Summary
ポータブル携帯電話エアロゾルのエクスポー ジャーを実行し細胞応答の測定プロトコルを紹介します。生体内の生理学を模倣した気液界面成長細胞を用いる。銅ナノ粒子エアロゾルに対する細胞の反応は、乳酸脱水素酵素リリースとして細胞毒性および活性酸素種の生成を介して酸化ストレスとして観察されました。
Abstract
このプロトコル システムが導入されて新しい体外露出、その特性や性能など着用していることができます。大きいとかさばる、フィールドやソースでは排出量の呼吸ゾーン内で操作する輸送を困難に気液界面 (ALI)体外露出システムが多い。を通してこれらのシステムの小型化、研究室は、処理時間を迅速化し、細胞を連絡する前にエアロゾルは変わりませんより適切な露出方法を提供する、フィールドに同伴可能です。ポータブル体外露出カセット (PIVEC)の in vitro毒性試験が伝統的な実験室の設定の外のテストを許可する 37 mm フィルター カセットに適応。重量に基づく堆積効率を決定するため銅ナノ粒子の 3 つのサイズを使って、PIVEC は特徴付けられたと粒子数濃度解析。細胞生存率を維持しながら粒子を入金するシステムの能力を決定する露出した肺細胞の初期細胞毒性実験を行った。利用可能な垂直フローの in vitro露光装置と比較するとき、PIVEC は類似または増加堆積効率を提供します。サンプル スループットの低下にもかかわらず小さなサイズは現在体外アリ露光装置にいくつかの利点を与えます。個人を監視するために着用することが挙げられます、排出量のソースとセットアップ オプションに研究室から移動空間分解能低いユーザーを維持しながら複数のシステム コストします。PIVEC は、フィールドに空気インターフェイスの in vitroモデルに呼吸ゾーン内のエアロゾルを集めることができるシステムです。
Introduction
培養技術を使用して個人のサンプリングは、職場におけるエアロゾルの生物学的影響に関する包括的な情報を提供できます。1空気中の汚染物質への暴露は、ガスが導入される、細胞懸濁液に、断続的な露出や直接、ロッカーなどのデバイスを使用して湛水条件下で、収集された大気サンプル自体は、化学物質への曝露気液界面 (アリ) で露出。2これらのテクニックの多くは細胞懸濁液やエアロゾルの潜在的な変化のための毒性学的研究に影響を与えることができますそれぞれの露出の前にサンプルのコレクションで栽培されます。3これらの変更を避けるためには、研究室がもたらされることいくつかの in vitroを使用してフィールド4,5,6,7、文献で使用されているアリ文化露光装置 8,9,10、11,12,13しかし、いくつか市販されています。8,9,12これらのシステムは、かさばる、特に温度とサンプル エアロゾルの流量と細胞の環境の湿度を調整する機器を含みます。PIVEC を用いたエアロゾルのエクスポー ジャーまたは実行できます伝統的な実験室の設定の外呼吸ゾーン内吸入条件を真似しながら。
エアロゾル沈着体外の定量は、吸入による健康への影響の調査が重要です。呼吸ゾーン口と鼻、14から 30 cm 以内のエリアはナノ粒子への暴露を理解し、肺での生体影響にリンクするために重要です。2多くの場合、細胞に沈着として定義されます堆積効率粒子上に堆積され、管理システム6,15または同じ金額の単位質量の粒子によって分けられる細胞によってとら。4,16現在の呼吸域におけるエアロゾルの測定方法、フィルターに基づいて、特定のサンプリング期間中の粒子をキャプチャおよびフィルターを使用してさらにテストを実施します。17個人的に監視少ないサンプルのトレードオフに付属している小さなシステムが必要です。
エアロゾルへの曝露の健康影響を判断する方法は多数あります。アリ モデルでエアロゾルの本当の露出のシナリオのように空気を通って細胞に直接投与することは、まだ費用効率が高いと体内のより少ない時間がかかるが、目など空気液体障壁を真似しながら研究皮膚と肺。アリで成長して肺細胞体内の肺上皮、特定の粘液と界面活性剤の生産を含むのような生理学的な特性を作り出す18,19偏光バリア層を生成する能力があります。気管支や肺胞の細胞ライン、繊毛の鼓動、19タイトジャンクショ19,20とセルの分極。18は、毒性試験で測定される細胞の応答に影響を与えることができますこれらのように変更します。21また、アリの in vitroモデルの結果は細胞よりも多くの敏感なサスペンション モデル22を介して公開され、モデル体内急性吸入毒性に.23,24したがって、呼吸ゾーン内で測定を実行することができるアリ露出システムは自然な次のステップです。
エアロゾル放出源に直接細胞を公開すると、すべてのガス、半揮発性化合物や混合物に関与する粒子の効果の調査が行われます。フィルターで収集された混合物は、ガスや揮発性の化合物はキャプチャされず、全体の混合物を調査することはできません。さらに、粉末または液体の懸濁液の粒子の再構成は、集計または液体懸濁液に、解散などの粒子・流体系の相互作用につながります。25,26エアロゾル粒子を液体に追加すると、そこが集積、25,27形成タンパク質コロナ、28や沈着に影響を与えることができる液体の化合物との相互作用の可能性が高いと生物学的反応に影響を与えます。29,30
