Este protocolo descreve um fluxo de trabalho detalhado para a geração e ex vivo caracterização de vírus Oncolíticos para expressão de imunomoduladores, usando vírus de sarampo codificação participantes de célula T bispecific como exemplo. Aplicação e adaptação para outras plataformas de vetor e transgenes irão acelerar o desenvolvimento do romance immunovirotherapeutics de tradução clínica.
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Artigo de método
Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Bem sucedida imunoterapia tem potencial para alcançar controle de tumor a longo prazo. Apesar dos sucessos clínicos recentes, ainda há uma necessidade urgente de terapias seguras e eficazes, adaptados para imune perfis individuais do tumor. Vírus Oncolíticos permitem a indução de respostas imunes de anti-tumor, bem como a expressão do gene tumor restrito. Este protocolo descreve a geração e ex vivo análise de imunomoduladores Oncolíticos vetores. Enfocando o vírus de sarampo vacina codificação participantes de célula T bispecific como exemplo, a metodologia geral pode ser adaptada para outras espécies de vírus e transgenes. O fluxo de trabalho apresentado inclui o projeto, clonagem, resgate e propagação de vírus recombinantes. Ensaios para analisar a cinética de replicação e atividade lítica do vetor, bem como a funcionalidade do imunomodulador isolado ex vivo são incluídos, facilitando assim a geração de novos agentes para o desenvolvimento em modelos pré-clínicos e, finalmente, Tradução clínica.
Introdução
Vírus Oncolíticos (OVs) estão sendo desenvolvidos como terapêutica anticâncer que especificamente replicar dentro e matar as células do tumor, deixando os tecidos saudáveis intactas. Tornou-se comum de entendimento que virotherapy Oncolíticos (OVT), na maioria dos casos, não depende unicamente da lise completa tumor por replicação eficiente e propagação do vírus, mas requer mecanismos adicionais de ação para o sucesso do tratamento, incluindo vascular e do estroma direcionamento e, importante, estimulação imune1,2,3,4. Enquanto muitos estudo....
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Protocolo
Nota: [O], [P] e [M] indicar aplicáveis às subseções: OVs, em geral, (a maioria) paramyxoviruses ou MV, respectivamente. [B] indica seções específicas para BTE transgenes.
1 clonagem de Transgenes imunomodulador-codificação em vetores de vírus do sarampo
-
[O] design Insira a sequência.
- [O] decidir sobre um imunomodulador de interesse com base na pesquisa de literatura ou em dados exploratórios como telas genética41 e derivam a sequência de cDNA relevantes de bancos de dados apropriados como GenBank, o arquivo de Nucleotide Europeu, ou o sistema de informação de Im....
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Resultados
A Figura 1 ilustra o mecanismo de ação do vírus de sarampo Oncolíticos codificação bispecific célula T participantes. Um fluxograma descrevendo o fluxo de trabalho do presente protocolo é apresentado na Figura 2. A Figura 3 mostra um exemplo de um genoma do vírus de sarampo Oncolíticos modificados. Isso fornece uma representação visual das mudanças específicas aplicadas aos sarampo .......
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Discussão
Oncolíticos imunoterapia (i. e., OVT em combinação com imunomodulação) é uma grande promessa para tratamento de câncer, exigindo ainda mais desenvolvimento e otimização de vírus Oncolíticos codificação immunomodulatory proteínas. Este protocolo descreve métodos para gerar e validar tais vetores para testes subsequentes em modelos pré-clínicos relevantes e potencial futura tradução clínica em novela terapêutica anticâncer.
Inúmeras plataformas de vírus Oncolíticos diferentes com vantag.......
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Divulgações
C.E. Engelen é listado como co-inventor de um vírus de RNA sobre patentes para câncer Immunovirotherapy propriedade da Universidade de Heidelberg. J.P.W. Heidbuechel não tem nada para divulgar.
