Hier presenteren we een protocol te voeren draagbare cellulaire aërosol belichtingen en meten van de cellulaire reactie. De methode maakt gebruik van cellen, geteeld op de lucht-vloeistof-interface, het nabootsen van in vivo fysiologie. Cellulaire reactie op koperen nanoparticle aërosolen werd waargenomen als oxidatieve stress door middel van reactieve zuurstof soorten generatie en cytotoxiciteit als lactaat dehydrogenase release.
Dit protocol introduceert een nieuwe in vitro blootstelling systeem, dat kan worden gedragen, met inbegrip van de karakterisering en de prestaties. Lucht-vloeistof (ALI) in vitro blootstelling interfacesystemen zijn vaak groot en volumineus, vervoer naar het veld en de werking bij de bron van de emissie of in de individuele ademzone bemoeilijken. Door middel van miniaturisatie van deze systemen, kan het lab naar het veld, de bespoediging van de verwerkingstijd en het verstrekken van een passender blootstelling methode die niets aan het aërosol verandert voordat u contact opneemt met de cellen worden gebracht. De Portable In vitro blootstelling Cassette (PIVEC) past een 37 mm filter cassette te voorzien in in vitro toxiciteit buiten de instelling van een traditioneel laboratorium. De PIVEC werd gekenmerkt met drie maten van koperen nanodeeltjes om te bepalen van de efficiëntie van de depositie op basis van gravimetrische en deeltje nummer concentratie analyse. Eerste cytotoxiciteit experimenten werden uitgevoerd met blootgestelde longkanker cellen om te bepalen van het vermogen van het systeem om te storten van deeltjes met behoud van de levensvatbaarheid van de cellen. De PIVEC biedt een vergelijkbare of hogere afzetting efficiëntie wanneer het vergelijken bij beschikbaar loodrecht stroom in vitro blootstelling apparaten. Ondanks de lagere doorvoersnelheid van de steekproef geeft de geringe omvang enkele voordelen aan de huidige in vitro ALI blootstelling systemen. Deze omvatten de mogelijkheid om te worden gedragen bij het toezicht op persoonlijke, mobiliteit van het laboratorium naar de bron van de emissie en de optie om meerdere systemen voor ruimtelijke resolutie met behoud van een lagere gebruiker kost. De PIVEC is een systeem dat kan verzamelen van aërosolen in het veld en in de individuele ademzone op een lucht-geïnterfacet, in vitro model.
Persoonlijke bemonstering met behulp van in vitro technieken kon bieden uitgebreide informatie over de biologische effecten van aërosolen op de werkplek. 1 blootstelling aan verontreinigingen in de lucht zijn blootstelling aan de chemische stof zelf, voor de verzamelde lucht monsters, verzonken omstandigheden waar het gas wordt geïntroduceerd op de celsuspensie, intermitterende vorderingen met behulp van een apparaat zoals een rocker, of direct blootstelling aan de lucht-vloeistof-interface (ALI). 2 veel van deze technieken worden uitgevoerd met cellen gekweekt in de schorsing of het verzamelen van monsters vóór de blootstelling, die elk kan invloed hebben op de toxicologische studie vanwege mogelijke veranderingen in de spuitbus. 3 als u wilt voorkomen dat deze veranderingen, het laboratorium kan worden gebracht naar het veld met behulp van verscheidene in vitro ALI cultuur blootstelling systemen die worden gebruikt in literatuur,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 weinigen zijn echter commercieel beschikbaar. 8 , 9 , 12 deze systemen zijn vaak omvangrijk zijn, vooral wanneer met inbegrip van instrumenten voor het regelen van de temperatuur en de vochtigheid van de cellulaire omgeving en de stroomsnelheid van het monster aërosol. Met behulp van de PIVEC, kunnen blootstelling van de spuitbus worden uitgevoerd buiten de instelling van een traditionele lab of in de ademhalingszone terwijl het nabootsen van inhalatie voorwaarden.
De bepaling van het aërosol afzetting in vitro is belangrijk om het onderzoek naar de effecten op de gezondheid als gevolg van inhalatie. De ademhalingszone, het gebied binnen 30 cm vanaf de mond en neus,14 is van cruciaal belang voor het begrijpen van de blootstelling aan nanodeeltjes en voor het koppelen naar de biologische effecten in de longen. 2 vaak de depositie op cellen wordt gedefinieerd als een afzetting-efficiëntie, de deeltjes op gestort en in beslag genomen door de cellen verdeeld door de deeltjes toegediend aan het systeem6,15 , of op basis van massa van de dezelfde bedragen. 4 , 16 de huidige methoden voor het meten van aërosolen in de individuele ademzone zijn filter gebaseerd, vastleggen van deeltjes in de periode van een bepaalde bemonstering en met behulp van de filters te voeren verder te worden getest. 17 persoonlijke controle vereist een kleine systeem dat wordt geleverd met de afweging van minder monsters.