アリでの露出は、3 主なエアロゾル プロファイルがあり、クラウド整定時間、パラレル フロー、および垂直フローに基づいています。雲のセトリング、空気液体インターフェイス セル露出 (アリス) でを使用、4はバッチ システム粒子が重力とエアロゾルは 1 つのユニットとして扱われます、沈降拡散を介して入金します。平行流、静電エアロゾル体外露出システム (庇)5および多文化露出商工会議所 (MEC) II、によって使用される6流速分布をブラウン運動の追加により成膜が可能です。垂直フロー、microsprayer、7ナノ エアロゾル室体外毒性 (NACIVT)、11商業アリ システム8,9,10,12、によって使用される追加の宿便成膜領域内の粒子。これらの露出システムの多くは、大きくてかさばる、エアロゾル中古エアコン、流れ、ポンプまたは細胞の培養のための部屋を熱するため余分なシステムを必要とします。この大型システムの移植性が低下します。放出源に直接サンプリングではなくこれらのシステムはしばしば解析用に生成されたラボ環境またはモデルのエアロゾルを連れてサンプルを持っています。放出エアロゾルの複雑さは、フィールドから実験室への変換で失われる可能性が。PIVEC は約 460 cm2の表面積を持つ、現在のシステムよりも小さく、移植性の高いデバイスを可能にするシステムに組み込むわずか 60 グラム、熱と湿度制御の重量を量るします。減少のサイズと重量はシステムの着用や露出、ダイレクト サンプリングの許可の元に撮影を許可します。
現在の露光装置の大きさも濃度の空間勾配を調査するためのサンプリングを実行する能力を減少します。この解像度は、キー多くの潜在的な環境と自動車排気粒子状物質や職場活動などの労働災害の毒性学的効果を決定するエアロゾル化が発生します。すぐに後排出粒子濃度の空間的差異になります。これは時間とともに増加粒子が大気中に分散し、これらの効果を変更することができます周囲条件は、温度、圧力、風、太陽などに基づく。年齢し、同様一度放出31,32を酸化して、粒子と分散率を受けます; 地形峡谷、トンネル、分散効果は減速、低濃度を見つけることができますで発見される高濃度分散の大きい区域があります。33分散率のこれらの変更は人間の健康に重大な影響を持つことができます、都市対農村部の設定に住んでいる喘息の大人の数を比較するとき見ることができます。34多く露出システムは、複数のサンプルを一度に提供、複数のシステムが空間分解能を実行するための大型装置の豊富な必要です。
フィールドに演習をさせて、センサーとして全体のセルを使用して、分析の時間を減らすことが。既知の生物学的メカニズムとエンドポイントを次エアロゾル組成とサイズの決定で助けることができます。遅いクリアランス メソッド、粘液線毛クリアランス、貪食能、転流などのため、約生成する酸化ストレス、炎症および細胞死も週3日間は、これらの粒子は細胞と対話頻繁。これらの生物学的エンドポイントは、心血管疾患または慢性閉塞性肺疾患のための不利な結果経路の開始点にすることができます。また、Wiemennらは、短期的体内吸入毒性の文献値と比較する生体外の試金の配列を実行しました。35生体内の反応は、乳酸脱水素酵素リリース、グルタチオン還元と水素過酸化物形成とリリースから潜在的な炎症と酸化ストレスによる細胞毒性をテストから 4 つの肯定的な結果の 2 つの予測されました。腫瘍壊死因子アルファ遺伝子。10 ナノ金属酸化物テストからテスト 6 アクティブ (酸化チタン、酸化亜鉛、4 つの異なるセリウム)生体内で確認エクスポー ジャーの培養を用いたします。
職業環境におけるエアロゾルの効果を研究するためには、私たちの研究室は、フィールドにおけるエクスポー ジャーについて PIVEC を開発しました。さらに、監視し 37 mm フィルター カセット36のような吸入暴露を調べる個人サンプリングのため、PIVEC を着用することができます。 または指定された領域内の空間分解能を達成するために複数のシステムを使用できます。このプロトコルでは、特性と、PIVEC の使用を説明します。暴露後生物学的効果は, 細胞毒性の試金を観察します。
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Protocol
とき個人保護具 (例えば白衣、手袋、ゴーグル) を着用しなければならないオペレーター 1、2、3、5、および 6 の手順を実行します。
1 材料の準備
-
システム アセンブリと露出は再現性を確保するための材料を準備します。
- 新しい使用または 70% エタノール洗浄 ¼"内径導電性チューブおよび 1/4" 外径用コネクタ システム アセンブリを確認します。
- よく制御された環境で、温度と湿度、実験する前に、少なくとも 24 時間に関してフィルター、PIVEC コンポーネント、ピンセット、および微粒子粉末を含むストア テスト材料。
注: 温度は部屋の温度、およそ 20 ° C、相対湿度 35% 未満の近いはず。これは、実験の再現性を達成するために非常に重要です。 - 部品をきれいにし計測するための光学粒子 sizer (OPS) スキャン モビリティ粒径 (SMP) など、メーカーの推奨事項に従ってシステムのウォーム アップは、イソプロパノールを使用してパーティクル カウンターを準備します。
2. 乾燥エアロゾルの生成
注: オペレーターは、ヒューム フードでエアロゾル生成を実行します。
-
乾燥エアロゾルを生成するシステムを構築します。
注: 気体・液体の粒子の懸濁液はモデル化されたアプリケーションと細胞文化の適切なはずです。次のメソッドは、液体ベースのエアゾールを使用して実行できます。乾燥エアロゾル システムの設計は、異形らからです。37ドライ散布システムの概略図は、図 1に表示されます。- 4"1/8 スレッドのサイズのパイプの両端にボールバルブを接続、これは粒子のホッパーとなります。1 つのバルブに 2」1/8 サイズのパイプを接続します。
- 成膜効率を決定する際に粒子サイズごとに質量濃度が一定に保たれたこの研究で銅ナノ粒子の重量を量る。約 40 nm 銅ナノ粒子の 7.5 mg、7 mg の 100 nm 銅ナノ粒子、および露出あたり 800 nm 銅ナノ粒子の 13 mg を使用します。オープン エンドを通じて粒子ホッパーに銅ナノ粒子を配置します。
