本文介绍了利用高频超声对小鼠胎鼠进行活体分析的技术。该方法可在整个妊娠过程中对胎鼠进行追踪，并分析胎盘参数以及母体和胎儿的血流情况。
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本文内容
摘要
摘要
超声成像是一种广泛用于检测人体和动物组织中器官异常及肿瘤的方法。该方法具有无创、无害、无痛的特点，操作简便、快速，且可在任何地点进行，甚至可使用移动设备完成。在妊娠期间，超声成像被常规用于密切监测胎儿发育情况。该技术对于评估宫内生长受限（IUGR）至关重要，IUGR是一种对母亲和胎儿均可能造成短期和长期健康影响的妊娠并发症。深入了解IUGR的发生机制，对于制定有效的治疗策略不可或缺。
本研究中使用的超声系统是一种专为小型动物分析而设计的超声设备，可应用于包括妊娠研究在内的多个研究领域。本文描述了该系统用于对自然杀伤（NK）细胞/肥大细胞（MC）缺陷型母鼠所孕育的宫内生长受限胎鼠进行in vivo（活体）分析的操作方法。该实验方案包括系统的准备、小鼠在测量前及测量过程中的处理，以及B模式、彩色多普勒模式和脉冲波多普勒模式的使用。检测指标包括胎儿大小、胎盘大小以及胎儿血供情况。我们发现，从妊娠中期开始，NK/MC缺陷型小鼠的着床部位尺寸减小，胎盘体积更小。此外，MC/NK缺陷与胎儿脐动脉（Arteria umbilicalis, UmA）舒张末期血流缺失或反向以及阻力指数升高相关。本方案所述方法可便捷地应用于相关或非相关的研究课题中。
引言
超声波是指频率高于人耳可听范围的声波，通常高于约20 kHz1。蝙蝠、鲸类、海豚2，3、小鼠4、大鼠5以及鼠狐猴6等动物均利用超声波进行定位或交流。人类则将超声波应用于多种技术和医学领域。超声设备能够产生声波，并对信号进行发射和显示。当超声波遇到障碍物时，声波会被反射、吸收或穿透该物体。将超声波作为成像手段的应用称为超声成像（sonography），广泛用于人医或兽医领域中对有机组织的分析，例如心脏（超声心动图）7，8、肺部9、甲状腺10、肾脏11以及泌尿和生殖道12，13；用于检测胆结石14和肿瘤15；以及评估血管或器官的灌注情况
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方案
本文所述所有方法均已获得“萨克森-安哈尔特州行政管理局：42502-2-1296UniMD”的批准。
1. 实验步骤
- 将6至8周龄的雌性肥大细胞缺乏型C57BL/6J-Cpa3Cre/+ (Cpa3Cre/+)小鼠与肥大细胞正常型C57BL/6J-Cpa3+/+（品系对照；Cpa3+/+）小鼠分别与BALB/c雄性小鼠交配。
- 在确认阴道栓后定义妊娠第0天（gd 0），并在确认阴道栓后立即对雌鼠进行处理。
注：阴道栓是雄鼠精子在雌鼠阴道口形成的栓状物。- 对对照组Cpa3+/+ 雌鼠腹腔注射250 µL PBS。
- 对肥大细胞缺乏型Cpa3Cre/+ 雌鼠腹腔注射250 µL抗CD122抗体（0.25 mg）。
注：如先前研究所述22，注射0.25 mg抗CD122抗体可耗竭肥大细胞缺乏型Cpa3Cre/+ 雌鼠外周及子宫自然杀伤细胞（NKs和uNK....
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结果
本论文所用超声系统的各个组成部分如图1所示。图2展示了在妊娠第5、8、10和12天（gd5、8、10和12）以B模式获取的代表性超声图像(B)以及相应的着床区域测量结果(A)，显示从gd10开始，经抗CD122处理的Cpa3Cre/+ 小鼠的着床区域显著减小。
图3展示了在B模式下获取的植入部位各组成部分（底蜕膜、胎盘、胚胎）图像（图3A），以及进行的胎盘测量（面积、厚度、直径）（图3B）。与对照组WT小鼠相比，抗CD122处理的Cpa3Cre/+
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讨论
利用我们的超声系统，我们证实了从妊娠第10天（gd10）开始，MC/NK缺陷型母鼠出现胎儿生长受限。此外，在gd10和gd12时，我们观察到胎盘尺寸减小；在gd14时，部分uMC/uNK缺陷型小鼠胎儿的脐动脉（UmAs）出现舒张末期血流缺失或反向。这一血管化不良的征象与动脉显著增高的阻力指数相关，提示存在宫内生长受限（IUGR）。结果证实了uMCs和uNKs在妊娠维持、胎儿健康以及理解IUGR发展过程中的重要作用。
该方案适用于妊娠第5天（gd5）及之后的每一天（着床后）。方案中有一些关键步骤必须加以考虑。首先，脱毛操作必须谨慎进行。例如，脱毛膏与皮肤接触过度可能引起皮肤刺激；然而，脱毛不彻底会导致信号干扰，在屏幕上表现为阴影。信号不足（如出现阴影或图像颗粒感）的另一个原因可能是小鼠与超声波束之间使用的耦合胶用量过少。根据我们的经验，为获得足够的信号可见性，需要使用相对大量的耦合胶（约10 mL）。其次，二维测量在某种程度上容易产生误差。为了尽量减少不同着床部位之间的测量差异，建议在环绕着床部位测量时采用可达到的最大尺寸。为精确测量胎盘，所有着床部位均应调整至能够观察到脐动脉（Um.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们非常感谢成像仪器公司（特别是 Magdalena Steiner、Katrin Suppelt 和 Sandra Meyer）提供的愉快而迅速的支持，以及他们对我们关于成像系统及其使用方面所有问题的及时且全面的解答。我们感谢德国海德堡 DKFZ 的 Hans-Reimer Rodewald 教授和 Thorsten Feyerabend 博士提供了 Cpa3 品系。此外，我们感谢 Stefanie Langwisch 负责小鼠品系的管理，并生成了图 1 中的图片。
本工作及成像系统由德国研究基金会（DFG）向 A.C.Z. 提供的资助（ZE526/6-1 和 AZ526/6-2）支持，这些项目隶属于 DFG 优先计划 1394 "健康与疾病中的肥大细胞"。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LEAF 抗小鼠 CD122（IL-2Rb） | BioLegend | 123204 | 克隆 TM-β1；500 µg |
| Vevo 2100 系统 | FujiFilm VisualSonics Inc. | 换能器 MS550D-0421 | |
| Vevo LAB 软件 | FujiFilm VisualSonics Inc. | ||
| 异氟烷 | Baxter | PZN: 6497131 | |
| 电极凝胶 | Parker | 12_8 | |
| 手术胶带 | 3M Transpore | 1527-1 | |
| 眼药膏 | Bayer | PZN: 1578675 | |
| 棉签 | Raucotupf | 11969 | 100 支 |
| 脱毛膏 | Reckitt Benckiser | 2077626 | |
| 敷料 | Nobamed Paul Danz AG | 856110 | 10 x 10 cm |
| 超声耦合剂 | Gello GmbH | 246000 |
参考文献
- Abramowicz, J. S., Kremkau, F. W., Merz, E. Ultraschall in der Geburtshilfe: Kann der Fötus die Ultraschallwelle hören und die Hitze spüren? Ultraschall in der Medizin. 33 (3), Stuttgart, Germany. 215-217 (1980).
- Jones, G. Echolocation. Current Biology. 15 (13), R484-R488 (2005).
- Simmons, J. A.
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重印与许可
