Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Høy gjennomstrømming Nitrobenzoxadiazole-merket kolesterol middelklasseinnbyggere analysen

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58891
Automatic Translation
1, 1, 1
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

Summary

Måling av i vitro kolesterol middelklasseinnbyggere serum- eller macrophage celle modeller er et lovende verktøy som en biomarkør for aterosklerose. Studien, vi optimalisere og standardisere fluorescerende NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere metode og utvikle en høy gjennomstrømming analyse bruker 96-brønns plater.

Abstract

Aterosklerose fører til hjerte-og karsykdommer (CVD). Det er fortsatt uklart om kolesterol-HDL (cHDL) konsentrasjon spiller en årsakssammenheng rolle i aterosklerose utvikling. En viktig faktor i tidlige stadier av atheroma plakk formasjon er imidlertid kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet til HDL (muligheten til HDL partikler godta kolesterol fra makrofager) for å unngå skum celle formasjon. Dette er et viktig skritt unngå akkumulering av kolesterol i endotelet og en del av omvendt kolesterol transport (RCT) for å eliminere kolesterol gjennom leveren. Kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet til serum- eller macrophage celle modeller er et lovende verktøy som kan brukes som biomarkør for aterosklerose. Tradisjonelt [3H]-kolesterol er brukt i kolesterol middelklasseinnbyggere analyser. I denne studien ønsker vi å utvikle en tryggere og raskere strategi med fluorescerende merket-kolesterol (NBD-kolesterol) i en mobilnettet analysen å spore kolesterol opptak og middelklasseinnbyggere prosessen THP-1-derivert makrofager. Til slutt, vi optimalisere og standardisere NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere metoden og utvikle en høy gjennomstrømming analyse bruker 96-brønns plater.

Introduction

Ifølge Verdens helseorganisasjon er de gjeldende viktigste årsakene til dødsfall verdensomspennende iskemisk hjertesykdom og hjerneslag (Regnskapsførsel for totalt 15,2 millioner dødsfall)1. Begge er karsykdommer (CVD) som kan innledes med åreforkalkning og brudd på plaketter av atheroma i blodårene2,3.

Atherosclerosis er et fartøyet veggen inflammatorisk sykdom som makrofager, T-celler, mastceller og dendrittiske celler infiltrere endotelet og akkumuleres fra blod, til slutt danne aterosklerotisk plaketter. Aterosklerotisk plaketter presentere en lipid kjernen og kolesterol krystaller, dokumentert av høyoppløselige B-modus ultrasonography målinger av carotis intima media tykkelse4,5. I makrofager utføres kolesterol middelklasseinnbyggere mot lipid acceptor partikler av ATP-bindende kassett (ABC) receptors ABCA1, ATP bindende kassett gruppe G medlem 1 (ABCG1), og scavenger receptor SR-BI. Ubalansen av kolesterol tilstrømningen og middelklasseinnbyggere i makrofager er ansett som en viktig prosess i aterosklerose innvielsen6. Kolesterol middelklasseinnbyggere er ansett som et viktig skritt i kolesterol eliminering fra perifere vev plasma og lever i en prosess som kalles omvendt kolesterol transport (RCT). Kolesterol overføres fra makrofager hovedsakelig til apolipoprotein A1 (ApoA1) på overflaten av high-density lipoprotein (HDL) partikler. Deretter transportere HDL kolesterol til leveren for utskillelse og re utnyttelse7,8,9.

Tritium (3H) radio-merket kolesterol er tradisjonelt brukt i kolesterol middelklasseinnbyggere10. Utslipp signalet fra radioisotopes er svært følsom10; imidlertid presenterer radio-merket kolesterol åpenbare handikap som lang protokoller, risiko for eksponering for ioniserende stråling og behovet for spesiell radioaktivitet lokaler og utstyr å sikre trygg håndtering av radioaktivt utslipp. Tvert imot, vært fluorescens vellykket innarbeidet i diagnostiske teknikker på grunn av sin enkelhet i fluorescerende signalgjenkjenning, rekke fluorophores tilgjengelige og dens sikkerhet11. Flere fluorescerende-merket steroler har blitt brukt til å studere kolesterol metabolisme inkludert dehydroergosterol (med iboende fluorescens), dansyl kolesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - kolesterol og 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-OL (NBD-kolesterol). Spesielt, presenterer NBD-kolesterol en effektiv opptak i menneskelige celler12. To forskjellige NBD merket-kolesterol er tilgjengelige: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) og 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figur 1). Kolesterol merket med 22-NBD moiety kan best passer kolesterol middelklasseinnbyggere studier, mens 25-NBD-kolesterol brukes hovedsakelig i mobilnettet membran dynamics research13,14.