注: 質量に応じて投与濃度、銅ナノ粒子の重量を量った量が提供されます。 - 場所 3"½" 外径 (OD) チューブ 2"パイプとその流れの方向は、ボール バルブを HEPA フィルター短いチューブ内の場所の周りの部分。
- スレッドを使用するその他のボール弁に真空ポンプを接続します。プッシュ-ロック接続に 5/16"外径チューブを配置することによって、空気タンクに真空発生器を接続します。¼"外径チューブを使用して、真空発生器のコンセントにチューブを配置することによって実験の設定に真空発生器のコンセントを接続します。
-
乾燥エアロゾルを生成する乾燥エアロゾル システムの使用
- メインのバルブを回して空気タンクを開き、システムに空気の流れを許可します。空気タンクの流量制御バルブを開き、システムのフローが真空ポンプで目的の設定と同じように設定します。
- HEPA フィルターに最も近いボール弁を開き、真空発生器に最も近いボール弁を開きます。約 3 これらを開けて空気の流れに引っ張られる粒子を許可するように s。
- 真空発生器、HEPA フィルターに最も近いボール弁を閉じますに最も近いボール バルブを閉じます。必要に応じて、テスト期間のための流れにタンクから空気を許可します。
- 流れが停止する空気タンクでメインとレギュレータ バルブを閉じます。クリーン ボール弁と 70% エタノールを用いた真空発生器。オートクレーブ滅菌用の金属パイプ。
3. 堆積効率測定装置 PIVEC を使用して
注: オペレーターは、ヒューム フードでエアロゾルのエクスポー ジャーを実行します。
- 手順 2.2 事前重量を量られたフィルターで生成した銅ナノ粒子エアロゾルを集めることによって成膜を測定します。フィルターで収集した質量を用いて堆積の用量と投与量、重量を量られた銅粒子の量を使用して成膜効率を決定する測定を使用します。
- 1.1.2 事前暴露測定する前に、少なくとも 24 時間の低湿度条件下で 1.00 μ m 孔ガラス繊維フィルターを維持します。3 回未使用のフィルターの重さし、フィルターのウェイトを記録します。場所細胞培養で未使用のフィルターを挿入します。
- 適切なセル フィルターと細胞培養の挿入をサポートする PIVEC の挿入アダプターを文化 (6 井戸または 24 井戸) を選択します。場所細胞培養は、アダプター部分のベースが上部よりも広いように所定の位置に設定、PIVEC のベース上にアダプター ピースを挿入します。
- アダプター部分内で読み込まれたフィルター細胞培養を配置する使用ピンセットを挿入します。トップ部分のベースが上部よりも広い場所にセトリング アダプター ピースの上にトップの部分を配置します。ダクトテープの単一の層と PIVEC をラップします。
- 所定の位置に押して 37 mm カセット作品に PIVEC の上部と下部に接続します。カセットの入口と出口に ¼"アダプターを配置します。
- ワイヤーが基地で PIVEC のまわりで抵抗ヒーターをラップします。固定するテープです。
- 断熱用アルミ箔の 〜 8 ラウンドで PIVEC をラップします。テープで固定します。
- 接続 2"1/2" PIVEC の上にアダプターに外径のフレキシブル チューブの長い作品。多孔質管を滅菌水と PIVEC の上にチューブ内の場所から削除します。
- クランプ リングの立場で、安全に PIVEC を置きます。真空ポンプ、粒子カウンター、およびエアロゾルのセットアップとセットアップを完了します。
注: パーティクル カウンター別の実行で PIVEC 前後、PIVEC に配置している場合にのみ、数に基づく堆積量を決定できます。 - 0.5 LPM で 10 分間の露光時間を使用したこの研究ではステップ プロトコルと曝露時間と流れ率 2.2 を使用してフィルターを公開します。セットアップから PIVEC を削除します。細胞文化挿入を取り出して測定する前に、少なくとも 24 時間の低湿度条件下にフィルター ホルダーで公開されているフィルターを配置します。
- 70% エタノールできれいに PIVEC。次の実験の前に少なくとも 30 分間の紫外線で殺菌します。
- 3 回公開されるフィルターの重さし、フィルターのウェイトを記録します。ストレージのラベル フィルター ホルダーに公開されているフィルターを配置します。
4. 堆積量と溶着率の計算
注: 沈着の知識はエアロゾル管理と細胞応答の解釈のために重要です。
-
質量ベースの測定からを計算します。
- 曝露前の平均重量と曝露後の平均体重の違いとしてフィルターに堆積の質量を計算します。この値は、堆積量の質量を用いた実験です。
- 使用管理の質量、m は管理者と質量を用いた預託線量計算質量を用いた成膜効率 ηm実験のために mdep、4.1.1 以降で決定します。
- 4.1.1 と沈着を決定する少なくとも 3 実験の 4.1.2 項及び粒 PIVEC の成膜効率平均値。
-
数ベースの測定からを計算します。
- 後、PIVEC と、PIVEC の前に粒子濃度を決定するパーティクル カウンターによる測定カウンターで実行されたことを確認します。パーティクル カウンターの時間の経過とともに粒子濃度を統合し、合計を決定する粒子径以上統合測定粒子。
- 投与粒子と粒子測定のポスト PIVEC の違いとして堆積粒子数を計算します。この値は、実験の数に基づく堆積線量です。
- N管理、数値ベース管理使用粒子堆積線量 ndep、体積流量、V と、時間 t、ηn実験の数に基づく堆積効率を計算します。
- 4.2.2 と 4.2.3 沈着を決定する少なくとも 3 の実験、粒子サイズの PIVEC の成膜効率平均値です。
5. エアロゾル微小