Er zijn vele benaderingen om te bepalen van de effecten op de gezondheid van blootstelling aan een aerosol. Het ALI-model voorziet de aërosol toegediend worden rechtstreeks naar de cellen door de lucht als in een echte blootstellingsscenario, maar is het kosteneffectiever en minder tijd intensief dan in vivo studies terwijl het nabootsen van de lucht-liquid belemmeringen, zoals de ogen, huid en longen. Longkanker cellen geteeld op de ALI hebben de mogelijkheid om het genereren van een gepolariseerde barrière laag,18,19 , die fysiologische eigenschappen die lijken op de in vivo Long epitheel produceert, met inbegrip van de productie van slijm en oppervlakteactieve stof in specifieke bronchiale of alveolaire cellijnen, cilia verslaan, strakke kruispunten van19 ,20 en cel polarisatie van de19,. 18 veranderingen zoals dit kunnen invloed hebben op het cellulaire antwoord gemeten in toxiciteit. 21 voorts ALI in vitro model resultaten zijn vaak gevoeliger dan cellen blootgesteld via schorsing modellen22 en kunnen naar model acute in vivo inhalatietoxiciteit. 23 , 24 daarom, een ALI blootstelling systeem welk vermag voeren metingen in de ademhalingszone is een natuurlijke volgende stap.
Door de cellen te aërosol direct bij de bron van de emissie bloot te stellen, doet zich voor onderzoek van de effecten van alle gassen, semi-vluchtige stoffen en deeltjes die betrokken zijn bij het mengsel. Wanneer het mengsel is verzameld op een filter, de gassen en vluchtige stoffen niet worden gevangen en het hele mengsel kan niet worden onderzocht. Daarnaast kan reconstitutie van deeltjes in een poeder of een vloeibare suspensie leiden tot de samenvoeging of particle-vloeistof interacties, zoals de ontbinding, de schorsing van de vloeibaar. 25 , 26 wanneer aërosol deeltjes worden toegevoegd aan de vloeistof, er is een hoger potentieel voor agglomeratie,25,27 vorming van een eiwit corona,28 of interactie met verbindingen in de vloeistof, die kan van invloed zijn op de depositie en de biologische reactie beïnvloeden. 29 , 30
Blootstelling bij de ALI is gebaseerd op de drie belangrijkste aërosol profielen, wolk beslechting, parallelle stroom en loodrecht stroom. Cloud afwikkeling, gebruikt door de Air-Liquide Interface cel blootstelling (ALICE),4 is een systeem van de partij waar de deeltjes storten door middel van zwaartekracht en diffusional regelen zoals het aërosol wordt behandeld als één eenheid. Parallelle stromen, gebruikt door de elektrostatische aërosol in vitro blootstelling systeem (DAKRAND)5 en multiculturele blootstelling kamer (MEC) II,6 afzetting door de toevoeging van de Brownse beweging via het profiel van stroom voorziet. Loodrecht stroom, gebruikt door een microsprayer,7 Nano Aerosol kamer voor In-Vitro toxiciteit (NACIVT),11 en commerciële ALI systemen8,9,10,12, voegt de impactie van deeltjes binnen de regio afzetting. Veel van deze blootstelling systemen zijn groot en volumineus, overtollige systemen voor aërosol preconditionering, pompen voor stroom, of zelfs verwarming kamers voor incubatie van cellen vereisen. Deze grote verkleind de overdraagbaarheid van het systeem. In plaats van bemonstering direct bij de bron van de emissie hebben deze systemen vaak monsters naar het lab of model aërosolen gegenereerd voor analyse gebracht. De complexiteit van het uitgestoten aërosol kan worden verloren in de vertaling uit het veld naar het lab. De PIVEC is kleiner dan de huidige systemen, met een externe oppervlakte van ongeveer 460 cm2 en weegt slechts 60 gram, met warmte en vochtigheid controle opgenomen in het systeem toe te staan voor een zeer draagbaar apparaat. De verminderde grootte en het gewicht zodat het systeem kan worden gedragen of genomen om de bron van blootstelling, directe bemonstering het toelaat.
De grote omvang van de huidige blootstelling systemen vermindert ook de mogelijkheid voor het uitvoeren van steekproeven om te onderzoeken ruimtelijke verlopen in concentraties. Deze resolutie is de sleutel bij de bepaling van de toxicologische effecten van vele potentiële milieu- en beroepsrisico’s zoals autoverkeer uitlaat deeltjes materie of werkplek activiteiten waar de aerosolization plaatsvindt. Onmiddellijk na emissie, wordt er een ruimtelijke variantie in deeltje concentratie. Dit groeit met de tijd als de deeltjes in de hele atmosfeer verspreiden en deze effecten kunnen wijzigen op basis van de omgevingsomstandigheden, zoals temperatuur, druk, wind en zon. Deeltjes kunnen beginnen om te verouderen en ook eens uitgestoten31,32 oxideren en versnippering tarieven worden beïnvloed door de topografie; hogere concentraties zal worden gevonden in de canyons en tunnels, waar dispersie effecten zijn vertraagd, en lagere concentraties kunnen worden gevonden waar er een groot gebied voor verspreiding. 33 deze veranderingen in de tarieven van de dispersie significante effecten op de menselijke gezondheid kunnen hebben en kunnen worden gezien bij de vergelijking van het aantal astmatische volwassenen wonen in stedelijk versus op het platteland. 34 terwijl veel blootstelling systemen meerdere monsters tegelijk bieden, meerdere systemen nodig zijn met een overvloed van grote apparatuur voor het uitvoeren van ruimtelijke resolutie.