Cellelinjer vanligvis brukes i i vitro kolesterol middelklasseinnbyggere analyser er monocytt-lignende celler som menneskelige leukemi-avledet THP-1 celler, murine rå 264.7 celler15eller J774.1. Alle disse cellene kan differensieres i makrofager i vitro bruker phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), men THP-1-derivert makrofager (dmTHP-1) beste reflektere og etterligne menneskelige makrofager16.

Studien, vi optimalisere og standardisere fluorescerende høy gjennomstrømming metode for å fastslå kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet serumprøver på dmTHP-1, med 22-NBD-kolesterol som et alternativ til [3H]-kolesterol. I tillegg sammenligne vi optimalisert fluorescerende teknikken med standard radioaktivt analog.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For denne studien, ble etisk komité godkjenning (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, sykehus klinikk, Barcelona, godkjenningsnummer HCB/2014/0756) og skriftlig informert samtykke fra alle fag innhentet.

1. neste arbeidsdag-kolesterol forberedelse

  1. Oppløse NBD-kolesterol (MW 494.63, se Tabellen for materiale) i ren etanol for å få aksjer (2 mM). For en 10 mg hetteglass, løses hele medisinglass innholdet i en 10,1 mL volum av etanol å få en 2 mM lager.
  2. Fortynne NBD-kolesterol fra lager i RPMI 1640 supplert med 10% fosterets bovin serum og 5% penicillin/streptomycin (R10 medium) å nå en siste konsentrasjon på 5 μM (f.eks, få 10 mL NBD-kolesterol på 5 μM siste konsentrasjon) ved fortynne 25 μL NBD-kolesterol lager (2 mM) i R10 medium. Dette er tilstrekkelig for en 96-brønns plate.

2. celle kultur og Seeding (dag-2)

  1. Kultur THP-1 celler i R10 medium ved 37 ° C, 5% CO2. Justere 0.3 x 106 celler/mL hver tredje dag.
  2. Ætt cellene i en hvit 96-brønns plate med en flat, klart nederst på 0,2 x 106 celler/vel R10 medium (100 μL per brønn).
  3. Behandle cellene med 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, fra en 10 μM aksje) for 48-72 h, rugende ved 37 ° C, 5% CO2 å skille THP-1 celler i dmTHP-1.
    Merk: Det anbefales å bruke 5 μL PMA lager (10 μM) i 500 μL R10 medium. Før dette forberede en 10 μM PMA lager ved oppløsning lyofilisert 1 g ampuller i 10 mL dimethyl sulfoxide (DMSO), aliquot og lager på 20 ° C.
  4. Alternativt (forslag) kombinerer trinn 2.2 og 2.3 for bedre homogenisering. Forberede 10 mL av THP-1 celler i en 15 mL tube, tilsett 200 μL av PMA lager (10 μM), bland forsiktig og umiddelbart frø 100 μL per brønn på platen. Inkuber cellene som beskrevet i trinn 2.3.