注: セルのリーダーの気液界面培養は空らに呼ばれます。38演算子は、バイオ セーフティ キャビネット内 (手順 5.1.2-5.1.4) を読み込み携帯文化挿入を実行する必要があります。演算子は、ヒューム フードでエアロゾルのエクスポー ジャーを実行します。
-
気液界面培養細胞
- A549 細胞培養用フラスコからトリプシン-EDTA、T75 フラスコまたは T25 フラスコ 1 mL 3 mL を追加することによって持ち上げ、37 ° C で 5 分間インキュベートT25 フラスコにフラスコ、細胞懸濁液をリンス フラスコの壁回復した細胞の数を最大化する 7 mL の完全培 T75 フラスコまたは完全なメディアの 4 mL を追加します。細胞懸濁液を滅菌 15 mL の円錐管、3 分間 800 × gで遠心分離セルに転送します。
- 培養上清中の含んでいるトリプシン-EDTA を削除し、完全なメディアの 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液の 10 μ L を削除し、検定を追加します。濃度と細胞の総数を決定する診断を使用してセルをカウントします。
- 完全なメディアの 0.5 mL を 24 well プレートの各ウェルに配置します。井戸の未使用細胞培養インサートを配置します。種細胞培養を近 1 × 105セル/cm2日あたり倍増に近いペースで成長するセル型のセル密度で根尖側に挿入します。種子、24 内のセルも挿入 A549、35,000 の細胞を細胞培養に追加することで 1 × 105セル/cm2の密度でシード セルを挿入します。
注: より遅い成長率と細胞は、細胞密度で播種できます。 - (24 well プレート最終巻は 0.25 mL) の最終的なボリュームに到達する細胞文化挿入の根尖側に完全なメディアを追加します。
- 交換メディアごとに 1-2 日間の湛水条件で 7 日間培養。7 日後基底メディアのみを交換アリ状態で少なくとも 1 日頂のメディアと文化を削除します。
-
PIVEC を組み立てる
- 露出する前に、少なくとも 24 時間の気液界面に平衡します。
- フィルターに細胞培養の挿入をサポートする PIVEC の適切なセル文化挿入アダプターを選択します。場所細胞培養 PIVEC ベース、アダプター部分のベースが上部よりも広いように所定の位置に設定の上にアダプターを挿入します。PIVEC のベースのほかに細胞の培養基の 4 mL を追加します。
- 5.2.3 の手順は、アダプター部分内で細胞培養を配置する使用ピンセットを挿入します。トップ部分のベースが上部よりも広い場所にセトリング アダプター ピースの上にトップ部分を配置します。慎重に、ダクトテープの単一の層と PIVEC をラップします。
- 所定の位置に押して、PIVEC の上部と下部に 37 mm カセットの部分を接続します。カセットの入口と出口に ¼"アダプターを配置します。
- ワイヤーが基地で PIVEC のまわりで抵抗ヒーターをラップします。固定するテープです。
- 断熱用アルミ箔の 〜 8 ラウンドで PIVEC をラップします。テープで固定します。
- 1/2"外径フレキシブル チューブの短い部分を PIVEC の上にアダプターに接続します。多孔質管を滅菌水と PIVEC の上にチューブ内の場所から削除します。
- クランプ リングの立場で、安全に PIVEC を置きます。真空ポンプとエアロゾルのセットアップとセットアップを完了します。
-
アリ、PIVEC を使用して細胞を公開します。
- 吸入する粒子の質量を計算するのにステップ 2 で決定した成膜効率を使用します。適切な質量をはかるし、ヒューム フード内のステップ 2 の後の設定エアゾール システムに追加。
- この研究では生物学的エンドポイントの 2.2 のステップに従うことによって細胞の公開、セルが 3.5 mg 銅ナノ粒子の約 0.5 LPM の流量にさらされた、暴露時間に行われた 10 分コントロール研究の加湿空気を使用して決定単独での空気の影響。セットアップから PIVEC を削除します。細胞文化挿入を取り出し、滅菌のウェル プレートに、CO2インキュベーター (37 ° C、5% CO2、90 %RH) に戻る。
- PIVEC からメディアを吸い出しなさい。追加実験を実行している場合、リン酸 PIVEC のリンス下部バッファー ソリューション、5.1 および 5.2 手順を繰り返します。
- したら 70% エタノールできれいに PIVEC。次の実験の前に少なくとも 30 分間の紫外線で殺菌します。
-
生物学的定量法
注: 本研究での試金が DCFH DA アッセイによる酸化ストレス発生と乳酸脱水素酵素 (LDH) のリリースによって細胞毒性。- 1 mM DCFH DA ソリューション 50 mL のメタノールで DCFH-DA の 24.4 mg を溶解します。このソリューションは、最大 4 ヶ月間-20 ° C で保存できます。9.9 ml に 10 μ M の 10 mL HBSS 1 mM DCFH DA ソリューションの 0.1 mL を混合することによって 1 mM DCFH DA ソリューションを希釈 DCFH の DA
- 文化挿入約 1 ml の PBS の文化メディアと洗浄セルのセルを削除します。挿入したらを取り付け、各ウェルに 10 μ M DCFH ダ溶液 0.5 mL を追加します。染料の光を防ぐため、1 h の 37 ° C の定温器に戻るアルミ箔でプレートをカバーします。
- インキュベーターからセルを削除し、井戸から DCFH DA 作業ソリューションを吸引します。井戸に 0.5 mL HBSS を追加し、細胞培養インサートを置き換えます。
- ウェル プレートを読み込むプレート リーダーと測定基準蛍光励起/蛍光波長 485/530 の nm。露出のための PIVEC に、プレート リーダーと負荷の挿入からプレートを取り外します。
