 3 ' UTR منطقة هدفهم رسول الجيش الملكي النيبالي وتثبيط و/أو المهينة غير الترميز. وبالتالي يمكن اعتبار المنظمين التعبير الجيني على المستوى متعدية الجنسيات. في العقد الماضي، وقد ارتبط ارتباطاً ميرناس عدة مع بدء السرطان والتنمية، مما يجعلهم المؤشرات الحيوية السريرية مفيدة للتشخيص، والتشخيص والعلاج. المحمية بواسطة رنسيس، ميرناس موجودة بشكل ثابت في السوائل البيولوجية مثل الدم والبلازما والمصل، والبول واللعاب، مما أدى إلى اهتمام متزايد بفائدتها المحتملة في الممارسة السريرية10.
وبالرغم من ذلك، تقييم تعميم ميرناس مهمة صعبة وهي صعوبات فيما يتعلق بجمع العينات، واستخراج الهدف واختيار منصة والتطبيع العالمي المواضيع المثيرة للجدل في الأوساط العلمية.
لجمع العينات وتخزينها، المتغيرات قبل التحليل ترتبط ارتباطاً وثيقا بالبلازما المناولة والتجهيز. وركزنا على عينات البلازما بدلاً من مصل الدم نظراً لأن هناك أدلة وافرة من أعلى تركيزات ميرنا في الأخير، ربما بسبب الإفراج عن هذه الجزيئات أثناء التخثر عملية10،11،12 . لمعالجة مسألة الإفراج عن الأحماض النووية الخلوية الناجمة عن تحلل خلايا الدم، ونحن تثفيل العينات داخل ح 2 لجمع الدم. نحن أيضا استخدام أنابيب يدتا K3E لأن الأخرى المضادة تخثر معروفة للتدخل مع الخطوات التضخيم (أي، الهيبارين) وقد تؤدي إلى انحلال الدم (أي، سترات). كما أنها حاسمة لتفادي التلوث الصفائح الدموية واللمفاويات في المرحلة التحليلية السابقة، نحن إزالة البلازما من الأنبوب ببطء شديد، ولا نضح ميليلتر آخر ~ 50 عينة من الأنبوب.
أظهرت الدراسات المختلفة تفوق أساليب الاستخراج المستندة إلى عمود عبر بروتوكولات غوانيدين/الفينول/كلوروفورم-تعتمد11،13، لكن خوري et al. فعالية معزولة ذات نوعية جيدة الكشف صغيرة من مصل الدم باستخدام مثل هذه الكواشف دون تلوث14. طقم التجارية استخدمنا تسلسلياً يقوم كلا أساليب الاستخراج، سمحت غلة ميرنا مناسبة من حيث المصطلحات الخاصة في تركيزات. ونحن فقط إجراء تعديل واحد فيما يتعلق بتعليمات الشركة المصنعة، أي، استخدمت دائماً بعد كل خطوة الغسيل خرطوشة تصفية أنابيب مجموعة جديدة للقضاء على تقليل خطر التلوث كاشف. بغية تحديد المصطلحات الخاصة في تركيز أفضل في عينات لدينا، وبالتالي تجنب التدخل مع ردود لاحقة، أجرينا أول بروتوكول كامل دون إضافة cel-مير-39 خلال الخطوة استخراج تقييم مستويات التعبير الوسيط أهدافنا. ثم أجرينا حيثياته ميرنا الاستخراج من عينات البلازما للمريض نفسه استخدام مسلسل إضعاف cel-مير-39 لتحديد تركيز أفضل لإضافة إلى عينات البلازما لدينا سلسلة القضية (الشكل 4). ومع ذلك، يجب التأكيد على أن تركيز cel-مير-39 الأمثل، المحددة لنموذج واحد فقط، قد لا بالضرورة يكون تركيز أفضل لسلسلة الحالات، إجمالاً بسبب سلسلة من المتغيرات الداخلية مثل عادات العمر أو نوع الجنس أو الحياة، التي يمكن أن تؤثر في التعبير المطلق ميرنا داخل الدم.
ميرنا النسخ العكسي والتضخيم تمثل خطوات حاسمة 2. لاثنين من التقنيات الرئيسية للكشف عن ميرنا (أي.، قرة-بكر وميكرواري)، اخترنا qRT-بكر نظراً لحساسيتها العالية، ونحن بحاجة إلى تقييم فريق مختارة فقط من ميرناس (قيداً رئيسيا لهذه المنهجية هو أن الإنتاجية منخفضة)15. كنا الكيمياء النسخ العكسي استناداً إلى 3 'بوليا تراجع 5' ربط محول تسلسل وتمديد ميرنا ناضجة وتسمح الصلب العالمي RT كبسولة تفجير. تقوم على الاعتراف بقاعدة بين زوج واحد، يمكن أن تساعد على ربط محول 5 'تجنب التحيز الشائعة مثل تلك المرتبطة بعدم تطابق 5'. هذه المجموعة تشمل أيضا خطوة تضخيم قبل ما مطلوب للعينات منخفضة الغلة، مثل البلازما. على الرغم من أن لزم الأمر، يمكن إدخال هذه الخطوة بعض التحيزات التضخيم قبل الخطوة الكشف.
في هذا البروتوكول، قمنا بتحليل فريق من 24 ميرناس المحدد يرتبط بالأوعية. على وجه الخصوص، اخترنا لوحات مخصصة رصدت قبل التحقيق واتباع إرشادات الشركة المصنعة ليدير qRT-PCR. القضايا الرئيسية المتصلة بميرنا qRT-PCR هي اختيار مرجع الجينات وتطبيعها تحليل البيانات اللاحقة.
على الرغم من أن العديد من الدراسات التي أجريت لتحديد ميرنا أفضل استخدام للتطبيع، قد تم التوصل إلى أي توافق في الآراء موحدة. لمعالجة هذا القيد، قمنا بحث في الأدب الطبي لتحديد ميرناس المتداولة التي يمكن استخدامها كمرجع الجينات في سلسلة القضية.
ونحن أيضا مختارة ميرناس 4 مع أدلة قوية التعبير مستقرة في عينات البلازما من المرضى بترول واختبار لهم في أصغر جزء من سلسلة القضية. وحددت ميرناس الأكثر استقرارا 2 تحليل جينورم كمرجع الجينات التدبير المنزلي.
وفي الختام، تقييم تعميم ميرناس في عينات الدم المحيطي يحتوي على عدد من الصعوبات المعروفة. ومع ذلك، نعتقد أن المنهجيات المستخدمة ونحن موثوقة وقوية، مما يسمح بإجراء دراسة متعمقة ودقيقة لهذه المؤشرات الحيوية التي لها القدرة على تغيير السيناريو العلاج لسرطان القولون والمستقيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة جزئيا s.p.a. روش ووكالة الأدوية الإيطالية (أيفا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1,000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