3. Apolipoprotein B utarmet Serum (ABDS) forberedelse (dag 2 eller 3)

  1. For å forberede en polyetylenglykol (PEG)-løsning, kan du fortynne glysin i 10% PBS (med sterilt H2O) til en konsentrasjon av 200 mM ved pH 7.4. Legge til 40 mL 200 mM glysin 10 g av PEG 8000 hente PEG 20% (w/v). Bland løsningen kraftig homogenize.
  2. Bruke 4 deler av 20% pinne per 10 deler av serum/plasma på hver serum/plasmaprøve i en 1,5 mL tube og la blandingen på is 25 min17 (f.eks for 100 μL plasma eller serum, legge 40 μL 20% pinne løsning).
  3. Sentrifuge PEG-apolipoprotein B bunnfall 13.000 x g i 15 min på 4 ° C.
  4. Kast utløse. Overføre nedbryting til en ny tube.
    Merk: Vi foreslår forbereder ABDS i dag 3 (frisk). Hvis det ikke er mulig, forberede ABDS på dag 2 og holde det på 4 ° C over natten.

4. neste arbeidsdag-kolesterol celle lasting (dag 2)

  1. Forkaste kultur medium av dmTHP-1 og vask cellene to ganger med 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
  2. Laste inn cellene med 5 μM NBD-kolesterol (100 μL per brønn) i R10 medium og ruge over natten ved 37 ° C, 5% CO2.

5. inkubasjon med kolesterol Acceptors (3. dag)

  1. Forkaste mediet og vask cellene to ganger med PBS.
  2. Inkuber cellene med 2 – 5% ABDS eller ønsket konsentrasjonen av renset lipid acceptor (HDL, ApoA, ApoE, etc.) fortynnet i fargeløs RPMI 1640 medium (100 μL per brønn) 4-6 h på 37 ° C.
    Merk: Inkluder en negativ kontroll (C-) bestående av fargeløs RPMI 1640 medium uten acceptors og en positiv kontroll (C +) (f.eks ABDS fra en pool av friske blodgivere) eller renset HDL. Merk at kontrollen positiv gjelder spesielt når pasientprøvene (sykdom betingelser) er analysert (supplerende figur 1).
  3. Forberede en 200 mL lager av cellen lysis løsning 1 (50 mM Tris buffer, 150 mM NaCl, H2O). Bland celle lysis løsning 1 på 1:1 (v: v) forholdet med ren etanol hente lysis løsning 2.

6. fluorescerende Signal fange (3. dag)

  1. Media NBD-kolesterol gjenkjenning
    1. Fjerne celle mediet fra platene og samle den i en ny hvite 96-brønns plate med en ugjennomsiktig flat bunn.
    2. For en optimal fluorescens signal deteksjon i media utvalgene, tilsett 100 μL av ren etanol 100 μL av hver middels prøve å få en 1:1 ratio i 96-brønnen hvit plate.
    3. Hold platen med behandlet media å ytterligere måle fluorescens intensiteten (FI) på en 463⁄536 nm (eksitasjon/utslipp) bølgelengde i luminometer.
  2. Intracellulær NBD-kolesterol gjenkjenning
    1. Vask cellene to ganger med PBS.
    2. For å få intracellulær kolesterol, lyse cellene av rugende dem med 100 μL lysis løsning 2 per brønn og riste platen ved romtemperatur (RT) for 25 min.
    3. For en optimal fluorescens signalgjenkjenning i celle lysate prøvene, ta fluorescens intensiteten i celle lysates i samme hvite 96-brønns plate med klart flat bunn (den samme platen der celler ble sådd i trinn 2.2).
  3. 6.3 måle fluorescens intensiteten (FI) i luminometer mens du justerer parameteren følsomhet til 50 i programvaren (se Tabell for materiale).

7. resultater analyse

  1. Express kolesterol middelklasseinnbyggere frekvensen av et utvalg prosentvis beregnet av formelen:
    Equation
  2. Få siste mål på kolesterol middelklasseinnbyggere (CE) ved å trekke CE i kontrollen negative (eksempel lastet med NBD-kolesterol men inkubert med fargeløs RPMI 1640 medium, uten kolesterol acceptors) fra CE av en gitt eksempler:
    Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med kolesterol middelklasseinnbyggere analysen er å bestemme i vitro kolesterol middelklasseinnbyggere kapasiteten til en gitt serum, plasma eller nedbryting inneholder HDL partikler. Metoden består av laste merket-kolesterol i en kultur av en standard macrophage cellen linje og inducing kontakt med testing prøven fortynnet i FBS-frie medier med celler. Til slutt, fluorescerende nivåer fra NBD måles i media og celle lysate. For å optimalisere målinger, er effluxed kolesterol fra cellene til media blandet med ett volum for et løsemiddel som inneholder etanol. NBD-kolesterol i cellene er resuspended i et løsemiddel som inneholder etanol eller vaskemiddel før målinger. Til slutt, forholdet mellom effluxed/totalt merket-kolesterol bestemmes. Sette opp teknikken, ble apolipoprotein B-utarmet serum (ABDS) fra en pool av friske blodgivere brukt.