- 希望の暴露期間のセルを公開します。PIVEC からカバーを取り外します、ウェル プレートに戻ります。ウェル プレートとホワイト 96 well プレートの場所から基底液 50 μ L を削除します。DCF 485/530 の励起/蛍光波長の蛍光を測定 nm 30 分毎 2 時間暴露後。
- LDH 分析ソリューション、混合次メーカー プロトコルの 20-30 分を追加 50 μ L の部屋の温度を平衡させ、10 分も停止液を追加 25 μ L 反応ウェル プレートと基底液に基底液ができます。ら製品 560/590 の励起/蛍光波長の蛍光を読み取る nm。
- 追加基底液を削除、手順 5.4.6 4 h で 24 時間暴露後.
6 統計的な方法
- 生物試験データの解析
- ベースライン測定値を基準にして扱われた細胞の蛍光強度の増加として活性酸素産生を報告します。未処理のセルと相対的に扱われた細胞の蛍光強度の増加と LDH 活性を報告します。
- 単一要因 ANOVA のデータ セット間の統計的な差異を決定するを実行します。必要に応じて、値 0.05 の意義の学生の t テストを実行します。少なくとも 3 つの露出測定の平均 ± 標準偏差としてデータを報告します。
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Representative Results
労働の in vitro毒性にはエアゾール露出を実行しながら細胞を維持が含まれます。PIVEC システムは、図 2を含めて温度と湿度制御と着用の PIVEC に表示されます。電池式抵抗加熱装置を使用して温度を維持し、加湿を使用してエアロゾル増加多孔質、接液部のチューブを介して自然な加湿。研究室内部設定制御エーロゾル、PIVEC は図 1に示すように露出の設定にできます。システムの細胞応答を関連付けることができます、セルの上に堆積した投与量の検討が可能です。
成膜効率は宿便、沈降、および拡散蒸着力が含まれているので、システムに追加する粒子の大きさに依存しています。さらに、堆積は流量、露光時間、露出系の特性に依存しています。この情報により、堆積を予測できます。PIVEC の堆積効率は、2 つの方法、重量分析法、粒子の数のカウントによって決定されています。式 1 と 2 は、表 1に基づいて、フィルターを使用してスキャン モビリティ粒径 (SMPS) と図 3の sizer (OPS) 測定値光粒子の成膜効率を決定するために使用されました。24 もデザイン、6 うまく設計し、わずか 100 の低下よりも全体的に増加沈着を観察と比較して 40 nm nm と 800 nm 銅粒子。24 ウェルの沈着は挿入で非常に均一、6 よくデザインの沈着が挿入の中心に近い粒子の沈殿物のほとんどは均一性に欠けているただし。37 mm フィルターと細胞曝露後投与量の決定の必要性を減少させる細胞文化挿入と線量の関係を決定することにより、暴露後分析を繰り上げることができます。37 mm フィルター カセットと、PIVEC 内にある成膜の比較 0.7, 800 のためのだけ上記のピアソン相関とすべてのサイズと井戸の強い相関を示しています nm は相関をもつ重要な < 0.05、図 4を参照してください。文学を通して同様のシステムと比較して、11,12テスト粒子サイズの範囲にわたって PIVEC の成膜効率は、同等または増加報告される値は、図 5にみられる上。静電気散逸、または導電性プラスチックまたは同じような材料を使用して、PIVEC を設計するシステムへの損失を最小限に抑えることによって、PIVEC 内成膜効率が向上します。
フィルターは、露光前に湿度制御環境で十分に乾燥しない、余分な水は最初の固まりの増加し、非物理的な否定的な堆積量を作り出すことができます。流量変動は、システム内で一貫性のない堆積量を促進することも。これらの問題を避けるためには、少なくとも 1 日前に、湿度制御環境で乾燥フィルターのための露出の後を許可します。
細胞応答は堆積量によって影響され、細胞が正しく管理されていない場合、暴露期間によって影響されるかもしれない。A549 細胞、肺胞上皮癌細胞ライン、流量 0.5 LPM で銅ナノ粒子の様々 なサイズを 10 分間さらされました。迅速な露出中の適度な流量を用いるに対し、代替垂直流れ持続暴露期間 0.005 LPM と 1.5 LPM の間露出システム使用です。測定し、投与、1.58 ± 0.04 mg/cm2の 40 nm 銅、0.30 ± 0.00 mg/cm2 , 100 nm 銅粒子の質量を用いた成膜効率を用いた、0.32 ± 0.01 mg/cm2 800 nm 銅粒子の細胞の上に堆積しました。細胞毒性と酸化ストレス暴露に後最初の二十四時間内に観察されました。細胞毒性は、損傷した細胞をすぐに、4 時間および 24 時間暴露後の乳酸脱水素酵素 (LDH) のリリースを使用して測定しました。露出、図 6 bの 4 時間以内は 1.62 mg/cm2以下銅ナノ粒子から有意な毒性はありませんでした。二十四時間暴露後そこが 20% 未満の細胞生存率に統計的に有意な減少銅ナノ粒子の細胞の生存率。細胞内の酸化ストレスは最初 2 時間後露出図 6a内活性酸素種によっては DCFH の酸化を介して DCFH DA アッセイを使用して調べた。酸化ストレスの重要なレベルは、すべてのサイズの銅ナノ粒子の細胞の 30 分後の露出を測定しました。酸化ストレスのレベルは観察 2 時間以内にテストすべてのサイズの同じような率で増加を続けた。
