Aqui, descrevemos um protocolo detalhado descrevendo uma fluorescente nova técnica para detecção de proteínas totais em gel de poliacrilamida de coloração. O protocolo utiliza uma sonda de excitante prata íon-específicos de fluorescência, que detecta Ag+-complexos de proteínas e elimina determinadas limitações de manchas de prata cromogênica tradicionais.
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Artigo de método
Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida
Neste artigo
Resumo
Resumo
Coloração prata é uma técnica colorimétrica amplamente usada para visualizar bandas de proteínas em gel de poliacrilamida após eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE). As manchas de prata clássicas tem alguns inconvenientes, tais como o fundo elevado, coloração, recuperação de proteína pobre, baixa reprodutibilidade, uma estreita faixa dinâmica linear para quantificação e compatibilidade limitada com espectrometria de massa (MS). Agora, com o uso de uma sonda de fluorogenic Ag+ , TPE-4TA, desenvolvemos uma fluorescente prata coloração método para a visualização de proteínas totais em gel de poliacrilamida. Esta mancha nova evita a etapa de redução de prata problemático em manchas de prata tradicionais. Além disso, a mancha de prata fluorescente demonstra boa reprodutibilidade, sensibilidade e quantificação linear na detecção de proteínas, tornando-se uma mancha de gel de proteína útil e prático.
Introdução
Muitos métodos de coloração têm sido usados para visualizar proteínas após eletroforese em gel, por exemplo, usando colorimétricos corantes como azul de Coomassie brilhante, mancha prateada, fluorescência, ou radioativo rotulagem1,2, 3 , 4. coloração prata é considerada uma das técnicas mais sensíveis para a deteção de proteínas que requerem reagentes simples e baratos. Pode ser classificado em duas grandes famílias: a mancha de prata amoniacal e o nitrato de prata mancham5,6. O méto....
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Protocolo
1. preparação do Gel
Nota: A demonstração segue um protocolo padrão para preparar o gel para coloração pouco depois de SDS-PAGE12. Em resumo, as etapas a seguir descrevem a preparação das amostras e electroforese do gel.
- Executar SDS-PAGE com géis de proteína de Bis-Tris 4% - 12% (1 mm, 15-bem) usando um gel de mini tanque cheio de 2-(N -Morpholinos) etanesulfónico tampão de ácido (MES).
- Dilua as amostras com uma mistura de água destilada, lítio Dodecil sulfato de sódio (LDS) buffer e um agente de redução de amostra.
- Carrega a primeira pista com o dobro da quantidade de ações (1....
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Resultados
As bandas de proteínas coradas pela mancha prata fluorescente apresentam uma fluorescência verde intensa sob uma lâmpada de UV 365 nm. Todas as bandas de proteínas 14 (10-200 kDa), de cima para baixo, eram claramente visíveis, correlacionando-se bem com os 14 cor vermelha manchada com o Ruby SYPRO corante (Figura 2)10.
Em relação a deteção quantitativa de proteína, os géis fo.......
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Discussão
Apresentado aqui é uma romance prata fluorescente método de coloração para proteínas em gel de poliacrilamida. Essa estratégia integra convencionais prata manchas e manchas fluorescentes. As façanhas de coloração a ligação seletiva de íons de prata às proteínas como em outra prata manchas mas emprega uma prata fluorogenic altamente sensível sonda TPE-4TA para iluminar as proteínas prata acopladas. Desde que a sonda fluorogenic TPE-4TA pressentem-se íons de prata em concentrações bastante.......
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Divulgações
Tem sido apresentado um pedido de patente nesta coloração fluorescente de prata.
Agradecimentos
Os autores gostaria agradecer Patrick Chan no centro de Lau Wai Ming para medicina reparativa, Karolinska Institutet, seu suporte técnico. S. X. é grato pelo apoio do Conselho de pesquisas sueco (Grant No. 2017-06344).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
Tampão de Amostra LDS (4X) | Reagente Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
Géis de Proteína Bis-Tris 4-12%, 1,0 mm, 15 poços | Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Amostra de Gel Pré-moldado |
| (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagente |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagente |
| Mini Tanque de Gel | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipamento |
| 300W Fonte de Alimentação (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | |
| Equipamento Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Amostra |
| Nitrato de prata | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagente |
| Etanol | Bragg e co. | 42520J | Reagente |
| Ácido acético | J.T. Baker | 103201A | Reagente |
| Milli-Q Síntese A10 | Merk-Fornece | 18,2 MΩ. sistema de documentação de gel de água | |
| cm (modelo c600) | Azure biosystems-Equipment |
Referências
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coor....
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Reimpressões e permissões