De beste fortynning forholdene for NBD-kolesterol i både medium og etanol ble undersøkt. Vi testet fluorescerende virkemåten til gratis NBD-kolesterol i flere løsemiddel miljøer, inkludert ulike forhold av etanol og fargeløs RPMI 1640. Fluorescens intensitet (FI) NBD-kolesterol fortynnet i vandig løsningen viste de laveste FI verdiene, mens NBD-kolesterol i ren etanol slippes ut den høyeste FI. Dette tyder på at fluorescens utslipp av 22-NBD-kolesterol molekylet er svært avhengig av mediet der den finnes. Følgelig er fluorescens signalet av 22-NBD-kolesterol betydelig høyere når den plasseres i en etanol som inneholder medier. Vi observerte at i forholdet 1:1 media: etanol, fluorescens intensitet signalet øker proporsjonalt med konsentrasjonen av kolesterol analoge mellom 0,5-50 μM, foreslå en passende oppførsel av sonden i dette tilfellet (figur 2 ). Lineær virkemåten i 1:1 tilstand (media: etanol) representeres av følger formelen: y = 20.88 x + 146.7 med R2 = 0.9341.

Et viktig skritt i denne metoden er tiden rugende lastet cellene med kolesterol acceptors slik kolesterol kan middelklasseinnbyggere. For å bestemme nødvendige inkubasjon tiden, ble cellen media slaktet på ulike timepoints (1-24 h; Figur 3). Kolesterol middelklasseinnbyggere i området fra 0 til 6 h utviklet lineært (p < 0,0001; y = 18.2 x + 127.3) på en måte som tidsavhengige. Maksimal signalet fanget var 6 h etter at ABDS ble lagt til cellene. Etter 6 h og kolesterol mistet regularitet i middelklasseinnbyggere, så variasjonen økt etter 6 h med inkubering med ABDS (Figur 3).

Vi testet i tillegg metning terskelen og dynamisk område som gjelder menneskelige ABDS ved å måle CE på forskjellige prosenter HDL inneholder medier (ABDS). NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere i høy gjennomstrømning analysen (96-brønns plate) utviklet seg lineært innen 1 – 7% ABDS, der FI økt på en konsentrasjon-avhengige måte med ABDS, nådde toppen av kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet på 7% ABDS (Figur 4). I konsentrasjoner høyere enn 7% redusert FI i en invers sammenheng med ABDS prosent. Dette kan ha skjedd fordi kolesterol var reentering cellene fra NBD-kolesterol lastet HDL i media.

Standard metode å måle kolesterol middelklasseinnbyggere bruker radio-merket (3H) kolesterol16. For å evaluere resultatene av våre fluorescens-basert metode, vi utført og forhold både fluorescerende og radio-merket. Vi fant at tradisjonell radioaktivitet teknikken og våre NBD-kolesterolet metode var sterkt korrelert (Pearson's r = 0,97; p < 0,001) med ulike konsentrasjoner av ABDS (1 – 8%. Figur 5). Samlet tyder dette på at våre fluorescerende metode kan være tryggere erstatning enn radioaktivt teknikken.

Til slutt, vi sammenlignet med vår metode fluorescerende sonde forskjellig fra neste arbeidsdag. Vi sammenlignet vår metode til en kommersiell høy gjennomstrømming cellebasert analyse kit som skulle avgjøre kolesterol middelklasseinnbyggere i celler (kolesterol middelklasseinnbyggere analysen kit; cellebasert). Metoden som ble utviklet i vår gruppe var følsom til en økning av acceptor konsentrasjon (% ABDS) i CE verdier mellom 5 og 15%. Men resulterte den kommersielle kit, utført etter produsentens instruksjoner, i CE tiltak under 5% langs utvalg av ABDS assayed; dermed resulterende CE var hovedsak upåvirket når ABDS ble økt (figur 6).

