Aquí, describimos un método de imagen de alto contenido para cuantificar el transporte de los mutantes de la rodopsina asociada con retinitis pigmentosa. Un análisis de puntuación de múltiple longitud de onda se utilizó para cuantificar la proteína rodopsina en la superficie celular o en la célula entera.
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Artículo de método
Un análisis de transporte de la rodopsina por análisis de la proyección de imagen de alto contenido
En este artículo
Resumen
Resumen
Rhodopsin causa mutaciones conducen a la muerte de fotorreceptores de varilla que se manifiesta como un autosoma dominante pigmentosa de la retinitis (RP), una progresiva ceguera que carece de tratamiento eficaz. Presumimos que la citotoxicidad de los mutantes de la rodopsina mal plegadas puede ser aliviada por farmacológicamente estabilización de la proteína rodopsina mutante. La mutación P23H, entre las otras mutaciones de la rodopsina de clase II, codifica una proteína mutante de rodopsina estructuralmente inestables que se acumula en el retículo endoplásmico (ER), mientras que la rodopsina de tipo salvaje es transportada a la membrana plasmática en mamíferos células. Realizamos previamente una pantalla basada en la luminiscencia de alto rendimiento (HTS) e identificó un grupo de chaperonas farmacológicas que rescató el transporte de la rodopsina P23H de ER a la membrana plasmática. Aquí, usando un método de immunostaining seguido de un análisis de proyección de imagen de alto contenido, cuantificar la cantidad de la proteína rodopsina mutante en la célula entera y en la membrana plasmática. Este método es informativo y eficaz para identificar los verdaderos éxitos de falsos positivos después de HTS Además, el análisis de imágenes de alto contenido permitió cuantificar parámetros múltiples de un solo experimento para evaluar las propiedades farmacológicas de cada compuesto. Usando este análisis, se analizó el efecto de 11 diferentes compuestos hacia seis mutantes de rodopsina RP asociada, obteniendo un perfil farmacológico del 2-D para una comprensión cuantitativa y cualitativa acerca de la estabilidad estructural de estos mutantes de la rodopsina y eficacia de los diferentes compuestos a estos mutantes.
Introducción
Mal plegamiento de la proteína está implicada en la distrofia muscular, degeneraciones neuronales, así como enfermedades cegadoras, incluida la retinitis pigmentosa (RP)1. RP es una degeneración retiniana hereditaria y progresiva asociada a mutaciones en más de 60 genes que afectan a la función y la homeostasis de los fotorreceptores de la barra o la retina pigmentada epitheliums (RPEs)2,3. No hay tratamiento eficaz está disponible para RP. Rhodopsin mutaciones representan alrededor del 25-30% de autosómica dominante (ad) casos RP. Entre los más de 150 rodopsina mutaci....
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Protocolo
Nota: El rodopsina transporte ensayo.
1. preparación y cultivo de células
- Revivir el crio-preservado U2OS estable las células que expresan el tipo salvaje (WT) o proteínas de fusión de Venus de la rodopsina de ratón mutante. Descongelar las células a 37 ° C hasta que quedan sólo los cristales de hielo en el frasco.
Nota: Las células U2OS se utilizan en este protocolo porque no se dispone de ninguna línea de células del fotorreceptor para estudios en vitro y la biosíntesis de la ciliar de la rodopsina está reglamentada por mecanismos moleculares similares en células de mamíferos. Además, las células U2O....
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Resultados
Nos caracteriza el transporte rodopsina con tres parámetros: la intensidad de la rodopsina-Venus en la célula entera (rodopsina-Venus INT), la intensidad de la inmunotinción de la rodopsina en la membrana plasmática (INT de la rodopsina en la superficie celular) y la relación de mancha de rodopsina en la superficie de la célula a la intensidad de la rodopsina-Venus en la célula entera (cociente de MEM-Total). Un resultado representativo del ensayo de transporte rhodopsin se muestra en la .......