Doordat het lab naar het veld, kan het tijdstip van de analyse met behulp van de hele cel als een sensor worden verlaagd. Na de bekende biologische mechanismen en eindpunten kan helpen bij de bepaling van de aërosol samenstelling en grootte. Als gevolg van langzame klaring methoden, met inbegrip van de goedkeuring van de mucociliary en fagocytose translocatie, zijn deze deeltjes vaak interactie met cellen ongeveer dagen tot weken3 genereren van oxidatieve stress, ontsteking en zelfs de dood van de cel. Deze biologische eindpunten kunnen de uitgangspunten voor de ongunstige uitkomst trajecten voor hart-en vaatziekten of chronisch obstructief longlijden. Daarnaast uitgevoerd Wiemenn et al. een array van in vitro tests te vergelijken met de waarden van de literatuur voor korte termijn in vivo inhalatietoxiciteit. 35 In vivo reactie werd voorspeld met twee van de vier positieve resultaten van het testen van cytotoxiciteit via lactaat dehydrogenase release, oxidatieve stress van glutathion vermindering en waterstofperoxide vorming en release en ontsteking van potentiële de tumor necrose factor Alfa genen. Uit tien nanosized metaaloxiden getest, zes getest als actieve (titaniumoxide, zinkoxide en vier verschillende cerium oxide) met posities in vitro bevestiging in vivo.
Onze lab ontwikkeld om te bestuderen van de effecten van aërosolen in een professionele omgeving, de PIVEC voor de vorderingen op het gebied. Bovendien, de PIVEC kan worden gedragen voor persoonlijke bemonstering te controleren en onderzoeken van blootstelling door inhalatie als de 37 mm filter cassette36 of meerdere systemen kunnen worden gebruikt om ruimtelijke resolutie binnen een bepaald gebied. In dit protocol, de karakterisering en het gebruik van de PIVEC besproken. Na de blootstelling, worden de biologische effecten waargenomen door middel van cytotoxiciteit testen.
Filter cassettes bieden een eenvoudige, goedkope methode voor het verzamelen van aërosolen in de individuele ademzone; echter aërosol monsters geëxtraheerd uit filters niet vertegenwoordigen het gehele aërosol (dat wil zeggen gassen, vluchtige stoffen en deeltjes) en dus het beperken van de beoordeling van aanverwante biologische effecten. Met het oorspronkelijke ontwerp van de 37 mm filter cassette, is de PIVEC ontworpen om onderhouden draagbaarheid en bootsen de in vivo afzetting van deeltjes uit inademing…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank Boris Solomonov en de Virginia Commonwealth innovatie Machine Shop voor hulp bij snelle prototyping het apparaat. De auteurs ook bedank Cristian Romero-Fuentes van de Lewinski groep, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov en de Virginia Commonwealth nanomaterialen Core karakterisering faciliteit voor hun hulp met de karakterisering van het deeltje. Dit werk werd gesteund door opstarten middelen verstrekt aan de Dr. Lewinski door de College of Engineering op de Virginia Commonwealth University.
Scanning mobility particle sizer (SMPS) | TSI, Inc. | 3910 | NanoSMPS |
Optical particle sizer (OPS) | TSI, Inc. | 3330 | |
Stainless Steel Pipe, 4" Long | McMaster-Carr | 4830K116 | Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size |
Brass Ball Valve with Lever Handle | McMaster-Carr | 4112T12 | Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female |
Steel Pipe, 2" Long | McMaster-Carr | 7753K121 | Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size |
HEPA filter | GE Healthcare | 09-744-12 | HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule |
Vacuum Generator | PISCO USA | VCH10-018C | |
PIVEC | VCU | For design please contact authors | |
Resistive heater | |||
1/4" barbed connectors | Zefon International, Inc. | 459743 | |
Porous tubing | Scientific Commodities, Inc. | BB2062-1814A | Hydrophilic 10 um pores |
Battery power bank | |||
Cell culture insert | Fisherbrand | 353095 | 24 well plate insert |
Filter Forceps | Fisherbrand | 09-753-50 | |
Transfer Pipette | ThermoScientific | 13-711-27 | |
Glass Fiber Filters | SKC | 225-7 | Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore |
Ultra Micro Balance | A&D | BM-22 | Housed in environmental chamber |
37 mm filter cassette | SKC | 225-3250 | Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene |
Variable flow vacuum pump | SKC | 220-5000TC | AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1090 | 40 nm |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1088 | 100 nm |
Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1117M | 800 nm |