Figure 1
Figur 1: molekylære strukturer av naturlige kolesterol (A), 22-NBD-kolesterol (B) og 25-NBD-kolesterol (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: neste arbeidsdag-kolesterol fluorescens intensitet (FI) med ulike forhold av etanol og fargeløs RPMI 1640 medium. NBD-kolesterol var fortynnet i 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 og 0:1 etanol: vandig middels forholdstall på NBD-kolesterol konsentrasjoner mellom 0,5 og 50 µM. FI signal ble oppdaget av luminometer med parameteren følsomhet satt på 70 i fluorimeter programvaren. FI-signal i media og celle lysate ble målt ved hjelp av hvite 96-brønns plater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: tid-progresjon NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere i THP-1-derivert makrofager. DmTHP-1 ble lastet med 5 µM NBD-kolesterol og inkubert med 5% ABDS. Cellen media ble målt i en hvit 96-brønns plate på ulike timepoints (1-24 h). Verdiene presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket quadruplicate brønner. FI-signal ble oppdaget av luminometer med parameteren følsomhet satt på 70 i fluorimeter programvaren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere i THP-1-derivert makrofager i 96-brønnen plate med ulike konsentrasjoner av ABDS. DmTHP-1 cellene ble behandlet med 5 µM NBD-kolesterol, inkubert med ulike prosenter av ABDS og lysed med etanol. FI-signal i media og celle lysate ble målt ved hjelp av en hvit 96-brønns plate i fluorimeter på 1:1 (etanol: lysis løsning 1). Tiltak av negative kontroller (ABDS ubehandlet media) ble trukket på nivå gitt. Verdiene presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket tre eksemplarer brønner. FI-signal ble oppdaget av luminometer med parameteren følsomhet satt til 50 i fluorimeter programvaren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Korrelasjon NBD-kolesterol og [3H]-kolesterol middelklasseinnbyggere i THP-1-derivert makrofager. Følgende dmTHP-1 med det tilsvarende merket-kolesterolet 6 h. Kolesterol middelklasseinnbyggere ble målt ved hjelp av 1-8% ABDS. For NBD-kolesterol prøver, ble fluorescerende signalet oppdaget med hvite 96-brønns plater i fluorimeter på 1:1 etanol: lysis løsning 1. FI-signal ble oppdaget av luminometer med parameteren følsomhet satt til 50 i fluorimeter programvaren. For [3H]-kolesterol prøver, radioaktivt signalet ble oppdaget med 100 µL av medium og celle lysate blandet med scintillation cocktail og røde i scintillation counter, følger protokollen beskrevet av lav et al.17. Korrelasjon effektivitet ble fastsatt ved bruk av Pearson's r korrelasjonskoeffisient. Tiltak av negative kontroller (ABDS ubehandlet media) ble trukket fra både fluorescens og radioaktivt nivåer tilbys. Verdiene presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket tre eksemplarer brønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: sammenligning mellom høy gjennomstrømming NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere analysen og en kommersialisert fluorescerende cellebasert analysen kit. Kolesterol middelklasseinnbyggere fra ABDS ble vurdert følger beskrevet protokollen, bruker som lysis løsemiddel etanol (50%) eller Tween 80 (1%). Fluorescerende cellebasert analysen settet ble vurdert i henhold til produsentens protokollen i kit. Verdiene presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket tre eksemplarer brønner. FI-signal ble oppdaget av luminometer med parameteren følsomhet satt til 50 i fluorimeter programvaren Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: arbeidsflytdiagram. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere av serumprøver fra HIV-infiserte pasienter og positiv standardkontrollen (C +). Inter-individuelle variasjon av metoden for NBD-kolesterol-middelklasseinnbyggere på et sett med HIV-infiserte pasienter vises. En positiv internkontroll (C +) representerer de NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere fra en pool av sera prøver av 8 sunn pasienter. Viser standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Merket med fluorescerende kolesterol er en lovende strategi for å analysere og undersøke egenskapene og metabolisme av naturlige kolesterol i vitro. De viktigste fordelene er at det kan tas av celler, tillater intracellulær og membran distribusjon studier, og kan brukes på kolesterol middelklasseinnbyggere analyser som denne protokollen (figur 7). Noen fluorescerende-merket steroler tillate kolesterol sporing i vitro inkludert BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol og 22 - og 25-NBD-kolesterol12. 22-NBD-kolesterol er spesielt egnet for studere kolesterol dynamics med forskjellige celletyper og som en erstatning for radio-merket kolesterol18. Det finnes ingen konsensus metode vurdere fluorescerende signalet i en kolesterol middelklasseinnbyggere analysen. Sang et al.14 høstet medium og celle lysates å måle FI separat; Liu et al.14 overført mediet til plater og intracellulær fluorescerende signalet ble målt direkte hos kultur plate; og Zhang et al.15 brukt en lyseringsbuffer til lyse cellene, etterfulgt av rensing av fluorescerende kolesterol å utvanne det i ren etanol og oppdage fluorescens intensitet signal19. I vår kolesterol middelklasseinnbyggere analysen, bruk av samme endelige løsemiddel sammensetning i media og celler tillatt homogenisering av cellen media og målinger av lysate effektivt.