Agradecimentos
Esses métodos foram estabelecidos no grupo Virotherapy, liderado pelo Prof Dr. Dr. Guy Ungerechts no centro nacional para doenças tumorais em Heidelberg. Estamos em dívida para com ele e todos os membros da equipe do laboratório, especialmente Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler e Jessica Albert. Este trabalho foi apoiado pela outra Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 ao C.E. Engelen) e Fundação de ciência nacional alemã (DFG, conceder EN 1119/2-1 ao C.E. Engelen). J.P.W. Heidbuechel recebe um estipêndio pela escola de pós-graduação Internacional de Helmholtz para pesquisa do câncer.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DNA rápido Dephos & Kit de ligadura | Roche Life Science, Mannheim, Alemanha | 4898117001 | |
| Kit de clonagem de PCR CloneJET | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha | A9539-500G | |
| QIAquick Kit de extração de gel | QIAGEN, Hilden, Alemanha | 28704 | |
| NEB 10-beta Competente E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Alemanha | C3019I | |
| LB meio segundo Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | X964.1 | |
| Ampicilina | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | HP62.1 | |
| QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Alemanha | 27104 | |
| Enzima de restrição HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Alemanha | R3104S | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Alemanha | 31966-021 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Biosera, Boussens, França | FB-1280/500 | |
| FugeneHD | Promega, Mannheim, Alemanha | E2311 | pode ser substituído por reagente de transfecção de escolha |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha | K0129 | |
| Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
| B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | disponível mediante solicitação | |
| Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Alemanha | ACC 342 | |
| Opti-MEM (meio sem soro) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 31985070 | |
| Célula Colorimétrica Kit de Viabilidade III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Alemanha | PK-CA20-300-1000 | inclui reagente XTT |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) de DulbeccoGibco | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 14190-094 | |
| Colunas de rotação QIAquick Ni-NTA | QIAGEN, Hilden, Alemanha | 31014 | |
| Cloreto de sódio | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 3957.3 | |
| Imidazol | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Alemanha | UFC901024 | |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Merck Milipore | 71285-3 | |
| IgG de soro humano | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha | I4506 | |
| Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
| IgG1 de camundongo, controle de isotipo kappa, conjugado com ficoeritrina, clone MOPC-21 anticorpo | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 555749 | RRID: AB_396091 |
| Anticorpo anti-HA-biotina, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
| MicroBeads anti-biotina | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-090-485 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-042-201 | |
| Separador MiniMACS | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha | 130-042-303 | |
| Tampão RIPA | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, EUA | MB-030-0050 | |
| CytoTox 96 Ensaio de citotoxicidade não radioativa | Promega, Mannheim, Alemanha | G1780 | inclui solução de lise 10x, solução de substrato (mistura de substrato e tampão de ensaio) e solução de parada |
| Elevador de | Corning, Reynosa, México | 3008 | |
| pratos de 10 cm | Corning, Oneonta, NY, EUA | 430167 | |
| pratos de 15 cm | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha | 639160 | |
| Placas de 96 poços, TPP de fundo em U | , Trasadingen, Suíça | 92097 | |
| Placas de 96 poços, fundo plano | Neolab, Heidelberg, Alemanha | 353072 | |
| placas de 6 poços | Neolab, Heidelberg, Alemanha | 353046 | |
| placas de 12 poços | Neolab, Heidelberg, Alemanha | 353043 | |
| tubos de 50 mL | nerbe plus, Winsen/Luhe, Alemanha | 02-572-3001 | |
| Frascos de cultura de células T175 | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
| 0.22 µ Filtros Merck | , Darmstadt, Alemanha | SLGPM33RS |
Referências
- Lichty, B. D., Breitbach, C. J., Stojdl, D. F., Bell, J. C. Going viral with cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (8), 559-567 (2014).
- Cassady, K. A., Haworth, K. B., Jackson, J., Markert, J. M., Cripe, T. P. To Infection and Beyond: The Multi-Pronged Anti-Cancer Mechanisms of....
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Reimpressões e permissões