エクスポー ジャーの成功は、細胞応答の再現性を確認できます。2 つの選考基準を提案する細胞毒性の試金を含める: 50% 以内に 1% 総 LDH 漏れをする必要があります肯定的な制御は 50% とバリエーションの 2) の正とサンプルの複製係数よりも大きくする必要があります。39これらの条件がない場合は、変更された降下量や不十分な湿度や温度管理など、実験のこの提案違い満たされて。さらに、細胞毒性測定を観察し、実験コントロールの理解につながることができますエラーを決定する際に役立ちます。流量が高すぎると、細胞は剪断応力の高い金額から死ぬかもしれない。流量を下げて、流れから細胞にストレスを減らすことができます。
図 1。ドライ散布システムと実験のセットアップのスケマティック。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。PIVEC デザインします。30 cm の背の高いボックスと比較のための写真 A) 完全な設計。B) 温度と湿度制御 PIVEC は、30 cm と比較のため背の高いボックスを描かれています。C) 着用の PIVEC。D) PIVEC トップ部分。E) 細胞文化 24 よくアダプター (左) と 6 井戸 (右)。F) 一番下の部分。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 数基成膜効率 (%) | 質量を用いた成膜効率 (%) | ||||||
| よく 6 | 40 nm | 17.83 | ± | 32.13 | 5.85 | ± | 0.85 |
| 100 nm | 0.47 | ± | 4.06 | 5.11 | ± | 0.94 | |
| 800 nm | 3.70 | ± | 35.00 | 6.39 | ± | 1.01 | |
| よく 24 | 40 nm | 1.43 | ± | 2.43 | 12.61 | ± | 1.34 |
| 100 nm | 1.37 | ± | 19.45 | 2.95 | ± | 0.75 | |
| 800 nm | 6.98 | ± | 3.93 | 15.95 | ± | 0.53 | |
表 1。PIVEC 成膜効率。
図 3。銅ナノ粒子エアロゾル粒子個数濃度。A) SMPS 測定。OPS B) 測定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。セル挿入時の沈着と SKC 37 mm フィルター関係。誤差 ± 0.002 mg。A) 40 nm 銅粒子。B) 100 nm 銅粒子。C) 800 nm 銅粒子。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。文学における垂直フロー露出システムと比較して PIVEC の成膜効率。固体マーカーに垂直フロー露出システムから文献値をプロットし、PIVEC 値は、空のマーカー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。銅ナノ粒子曝露後 (PE) への細胞応答します。すべての測定は、n = 3 p < 0.05。A) 酸化ストレス DCFH DA の試金を使用して決定します。B) 毒性 LDH の試金を使用して決定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
フィルター カセット呼吸ゾーンにおけるエアロゾルの収集のシンプルで安価な方法を提供します。ただし、フィルターから抽出されたエアロゾル試料全体のエアロゾル (すなわち気体、揮発性物質、及び粒子) を表す、その結果の関連の生物学的影響評価を制限します。37 mm フィルター カセットの初期設計を使用すると、移植性を維持し、吸入からの粒子の生体内沈着を模倣する、PIVEC です。PIVEC は現在アリ暴露システム、ほぼ含まれている温度・湿度コントロールとティッシュ ボックスのサイズより大幅に小さい。サイズは、エアロゾルへの細胞応答のデータをまた提供している間個人的なカスケード インパクターに似ています。PIVEC には、他の現在の露光装置と比較すると 1 つのサンプルのためのスペースが含まれますが、小さいサイズは、サンプル サイズを大きくし、監視対象となる空間分布したがって、複数のシステムを同時に使用するを許可します。
プロトコルのいくつかの重要な手順があります。成膜効率を決定するには、手順 1 で説明したようフィルターを正しく条件が重要です。さらに、正しく露出および質量を用いた成膜効率を決定するフィルターの記事露出の前に銅ナノ粒子の重量を量ることが重要です。番号の成膜効率は、堆積初期のエアロゾル濃度とパーティクル カウンターを使用して最終濃度の差を利用して決定する必要があります。成膜効率が正しく判別できない場合、エアロゾルの種類の生物学的反応の違いを特定することは困難です。沈着変更沈着を変更することがあります。蒸着は、流動率および暴露期間を変更することによって増やすことが。細胞を乾燥の可能性と細胞生存率に影響を与えるこの可能性がありますも。エアロゾルのエアコンは体温や気道の加湿などの生理学的属性を補うためにしばしば実行されます。湿度が高く、50% 以上は、吸入空気を模倣し、車両暴露による細胞死が減少します。43温度と湿度は、よく制御されないとき、細胞の反応が影響があります。流量を減少させることによって沈着の増加すべてのサイズの追加のパーティクルは入金されます。暴露期間は、蒸着、拡張実験期間預金するより多くの粒子を許可するのに比例。エアロゾルのエアコンは、暴露期間を増加し、細胞が生体の応答に影響することができますを乾かさないように重要です。
