Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

Summary

Presentamos un ensayo de fluorescencia para demostrar que Lucifer Yellow (LY) es un marcador robusto para determinar la aparente permeabilidad paracelular de las monocapas celulares hCMEC/D3, un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana. Usamos este ensayo para determinar la cinética de una formación monocapa confluente en células hCMEC/D3 cultivadas.

Abstract

La barrera hematoencefálica BBB consiste en células endoteliales que forman una barrera entre la circulación sistémica y el cerebro para evitar el intercambio de iones no esenciales y sustancias tóxicas. Las uniones estrechas (TJ) sellan eficazmente el espacio paracelular en las monocapas, lo que resulta en una barrera intacta. Este estudio describe un ensayo de fluorescencia basado en LY que sepuede utilizar para determinar su coeficiente de permeabilidad aparente (aplicación P) y a su vez se puede utilizar para determinar la cinética de la formación de monocapas confluentes y la unión estrecha resultante integridad de barrera en las monocapas hCMEC/D3. Demostramos además una utilidad adicional de este ensayo para determinar la integridad funcional de TJ en células transinfectadas. Nuestros datos del ensayo de la_aplicación LY P muestran que las células hCMEC/D3 sembradas en una configuración transwell limitan efectivamente el transporte paracelular LY 7 días de cultivo. Como utilidad adicional del ensayo presentado, también demostramos que la transfección de nanopartículas de ADN no altera el transporte paracelular LY en monocapas hCMEC/D3.

Introduction

La barrera hematoencefálica (BBB) es la barrera protectora que limita la afluencia de componentes plasmáticos en el tejido cerebral y consiste en células endoteliales cerebrales junto con células de apoyo como los pericitas. El papel principal de BBB es servir como barrera que sella el espacio entre la sangre periférica y elsistema nervioso central (SNC) para mantener la hemostasis del microambiente neural 1,^2. Las células endoteliales capilares cerebrales sellan eficazmente la vía paracelular a través de la formación de uniones estrechas intercelulares (TJ)¹. Esta barrera protectora pe....

Protocol

1.Cultivo celular general hCMEC/D3

1. Reanimación de células congeladas
   NOTA: Todos los experimentos y mantenimiento del cultivo celular se realizaron dentro de una campana de bioseguridad estéril. Los medios de cultivo, los suplementos y los reactivos se compraron como productos estériles o se esterilizaron mediante filtración utilizando un filtro de membrana de 0,22 m para evitar la contaminación microbiana.
   1. Añadir 8,5 ml de solución de colágeno (0,15mg/ml) en un matraz de cultivo tisular (75 cm² de área de crecimiento; referida a partir de ahora como T75) y colocarla en una incubadora (37 oC, 5% CO₂₎durante 1....

Results

En primer lugar, determinamos el efecto del tiempo de cultivo en la permeabilidad LY para determinar la cinética aparente de la formación de TJ. Los valores medios de la_aplicación LY P del día 1 a 10 post de la sesión se muestran en la Figura 2a. En el día 1, la_aplicación P media era de 4,25 x 10^-4 cm/min y cayó ligeramente a 3,32 x 10^-4 cm/min el día 2. El valor medio de la_aplicación P aumentó ligerament.......

Discussion

Un papel clave del BBB es prevenir el intercambio de iones no esenciales y sustancias tóxicas entre la circulación sistémica y el cerebro para mantener la hemostasis del microambiente neural. Una de las características características del BBB es la capacidad de las células endoteliales capilares para formar uniones estrechas (TJ) que sellan eficazmente la ruta paracelular de transporte. Demostramos un ensayo de_aplicación LY P como un método cuantitativo para determinar la cinética aparente de la formación de b.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Línea celular hCMEC/D3	Cedarlane Laboratories	102114.3C-P25	línea celular endotelial microvascular cerebral humana
gWizLuc	Aldevron	5000-5001	ADN plasmídico que codifica el gen de la luciferasa,
lucifer, amarillo, CH, sal de dilitio	Invitrogen	155267
Insertos Transwell con membranas grabadas con trazas de tereftalato de polietileno (PET)	Falcon	353095
Matraz de cultivo de tejidos	Olympus Plastics	25-207
plano de 24 pocillos	Olympus Plastics	25-107
Placas inmunológicas negras de 96 pocillos	Thermo Scientific	437111
S-MEM 1X	Gibco	1951695	Spinner - medio esencial mínimo (S-MEM)
EBM-2	Clonetics	CC-3156	Medio basal de células endoteliales-2 (EBM-2)
solución salina tamponada con fosfato 1X	HyClone	SH3025601
Colágeno Tipo I	Discovery Labware, Inc.
Kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce	Thermo Scientific	23227
Reactivo de lisis de cultivo celular 5X	Promega	E1531
Escarabajo Luciferina, Sal de Potasio	Promega	E1601
SpectraMax i3	Lector de placas de fluorescencia	Molecular Devices
Solución de azul de tripano, 0,4 %	Gibco	15250061
anticuerpo policlonal ZO-1	ThermoFisher	61-7300
anticuerpo anti-GAPDH	abcam	ab8245
Alexa Fluor680-conjugado AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)	Jackson ImmunoResearch Inc	128817
12 pocillos, fondo plano	Olympus Plastics	25-106
Tampón RIPA (5X)	Alfa Aesar	J62524
Aprotinin	Fisher BioReagents	BP2503-10
Generador de imágenes Odyssey CLx	LI-COR Biosciences		para el escaneo de membranas de Western blot