Studien profilert NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere over tid og fant en tidsavhengige progresjon til 6 h med inkubering med acceptor ABDS, lik sang et al.14 og Liu et al.14 og i motsetning til Zhang et al. som brukte en 1t inkubasjonstid med lipid acceptors19. Vi fant at etter 6 h med inkubering, effluxed kolesterol mistet linearitet; Det er derfor viktig ikke å overskride 6 h. Våre optimalt spekter av kolesterol middelklasseinnbyggere var mellom 3 til 6 h etter acceptors. Vi foreslår rugende celler 4 h med kolesterol-acceptors. Flere kritiske trinn er bruk av fargeløs media søke i acceptors for å unngå bakgrunn, såing et semi confluent celle kultur lag, og sikre en korrekt etterlevelse av de til platen. Det bør bemerkes at klart nederst hvite platen er nyttig å følge cellene under et omvendt lys mikroskop.

De fleste kolesterol middelklasseinnbyggere analyser er utført med renset lipid acceptors i kolesterol middelklasseinnbyggere test. Nåværende teknikken ble utviklet for å hente kolesterol middelklasseinnbyggere kapasitet fra humant serum- eller plasmaprøver. Vi bruker de iboende kolesterol acceptors stede i serum, men det er viktig å fjerne partikler som inneholder apolipoprotein B, som ville recirculate kolesterol molekyler innenfor cellene20,21. Som modifikasjoner, kan renset ApoAI og HDL også brukes som acceptors. Også cellelinjer enn menneskelig THP-1 har blitt brukt i fluorescerende kolesterol middelklasseinnbyggere analyser, som rå 264.7 eller J774A1 makrofager og ville dermed sannsynlig arbeid i våre metoden15,22.

Viktigste begrensningene i denne metoden er at resultatene avhenger av bestemt celle linjen, en standard cellen linje men celle-fri metode ville være en fordel å bruke som en biomarkør. Også sera brukes til å standardisere denne metoden var frosset; NBD moiety på kolesterol er mindre fysiologiske enn radio-merket, og dens opptak er forskjellig fra den endogene kolesterolet; og vi testet det endelige utfallet av en rekke prosesser (dvs., med serum partikler, celle linje, mulig esterification kolesterol, mulig spredning av kolesterol eller samtidige middelklasseinnbyggere og tilstrømningen prosesser). Men som en fordel, fluorescens-baserte teknikker har vist for å ha stort potensial som erstatning for tradisjonell radio-merket teknikker og substitusjon av [3H]-kolesterol, av et lysstoffrør-merket molekyl overvåke kolesterol middelklasseinnbyggere søk14.