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Discusión
Aquí, mostramos un análisis de imagen de alto contenido utilizado para caracterizar hits identificados de un HTS La automatización única en estos protocolos es el reproductor de imágenes de alto contenido. El immunostaining y proyección de imagen de la fluorescencia de la rodopsina se han utilizado comúnmente para caracterizar la localización de la rodopsina5,14,15,16. Sin embargo, la cuantific.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Mark E. Schurdak y descubrimiento de fármacos de la Universidad de Pittsburgh para proporcionar las imágenes de alto contenido y formación inicial. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) generosamente compartida la 4 1 y los anticuerpos anti-rodopsina B630. El plásmido que contiene el cDNA del constructo de Venus rodopsina de ratón fue compartido por el Dr. Nevin Lambert (Universidad de Augusta). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de concesión de la salud EY024992 YC y P30EY008098 de grant de la Universidad de Pittsburgh visión investigación base.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células U2OS (rodopsina-Venus) | NA | NA Células estables generadas a partir de células U2OS | |
| Células U2OS (T4R-rodopsina-Venus) | NA | NA Células estables NA generadas a partir de células U2OS | |
| Células U2OS (P23H-rodopsina-Venus) | NA | NA | Células estables generadas a partir de células U2OS |
| Células U2OS (P53R-rodopsina-Venus) | NA | NA Células estables generadas a partir de células U2OS | |
| Células U2OS (C110Y-rodopsina-Venus) | NA | NA Células estables generadas a partir de células U2OS | |
| Células U2OS (D190N-rodopsina-Venus) | NA | NA Células estables NA generadas a partir de células U2OS | |
| Células U2OS (P267L-rodopsina-Venus) | NA | NA | Células estables generadas a partir de células U2OS |
| DMEM alta glucosa | Genesee Scientific | 25-500 | Con L-Glutamina, sodio piruvato |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 16140071 | Plasmocina inactivada por calor |
| InvivoGen | ant-mpt | Reactivo de eliminación de micoplasmas | |
| Penicilina-Estreptomicina (100X) | Gibco | 15140122 | 100X soluciones antibióticas concentradas para prevenir la contaminación bacteriana de los cultivos celulares |
| Tripsina-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0,25%, 1 mM de EDTA en HBSS sin solución |
| poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70.000-150.000, 0,01%, filtrado estéril, Biorreactivo, apto para cultivo celular |
| CellCarrier-384 Ultra Microplacas PerkinElmer | 6057300 | Microplacas tratadas con tejido de 384 pocillos con paredes de pocillos negras y un fondo de olefina cíclica ópticamente transparente para la obtención de imágenes de células en análisis | |
| de alto contenidoPlaca estéril de 96 pocillos | Eppendorf | 30730119 | Cultivo de tejidos tratado con tapa de fondo plano, estéril, libre de pirógenos detectables, Rnasa, DNasa y ADN. |
| Sailina tamponada de fosfato no citotóxico (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x tampón PBS, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cultivo celular probado |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compuestos probados | Selleckchem/Life Chemicals/Compuestos de NA sintetizados a medida | fueron comprados de diferentes proveedores o anticuerpo | |
| anti-rodopsina B6-30 | Novus | NBP2-25160 | Regalo del Dr. Krzysztof Palczewski |
| Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehído | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Sin metanol |
| 10% Suero de cabra normal | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Tampón de bloqueo |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Solución de tinción nuclear |
| Generador de imágenes de alto contenido | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Sistema de adquisición de imágenes de alto contenido Micro Confocal |
| MetaXpress software de adquisición y análisis de imágenes de alto contenido | Molecular Devices | MetaXpress | Software de adquisición y análisis de imágenes de alto contenido |
| Pipeta multicanal (0,5-10 y micro; L) | Pipeta | manual de 8 canales Rainin 17013802, 0.5-10 y micro; L | |
| Pipeta multicanal (0,5-10c | Rainin 17013805 | Pipeta manual de 8 canales, 20-200 y micro; L | |
| Pipeta electrónica multicanal (10-200 μ L) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Pipeta electrónica multicanal para tareas de pipeteo de microplacas de 96 y 384 pocillos |
| Depósito de reactivos de 50 ml | Genesee Scientific | 28-125 | Reservador de reactivos para dispensación de pippte multicanal |
| Aspirador de 8 canales | ABC Scientific | EV503 | Adaptador de acero inoxidable de 8 canales para aspirar líquidos de placas de 96 o 384 pocillos |
| Excel software de hojas de cálculo | Microsoft | Excel2016 | El software de hojas de cálculo para el análisis de datos y la generación |
| de mapas de calor Origin2018 software de análisis y gráficos de datos científicos | OriginLab | Origin2018 | El software de análisis de datos para generar las curvas de dosis-respuesta |
Referencias
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. <....
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Reimpresiones y permisos