PIVEC の流れを細胞を乾燥させる可能性があるし、細胞にストレスを追加するセルに宿便、沈降、および拡散を介して粒子を入金するのに垂直フローを使用します。成膜効率は堆積の力に起因する粒子の大きさに依存しています。垂直フローの現在の露光装置の多くは 10% と 1% に近い多くの下の成膜効率を持ちます。PIVEC は、成膜効率が重量分析を 24 の 16% に 3% のによって決まります文化挿入のセルもいます。粒子数に基づく堆積効率は同じチップの約 1% から 7% です。まあ、6 を使用する場合細胞培養を挿入し、スペースを開発する流れのない細胞文化挿入中以上の粒子に閉じ込められると、エアロゾルの合理化のため、最小の粒子サイズを除いて、これらの数値を減少させます。6 よくセル文化挿入は、蒸着をバイパスするエアロゾル ストリームを許可します。他の垂直フロー システムはを使用して 60 nm フルオレセイン粒子40、80 単位質量に特徴づけられている nm と 180 nm 銅粒子16、60 nm アジピン酸粒子41。結果として得られる堆積効率は、一般的に 0.05% と 11% の間。番号的には、ポリスチレン粒子12,15、炭素ナノ粒子12、およびシリカ粒子42, 0.2%、11% 間の効率をもたらすを使用してこれらのシステムを特徴づけられています。利用可能な携帯電話の露光装置と比較して類似または増加、蒸着、PIVEC を提供します。
40 の銅ナノ粒子を用いた細胞のエクスポー ジャーを行った nm、100 nm と 800 nm。細胞生存率が 4 時間暴露後の生存率も大幅に減少、LDH の試金を使用して定義されました。LDH アッセイを併用した商業的露出システム 74 ng/cm2の 2 時間前後 148 ng/cm2連続曝露 4 時間 2 の孵化後堆積された 9.2 nm 銅酸化物粒子44 1 μ g/cm2の 4 時間後時間、それから 4 時間 25 nm 銅酸化物粒子40, 細胞生存率の両方の測定の有意な減少の別の露出。細胞毒性は、トリパン ブルー色素排除による16銅ナノ粒子測定 180 nm 粒子の 1.6 7.6 μ g/cm2の別のシステムで観察されました。15 分の 40-80 nm 銅酸化物ナノ粒子への暴露は生存率の減少、24 時間記事露出を測定します。低毒性、PIVEC を用いて観察された 10 分の短い露光時間と投稿露出測定時間の短縮可能性があります。4 時間後の暴露の後、PIVEC の細胞の生存率が減少しました。セルは、他の研究9,40,の44,45,46との合意の重要な毒性は認められなかった湿度コントロールに公開。酸化ストレスは、DCFH DA の試金を使用して決定しました。過酸化水素や酸素ラジカルなどの活性酸素種の生産には、成長の逮捕や細胞の死につながることができますストレスの量が生成されます。細胞曝露後セル コントロールとしてのインキュベーターで保管、湿気のある空気にさらされる細胞の酸化ストレスに最小限の増加があった。すべての粒子サイズは、曝露後 30 分以内に昇格した酸化ストレスが発生しました。1 つの研究、9.2 nm 銅酸化物粒子44 25 nm 銅酸化物粒子内40はまたカルボキシ DCFH DA アッセイによる酸化ストレスを誘導します。増加の暴露時間 2 時間から 4 時間高酸化ストレス 9.2 nm 銅酸化物粒子44。露出の 4 時間後 9.2 nm 銅酸化物粒子生産と同様の酸化反応 25 nm 銅酸化物粒子の40の曝露を示唆している連続曝露期間は高い酸化ストレスによる影響粒子サイズです。セル、PIVEC 内で公開制作その調査と比べて高い酸化ストレス、ただし、代替システムで公開されている粒子銅酸化物、銅、PIVEC 内で公開よりもより迅速に溶解されます。組成を銅の溶解に関する研究を行い, 粒子のサイズより大きな粒子と金属酸化物が金属粒子や、ナノ粒子対応16,47より低速イオンをリリースすることに同意,48,49湿度コントロールは、インキュベーターのコントロールと比較して酸化ストレスのかなりの量を作り出さなかった、酸化ストレスを誘導する銅粒子の影響は同様の体外露出に PIVEC 内で一貫してシステム。PIVEC を使用してみられる生物学的応答は、細胞の露出のための適切なシステムを PIVEC にはお勧めします。
特性解析と細胞学、PIVEC 文学と同意するが、9,16,40,44,46デバイス制限があります。小さなデザインは、他の露光装置と比較して 1 つのデバイスで同時に公開できるサンプルの数を減らします。他のシステムには、複製の測定を促進する同じエアロゾル9,12細胞エクスポー ジャー、少なくとも 3 つを可能にします。PIVEC は、システムあたり 1 つの挿入のみできますが、この問題を軽減する支援小さなサイズを簡単に使用する、複数のシステムのことができます。一方、他の個人モニタリング システムは、細胞を使用しない、PIVEC 保たれなければならないの細胞培養媒体の流出を減らすために垂直に近い細胞を維持するために必要です。PIVEC が特定の粒子の範囲 (例えば午後10、午後2.5、午後0.1) の最適化されていないが、PIVEC は、粒子サイズの範囲に特徴づけられています。他の垂直フローのシステムと同様に、PIVEC は 100 付近の粒子を預金する能力の低下を示しています直径 40 中 nm nm と 800 nm 粒子と同様の効率で堆積しました。
細胞曝露後の分析は、PIVEC と SKC 37 mm フィルター カセット内のエアロゾルの並列コレクションの実行によって繰り上げることができます。重量ベース蒸着の高相関推定を可能に粒子の固まりの収集した 37 mm フィルターを使用して収集されたデータから細胞の。フィルター カセットに挿入の比較その他のサンプルと投与量の決定に追加の測定を収集する必要性が軽減されます。進行中作業にはには、細胞毒性、酸化ストレス、または他の生物学的エンドポイントのリアルタイム監視システムの統合が含まれています。化学プラント、上記ドローン上のパーソナル モニターとして体になど、さまざまな設定で使用することができます、PIVEC の小型サイズや解像度の環境で外。このメソッドは、アリに成長した細胞培養にエアロゾル粒子のコレクションのため、PIVEC の使用を示しています。37 ± 1 ° C と > 80% の相対湿度にエアロゾルをコンディショニングすることで急性暴露中に細胞生存率を維持できます。このメソッドは液滴と固体粒子ベースのエアロゾルの両方に適しており 40 間の粒子を堆積させるために示されている nm と 800 nm 細胞文化挿入。PIVEC の汎用性により、さまざまな生物学的エンドポイントを複数の設定で使用されるこのメソッドです。
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Disclosures
著者の所属は、送付状に表示されます。著者はヴァージニア連邦大学、リッチモンド、バージニア州で、作業が完了したによって財政上支えられる著者は、書くと本稿の内容に責任を持ってください。著者は、競合する利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、ボリス ・ Solomonov、ラピッドプロトタイピング デバイスのヘルプについてバージニア州連邦革新マシン ショップに感謝したいと思います。著者も Lewinski グループのクリスティアン ・ ロメロ-フエンテス、博士 Vitaliy Avrutin、博士ディミートリ ・ Pestov、バージニア州連邦ナノ コア評価施設彼らの助けの粒子特性評価とを感謝したいと思います。この作品は、バージニア ・ コモンウェルス大学工学部博士 Lewinski に供給したスタートアップ資金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scanning mobility particle sizer (SMPS) | TSI, Inc. | 3910 | NanoSMPS |
| Optical particle sizer (OPS) | TSI, Inc. | 3330 | |
| Stainless Steel Pipe, 4" Long | McMaster-Carr | 4830K116 | Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size |
| Brass Ball Valve with Lever Handle | McMaster-Carr | 4112T12 | Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female |
| Steel Pipe, 2" Long | McMaster-Carr | 7753K121 | Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size |
| HEPA filter | GE Healthcare | 09-744-12 | HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule |
| Vacuum Generator | PISCO USA | VCH10-018C | |
| PIVEC | VCU | For design please contact authors | |
| Resistive heater | |||
| 1/4" barbed connectors | Zefon International, Inc. | 459743 | |
| Porous tubing | Scientific Commodities, Inc. | BB2062-1814A | Hydrophilic 10 um pores |
| Battery power bank | |||
| Cell culture insert | Fisherbrand | 353095 | 24 well plate insert |
| Filter Forceps | Fisherbrand | 09-753-50 | |
| Transfer Pipette | ThermoScientific | 13-711-27 | |
| Glass Fiber Filters | SKC | 225-7 | Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore |
| Ultra Micro Balance | A&D | BM-22 | Housed in environmental chamber |
| 37 mm filter cassette | SKC | 225-3250 | Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene |
| Variable flow vacuum pump | SKC | 220-5000TC | AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min |
| Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1090 | 40 nm |
| Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1088 | 100 nm |
| Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1117M | 800 nm |
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