Kolesterol middelklasseinnbyggere kan fungere som biomarkør aterosklerose23, som relaterer med fremtidige kardiovaskulær hendelser24,25. En mulighet til å studere rollen til makrofager i aterosklerose er gjennom renset HDL og sammensetning; men er HDL rensing en krevende og tidkrevende prosess. Dessuten under rensing kan andre serum komponenter med atherogenic effekt undervurdert eller mistet. Derfor ABDS ble valgt som lipid acceptor. Høy gjennomstrømming omfanget og tid reduksjon ble gjort mulig av erstatter scintillation telleren en plate leser, måle fluorescerende signalet i samme kultur plate (i cellen lysate) og redusere protokollen av to dager. Dessuten, denne teknikken viser høyere følsomhet når celler er utsatt for ulike konsentrasjoner av serum enn tiltak fra en kommersialisert kit å vurdere kolesterol middelklasseinnbyggere.

Avslutningsvis har en NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere analysen som samsvarer med den tradisjonelle radioaktive metoden blitt beskrevet. Vi bestemt det optimale tidspunktet å ruge lipid acceptors fra menneskelige prøver (serum- eller) i form av ABDS. Vi optimalisert celle såing, differensiering, dynamisk område og metningspunkt teknikken. Som sin viktigste nyhet optimalisert vi en løsemiddel kombinasjon brukes i målinger høy intensitet og en forbedret lineær rekkevidde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ønsker å erklære at de er oppfinnerne av patentsøknaden (EPO, 18382337.6-1118, 17 mai 2018) med tittelen "Metode for å bestemme kolesterol middelklasseinnbyggere" basert på denne metoden.

Acknowledgments

Dette arbeidet har vært delvis støttet av forskning gir FIS (PS12/00866) fra Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spania. Fondo Europeo para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) og søk etter program / Generalitat de Catalunya. Forfatterne takke Retrovirology og Viral Immunopathology laboratorium av Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Vi takker T. Escribà, C. Rovira og C. Hurtado for deres hjelp og S. Cufí fra kunnskap og teknologi overføre Office for sin veiledning i å beskytte oppfinnelsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well collecting plate Corning Inc Costar 3912 white 96-well plate with opaque clear bottom
96-well culture plate Corning Inc Costar 3610 white 96-well plate with flat clear bottom
Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) Abcam ab196985 commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux
colorless RPMI 1640 Sigma-Aldrich R7509 RPMI 1640 with no pehnol-red
Gen5 Data Analysis Software BioTek Version 2.0
Glycine Sigma-Aldrich G8790-100G Glycine, non-animal use
Luminometer Biotek SYNERGY HT Multi-Detection Microplate Reader
Lysis Solution 1 in-house 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O
Lysis Solution 2 in-house Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v)
NBD-cholesterol Thermo-Fisher N1148 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol
PBS Sigma-Aldrich P3813 Phosphate-buffered saline
PEG 8000 Sigma-Aldrich 202452-250G polyethylene glycol
PMA Sigma-Aldrich 79346 Phorbol 12-merystate B-acetate.
R10 in-house RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin.
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758 RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose
THP-1 cells Sigma-Aldrich ATCC, #TIB-202 monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
  2. Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
  3. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
  4. Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
  5. Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
  6. Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
  7. Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
  8. Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
  9. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
  10. Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
  11. Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
  12. Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
  13. Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
  14. Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
  15. Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
  16. Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
  17. Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
  18. Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
  19. Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
  20. Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
  21. Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
  22. Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
  23. Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
  24. Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
  25. Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).

Tags

Medisin problemet 143 NBD-kolesterol macrophage HDL kolesterol middelklasseinnbyggere fluorescens apolipoprotein B-utarmet serum atherosclerosis omvendt kolesterol transport
Høy gjennomstrømming Nitrobenzoxadiazole-merket kolesterol middelklasseinnbyggere analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pastor-Ibáñez, R., Arnedo, … More

Pastor-Ibáñez, R., Arnedo, M., Tort, O. High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay. J. Vis. Exp. (143), e58891, doi:10.3791/58891 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter