Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

doi: 10.3791/58938 Published: January 20, 2019

Summary

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een gewijzigde zymographic techniek waarin fluorescerende peptides worden gebruikt als het afbreekbaar substraat in plaats van de inheemse proteïnen. Elektroforese van biologische monsters in fluorescerende peptide zymograms maakt detectie van een breder scala van proteasen dan vorige zymographic technieken.

Abstract

Het doel van deze methode is voor het meten van de proteolytic activiteit van complexe biologische monsters. De monsters worden gescheiden door molecuulgewicht met behulp van elektroforese via een oplossen gel ingebed met een afbreekbare substraat. Deze methode verschilt van de traditionele gel zymography daarin een gehard fluorogenic peptide covalent is opgenomen in het oplossen gel in plaats van volledige lengte eiwitten, zoals gelatine of caseïne. Gebruik van de fluorogenic peptiden kan directe detectie van proteolytic activiteit zonder extra kleuring stappen. Enzymen in de biologische monsters klieven de gehard fluorogenic peptide, resulterend in een verhoging in fluorescentie. De fluorescerende signaal in de gels is dan beeld met een standaard TL gel scanner en gekwantificeerd aan de hand van densitometrie. Het gebruik van peptiden als het afbreekbaar substraat sterk breidt de mogelijke proteasen aantoonbaar met zymographic technieken.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gel zymography is een biologische techniek voor het meten van proteolytic activiteit binnen biologische monsters, zoals lichaamsvloeistoffen of cel voedingsbodems1,2,3. De monsters worden gescheiden door hun molecuulgewicht met elektroforese via een polyacrylamidegel ingebed met een afbreekbare substraat. Gemeenschappelijke afbreekbaar substraten omvatten gelatine, caseïne, collageen en elastine, die zijn gebruikt voor het meten van de activiteit van matrix metalloproteinasen (MMP) -1 -2, -3, -7, -8, -9, en -11, naast een verscheidenheid van cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. na elektroforese, de enzymen zijn renatured en toegestaan te degraderen de eiwit binnen de gel. In traditionele gel zymography, de gel is gekleurd met een eiwit kleurstof, zoals Coomassie Blue, en protease-activiteit wordt gedetecteerd als een verlies van signaal, dat wil zeggen, witte banden (afbraak van eiwitten) op een donker blauwe achtergrond.

Hier beschrijven we een protocol voor een alternatieve methode van gel zymography, waarin het afbreekbaar substraat een korte, fluorogenic peptide covalent opgenomen in het polyacrylamidegel (Figuur 1 is). De vervanging van synthetische peptides als de afbreekbaar substraten maakt detectie van een breder scala van proteasen in vergelijking met traditionele gel zymography met inheemse proteïnen9. Covalente koppeling van de fluorogenic peptide verhindert diffusie van peptide en migratie tijdens gelelektroforese waargenomen met vorige methoden9,10. Het gebruik van een substraat fluorogenic maakt bovendien direct opsporen van protease-activiteit zonder extra kleuring en -kleuring stappen. Het algemene doel van deze methode is het opsporen van protease-activiteit in biologische monsters via de covalente opneming van fluorogenic peptiden in zymogram gels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. bereiding van de oplossing laag van Gel

  1. Voorbereiden van een 10%-polyacrylamide oplossen van gel oplossing volgens tabel 1. Voeg de Tetramethylethylenediamine (TEMED) en Ammonium Persulfate (APS) onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.
  2. Vul een lege 1,5 mm mini gel cassette halverwege (5 mL) met de 10%-oplossing voor oplossen gel.
  3. Een dun laagje van isopropanol (~ 500 µL) toevoegen aan de bovenkant van het polyacrylamidegel te produceren een niveau gel en luchtbellen voorkomen. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing voor het bijhouden van de voortgang van de polymerisatie-reactie. Wanneer de polyacrylamide in de buis is volledig verhard, is de reactie voltooid (~ 40 min).

2. voorbereiding van de Azido-PEG3-maleimide Linker molecuul

  1. Terwijl de eerste oplossen gel laag is actinemonomeren, de azido-PEG3-maleimide-kit ophalen uit de opslag van-20 ° C en laat de componenten tot kamertemperatuur. Er zijn twee componenten in elke kit. Flacon 1 bevat een maleimide-NHS ester, een gebroken wit naar grijs solide. Flacon 2 bevat azido-PEG3-amine, een lichtgeel olie.
    Opmerking: De auteurs suggereren met behulp van de 25 mg azido-PEG3-maleimide kit, zoals het alleen voor een korte periode van tijd (1-2 uur) kan worden opgeslagen bij-20 ° C na voorbereid voordat het begint te degraderen. 25 mg volstaat voor de productie van 10 peptide gels. Gebruik gels binnen 3 weken van voorbereiding.
  2. Los van de componenten van de flacon 2 in de fabrikant aanbevolen hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO) en vortex voor 30 s om de vloeistoffen goed zijn gemengd.
  3. Breng de inhoud van de flacon 1 in een schone, droge 100 mL Rondbodemkolf met een roer-bar.
    Opmerking: Spoel de kolf met aceton en volledig drogen vóór gebruik om te voorkomen dat vocht uit te bemoeien met de reactie.
  4. Onmiddellijk invoegen een rubberstop tussenschot met een membraan die met een spuit in de mond van de kolf kan worden doorboord. Werk snel om te voorkomen dat vocht de kolf.
  5. Invoegen twee 18 meter syringe naalden in het middenrif en sluit een aan de gastank van een inert (bijvoorbeeld argon gas). Toestaan dat het inert gas te vullen de kolf gedurende 3 min. Mix de componenten van de flesjes 1 en 2 onder inert gas om te voorkomen dat ongewenste reactieproducten.
    Let op: De tweede naald van de spuit is bedoeld als een vent, waardoor de atmosferische lucht die deel uitmaakt van de kolf uit de kolf stromen als het vult met inert gas. Vergeet niet om op te nemen van een vent naald!
  6. Uitschakeling van het inert gas en het loskoppelen van de naald. Behulp van een spuit, injecteert de volledige inhoud van de flacon 2 in de kolf.
  7. Verwijder zowel naalden en spuiten en de Components wilt mengen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tijdens het roeren.
  8. Verwijder de rubber tussenschot stop en de inhoud overbrengen in een centrifugebuis schone 5 mL. De azido-PEG3-maleimide-oplossing moet binnen 1 uur bij kamertemperatuur worden gebruikt.

3. voorbereiding van de Peptide Gel laag oplossen

  1. Zodra de eerste oplossen gel laag heeft polymeervorm, giet af de isopropanol-laag. Spoel de bovenkant van de gel door pipetting 1 mL gedeïoniseerd water op de bovenkant van de gel en giet uit het water.
  2. De thiol-matiemaatschappij fluorescerende peptide ophalen-80 ° C-opslag en laat ze ontdooien op kamertemperatuur.
    Opmerking: De thiol-matiemaatschappij peptide kan bereid worden zoals eerder beschreven11,12. Verkrijgbare peptiden kunnen ook worden gebruikt maar vereist de toevoeging van een terminal cysteine residu om de maleimide-thiol Klik op reactie. Los van de peptide tot een voorraad concentratie van 10 mM en opslaan bij-80 ° C in kleine (30 uL) porties te beperken van herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.
  3. Voorbereiden van een 10% oplossing van gel oplossing met het linker azido-PEG3-maleimide-molecuul en de fluorescerende peptide volgens tabel 1. Voeg de TEMED en de APS onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.
  4. Vul de helft van het resterende deel van de gel cassette (3 mL) met de peptide oplossen van gel oplossing.
    Opmerking: Een multi-layer oplossen gel aanpak vermindert de hoeveelheid peptide en linker nodig voor elke gel. De grootte van de peptide oplossen gel laag kan worden aangepast aan een grotere reeks molecuulgewichten zo nodig.
  5. Pipetteer een dun laagje van isopropanol (~ 500 µL) naar de top van het polyacrylamidegel te produceren een niveau gel en luchtbellen voorkomen. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing voor het bijhouden van de voortgang van de polymerisatie-reactie. Wanneer de polyacrylamide in de buis is volledig verhard, is de reactie voltooid (~ 40 min).
    Opmerking: De fluorescerende peptide is lichtgevoelig. Houd de gels bedekt met aluminiumfolie ter voorkoming van photobleaching tijdens de voorbereiding van het gel elektroforese, wassen en ontwikkeling.
  6. Giet af de laag isopropanol en spoel de bovenkant van de peptide oplossen van gel met gedeïoniseerd water zoals in stap 3.1.
  7. Als met behulp van de gels onmiddellijk, gaat u verder met stap 4, anders, dompel de bereid gels in 100 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C in een plastic doosje om te voorkomen dat de gels uitdrogen. Wikkel het vak in aluminiumfolie om te voorkomen dat photobleaching. Gels, kunnen worden opgeslagen in PBS voor maximaal 3 weken voorafgaand aan gebruik.

4. voorbereiding van de stapelvolgorde Gel

  1. Bereid een 5% stapelen-gel oplossing volgens tabel 1. Voeg de TEMED en de APS onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.
  2. Vul het resterende lege gedeelte van de gel cassette (~ 2 mL) met de stapelvolgorde gel-oplossing.
  3. Snel een 1,5 mm gel kam in de stapelvolgorde gel laag invoegen, om ervoor te zorgen geen luchtbellen blijven opgesloten onder de putten. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing voor het bijhouden van de voortgang van de polymerisatie-reactie. Wanneer de polyacrylamide in de buis is volledig verhard, is de reactie voltooid (~ 10 min).
  4. Verwijder voorzichtig de kam en de tape vanaf de achterkant van de cassette van de gel.

5. bereiding van biologische monsters voor elektroforese

  1. Bereiden geconditioneerde cel media, cel lysates weefsel homogenates en MMP normen zoals elders beschreven onder niet-reducerende omstandigheden2. De monsters niet verhit.
  2. Bijvoorbeeld, bereiden geconditioneerde cel media als volgt:
    1. Plaat 40.000 cellen/cm2 cellen in een 6-well plaat in 10% foetale runderserum (FBS) voedingsbodems. Incubeer de cellen in een bevochtigde kamer (5% CO2 bij 37 ° C) voor 24 uur en laat hen tot 70-80% samenvloeiing.
      Opmerking: Als de cellen de gewenste confluentie na 24 uur niet hebben bereikt, hen in staat stellen om te groeien in 10% FBS voedingsbodems voor een aanvullende 24 uur.
    2. Spoel de cellen tweemaal met PBS en voeg toe 2 mL serum-vrije cultuur media. Incubeer de cellen in een bevochtigde kamer (5% CO2 bij 37 ° C) voor een aanvullende 24 uur.
    3. Met behulp van een serologische precisiepipet, verzamelen de geconditioneerde media van elk putje. Centrifugeer de media van 1200 toeren per minuut gedurende 3 minuten aan elke cel puin te verwijderen. Neem het supernatant en concentreren met behulp van een 15 mL, 10 kDa molecuulgewicht cutoff centrifugaal filter eenheid. Centrifugeer de eenheden van de filter op 4.000 x g gedurende 15 min. in een swingende emmer rotor of 5000 x g gedurende 15 min. in een vaste hoek rotor.
      Opmerking: Deze stap is optioneel, maar de intensiteit van de Proteolytische bands in de peptide zymography gels kunt verbeteren.
    4. Het geconcentreerde filtraat overbrengen in een centrifugebuis verse 1,5 mL. Aliquot en winkel monsters bij-80 ° C gedurende maximaal drie bevriezen-ontdooien cycli.
  3. Gehalte aan andere melkeiwitten met behulp van een standaard eiwit kwantificering assay kwantificeren (bijvoorbeeld BCA, de analyse van Bradford, enz.).

6. de Elektroforese van biologische monsters in Peptide Zymography Gels

  1. Ontbinden van monsters in conventionele zymography monster buffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% glycerol, 4% SDS, 0,01% bromophenol blauw). Voor cel- en weefseltransplantaties monsters, ~ 30 µg totaal eiwit per putje wordt aanbevolen, en 50-100 ng van eiwitten voor de MMP-normen.
  2. Voeg 400 mL 1 x Tris-Glycine SDS uitvoeren Buffer op de gel-apparatuur. Laad tot 35 µL van monster per putje. De monsters worden uitgevoerd op 120 V bij 4 ° C gedurende 1,5 uur of totdat de molecuulgewicht normen geven aan dat de proteasen van belang binnen de peptide oplossen van gel laag zijn (die heeft een zichtbare oranje kleur).
    Opmerking: De meeste MMP en hun varianten vallen binnen het bereik van 35-100 kDa. Wanneer de molecuulgewicht normen aangeven dat deze gewichten zijn binnen de peptide oplossen van gel laag, kan elektroforese worden gestopt. Hetzelfde principe kan worden toegepast op andere soorten proteasen met bekend molecuulgewicht. Als er belangstelling voor het opsporen van meerdere proteasen over een grotere reeks molecuulgewichten, verminderen van de grootte van het oplossen gel laag en het vergroten van de peptide oplossen gel laag.
  3. Na elektroforese, verwijder de gels uit de plastic cassette en wassen gels driemaal voor elke 10 min bij kamertemperatuur onder zachte agitatie in waterlopen buffer met 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl2en 5 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.
  4. Gels voor overdracht aan een derde Bufferoplossing met 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl2 en 5 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 voor 15 min. vervangen met de ontwikkeling van de verse buffer oplossing en incubeer gels bij 37 ° C onder zachte agitatie voor 24 uur , om ervoor te zorgen de gels zijn volledig onderdompelen in de oplossing.

7. beeldvorming van Peptide Zymography Gels

  1. Na 24 uur gel afbeelding gels met behulp van een TL scanner/imager met behulp van de geschikte filters voor excitatie en emissie. Bijvoorbeeld, de peptide gels in de representatieve resultaten weergegeven zijn geconjugeerd met fluoresceïne en werden beeld met behulp van een filter van de excitatie van 488 nm en een filter van de emissie van 521 nm. Met behulp van de juiste filters voor uw fluorophore zal het maximaliseren van de opsporing van proteolytic activiteit.
    Opmerking: Afbeeldingen kunnen ook worden genomen met een gel imager uitgerust met een UV-transilluminator, vaak gebruikt voor de beeldvorming van DNA gels gekleurd met ethidiumbromide. Afbeelding van de gels met behulp van de UV-transilluminator (365 nm) instelling en een filter van de emissie van 590 nm.
  2. Densitometric evaluatie van intensiteiten van de band met behulp van ImageJ zoals elders beschreven13uit te voeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Met behulp van de methode beschreven hier, twee fluorescerende protease-afbreekbaar peptiden werden ingelijfd bij polyacrylamide gels: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (afgekort als QGIW in de gehele tekst en cijfers) en GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (afgekort als LACW in de gehele tekst en cijfers). ↓ geeft aan de site van decollete. QGIW is een collageen-ik afgeleid reeks ontworpen voor het opsporen van cellulaire collagenases14. LACW is een reeks die is geoptimaliseerd voor de detectie van MMP-14 en MMP-11-15. De peptiden zijn gelabeld met dabcyl (quencher) en fluoresceïne (fluorophore) met behulp van N-hydroxysuccinimide (NHS) - ester - amine chemie11. Het kan moeilijk zijn om het ontwikkelen van nieuwe fluorogenic peptiden die voldoende fluorescentie blussen en zijn oplosbaar in standaard buffers. Aanpassing van de peptide reeksen van commercieel verkrijgbare tl protease substraten op te nemen van een C terminal cysteïne is daarom vaak een succesvolle strategie voor de ontwikkeling van nieuwe fluorogenic sensoren. Om aan te tonen van het vermogen van peptide zymography te scheiden van mengsels van complexe protease, werd geconditioneerde media bijeengezocht uit twee verschillende kanker cellijnen. HT1080 fibrosarcoma cellen en MDA-MB-231 borst adenocarcinoom cellen werden verguld in 10% FBS media voor 24 uur, waarna de media werd vervangen door serumvrij media voor een aanvullende 24 uur. Geconditioneerde media monsters werden verzameld en geconcentreerd met behulp van 10 kDa molecuulgewicht cutoff centrifugaal filter eenheden. Het eiwitgehalte van de media werd gemeten met behulp van een standaard µBCA assay. 30 µg eiwit uit geconditioneerde media waren electrophoresed. Als positieve controle, wells met type ik bacteriële collagenase (100 µg) of gezuiverd, geactiveerd van MMP-9 (125 ng) werden ook opgenomen. De gels werden geïncubeerd gedurende 24 uur in de ontwikkeling van de buffer toe MMP splitsing van de afbreekbaar substraten binnen de gels (Figuur 2) en vervolgens beeld. Fluorescerende imaging bleek dat talloze bands waren zichtbaar binnen de LACW peptide gels (figuur 2A14), terwijl slechts een enkele band bleek binnen QGIW gels (figuur 2D14). In vergelijking met gelatine zymography (Figuur 2 g14) waren LACW gels kundig voor speurder meer Proteolytische bands, het vermogen van peptide zymography om het detecteren van een breder scala van proteasen aanwezig in biologische monsters dan demonstreren traditionele methoden met behulp van inheemse substraten.

Om te controleren de identiteit van de gevisualiseerde bands als MMP, peptide zymography gels werden geïncubeerd in ontwikkeling buffer ofwel 20 µM met GM6001, een breedspectrum MMP-inhibitor, of 10 µM E-64, een algemene cathepsin-remmer. Behandeling van de LACW peptide gels met GM6001 (figuur 2B14) daalde de intensiteit van de bands, terwijl behandeling met E-64 (figuur 2C14) had geen waarneembaar effect. Behandeling van de QGIW peptide gels met GM6001 resulteerde in volledige ablatie van de eerder weergegeven bands (2E figuur14). Zoals verwacht, had E-64 geen enkel effect (figuur 2F14). In beide peptide gels, GM6001 geremd gezuiverd MMP-9 activiteit maar heeft geen invloed op bacteriële collagenase activiteit, verder controleren dat de gevisualiseerde verhoging van fluorescentie een gevolg van proteolytic activiteit door MMP aanwezig in de geteste biologische was monsters.

Om te vergelijken van de gevoeligheid van peptide zymography naar de huidige gouden standaard, gelatine zymography, was een gevoeligheidsanalyse uitgevoerd met gebruikmaking van gezuiverde, geactiveerd MMP-9. Seriële verdunningen van MMP-9 (1-250 ng) werden electrophoresed in LACW, QGIW en gelatine zymography gels (figuur 3A14). Na ontwikkeling en fluorescerende beeldvorming, intensiteiten van de band werden gekwantificeerd met ImageJ en percelen van genormaliseerde band intensiteit werden geproduceerd om te bereken EG50 waarden-de concentratie die 50% van het maximale signaal (figuur 3B produceert 14). LACW peptide gels waren bekwaam om te ontdekken de kleinste concentraties van MMP-9, met een waarde50 EG van 17.28 ng, in vergelijking met QGIW en gelatine zymograms met waarden van 59,50 ng en 31.85 ng, respectievelijk. Deze gegevens wijzen erop dat het gebruik van peptide zymography kan overeenkomen met of de grenzen van de gevoeligheid van inheemse substraten zoals gelatine overschrijden.

Figure 1
Figuur 1: schematische van het fluorescerende peptide zymography proces. (A) voorbereiding van de multi-layer polyacrylamide oplossen van gel. Een standaard 10% oplossing van gel oplossing wordt gebruikt voor het vormen van de eerste laag van de peptide zymography gel. Een tweede oplossing van 10% gel laag met een gehard, fluorescerend peptide en een azido-PEG3-maleimide linker molecuul is vervolgens polymeervorm op de top van de eerste laag. De definitieve toplaag is een stapelvolgorde gel van 5%. (B) standaard elektroforese onder niet-reducerende voorwaarden wordt gebruikt voor het scheiden van protease-bevattende monsters in de functionalized polyacrylamide gels. De gels zijn gewassen te verwijderen van SDS en de eiwitten om te renature. De gels worden vervolgens geïncubeerd in een buffer ontwikkeling gedurende 24 uur bij 37 ° C, waardoor de proteasen te klieven van de fluorogenic peptiden, wat resulteert in verhoogde fluorescentie. Deze fluorescentie, overeenkomend met protease-activiteit, is vervolgens gevangen met behulp van een fluorescerende gel imager op een excitatie van 488 nm en uitstoot van 521 nm (aangepast met toestemming van Biotechniques en toekomst wetenschap14). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: detectie van cel-uitgescheiden proteasen in menselijke kanker cellijnen. Analyse van collagenase enzym (100 µg), MMP-9 (125 ng) en geconditioneerde cel media van HT1080 fibrosarcoma (30 µg) en MDA-MB-231 adenocarcinoom borst kanker (30 µg) cellijnen in LACW en QGIW peptide gels. Gels werden behandeld met DMSO (voertuig control) (A & D), behandeld met GM6001 (B & E) of behandeld met E-64 (C & F). (G) gelatine zymogram van HT1080 en MDA-MB-231 geconditioneerd cel media (aangepast met toestemming van Biotechniques en toekomst wetenschap14). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: vergelijking van MMP-9 gevoeligheid van Peptide en gelatine Zymograms. (A) QGIW (boven), LACW (midden) en gelatine (onder) zymography gels werden onderworpen aan seriële verdunningen van MMP-9. (B) Normalized band intensiteiten werden uitgezet tegen de concentratie van de MMP-9 en passen bij een vier parameter variabele helling curve. EG50 waarden duiden op concentratie op de helft van het maximale signaal. Resultaten worden weergegeven als n = 3, SD (aangepast met toestemming van Biotechniques en toekomst wetenschap14) betekenen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Oplossen van Gel
Voorraad Conc. Definitieve Conc. 5 gels 10 gels
Acrylamide/Bis-Acrylamide (19:1) 40% 10% 10 mL 20 mL
Tris-HCl pH 8,7 1 M 0.375 M 15 mL 30 mL
Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) 20% 0,10% 200 ΜL 400 ΜL
Gedeïoniseerd H2O -- -- 14,4 mL 28.7 mL
TEMED -- -- 40 ΜL 80 ΜL
APS 10% 0,10% 400 ΜL 800 ΜL
Totaal Volume 40 mL 80 mL
Peptide oplossen Gel
Voorraad Conc. Definitieve Conc. 5 gels 10 gels
Acrylamide/Bis-Acrylamide (19:1) 40% 10% 5 mL 10 mL
Tris-HCl pH 8,7 1 M 0.375 M 7,5 mL 15 mL
Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) 20% 0,10% 100 ΜL 200 ΜL
Gedeïoniseerd H2O -- -- 6.5 ΜL 13 mL
Fluorescerende Peptide 10 mM 75 ΜM 150 ΜL 300 ΜL
Azido-PEG3-Maleimide CrossLinker 75 mM 1,5 mM 400 ΜL 800 ΜL
TEMED -- -- 20 ΜL 40 uL
APS 10 0,10% 200 ΜL 400 ΜL
Totaal Volume 20 mL 40 mL
Stapelen van Gel
Voorraad Conc. Definitieve Conc. 5 gels 10 gels
Acrylamide/Bis-Acrylamide (19:1) 40% 5% 2,5 mL 5 mL
Tris-HCl pH 6,9 1 M 0,125 M 2,5 mL 5 mL
Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) 20% 0,10% 100 ΜL 200 ΜL
Gedeïoniseerd H2O -- -- 14,75 mL 29,5 mL
TEMED -- -- 50 ΜL 100 ΜL
APS 10% 0,10% 100 ΜL 200 ΜL
Totaal Volume 20 mL 40 mL

Tabel 1: reagens tabel voor het voorbereiden van fluorescerende peptide zymography gels. Concentraties en volumes voor de bereiding van de multi-layer peptide zymography gel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Huidige zymographic technieken, is afhankelijk van de opneming van een native substraten in polyacrylamide gels voor de detectie van proteolyse. Terwijl deze technieken hebt opgeslaen wijdverbreide gebruik, zijn ze nog steeds beperkt in het aantal proteasen die ze kunnen detecteren. Hier werd een protocol beschreven in welke TL, protease-afbreekbaar peptiden zijn opgenomen in de polyacrylamide oplossen van gel. Covalente koppelen met behulp van een azido-PEG3-maleimide linker molecuul in staat stelt de scheiding en opsporing van een breder scala aan proteasen dan is op dit moment haalbaar met inheemse substraten. De zeer afstembare aard van fluorescerende peptiden biedt onderzoekers de mogelijkheid om ontwerpen van substraten die zijn op hun proteasen van belang gericht kunnen. Talrijke peptide substraten zijn vastgesteld voor een breed scala aan proteasen peptide bibliotheken gebruiken, en er is een groeiend aantal commerciële bronnen productie aangepaste peptiden. Het kan moeilijk zijn om het ontwikkelen van nieuwe fluorogenic peptiden die voldoende fluorescentie blussen en zijn oplosbaar in standaard buffers. Aanpassing van peptide reeksen van commercieel beschikbare fluorescerende protease substraten op te nemen van een C-terminal cysteïne is daarom vaak een succesvolle strategie voor de ontwikkeling van nieuwe fluorogenic sensoren.

Tijdens het uitvoeren van dit protocol, moet worden gezorgd tijdens het verwerken van fluorescerende peptide gels ter voorkoming van overmatige blootstelling aan licht, zoals dit het gedetecteerde fluorescent signaal behoorlijk kan aantasten. Daarnaast is de huidige concentratie van peptide gebruikt in elke gel 75 µM. Dit kan worden aangepast naar lagere concentraties voor de instandhouding van peptide, houdend in mening dat de oplossing van de azido-PEG3-maleimide moet worden toegevoegd aan de oplossing in minimaal 20 molar overtollige naar de peptide. De azido-PEG3-maleimide-kit kan worden gekocht in 3 maten (25, 100 en 1000 mg). De auteurs raden de 25 mg kit zoals de bereide oplossing kan alleen worden opgeslagen in korte perioden bij-20 ° C. Een 25 mg kit is bovendien voldoende te bereiden 10 peptide gels, die moeten worden gebruikt binnen 3 weken van voorbereiding.

Een van de beperkingen van zymography is de moeilijkheid om de exacte identiteit van gevisualiseerde protease bands als gevolg van aanzienlijke overlap in molecuulgewicht comforthotel. In de toekomst studies, het zal van doorslaggevend belang secundaire analyse om te bepalen hun identiteit met behulp van technieken zoals massaspectrometrie16,17uit te voeren. Een andere beperking van zymography is het uiteinde van eiwitten tot hun actieve conformatie na gedeeltelijke denaturering door SDS en electroforese. Deze processen kunnen veroorzaken een verandering in de actieve conformatie van de protease, proteolytically inactieve eiwitten, actieve renderen. Bijvoorbeeld, pro-MMP-2 kan worden opgespoord in gelatine zymograms ondanks het feit dat de remmende Pro-domein intact due aan haar renaturatie naar een intermediair actief formulier. Aanvullende methoden zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of Western vlekken kan worden gebruikt voor het bepalen van de identiteit en de totale aanwezigheid van een protease van belang.

Dit artikel demonstreert het gebruik van fluorescerend peptide substraten voor het verbeteren van de gevoeligheid van de huidige zymographic technieken. Met behulp van gezuiverde MMP-9, een analyse van de gradiënt van de concentratie plaatsgevonden vergelijken van LACW, QGIW en gelatine zymography gels. Momenteel, gelatine-zymography is de techniek van de goudstandaard waaraan de gelatinases (MMP-2 en -9) worden gedetecteerd in biologische monsters. Vergelijking van de EG50 waarden van de drie substraten, had LACW peptide gels de laagste waarden, die de hoogste gevoeligheid aangeeft. Met behulp van verschillende peptide reeksen ontworpen voor de detectie van specifieke proteasen kan deze gevoeligheden nog verder verbeteren. Behandeling van de gels met een agent MMP activeren zoals 4-aminophenylmercuric-acetaat (APMA) of heparine kan ook worden gebruikt om te stimuleren een zwak signaal als eerder beschreven18.

Naast het meten van protease-activiteiten voor biologische studies, worden protease-afbreekbaar peptiden ook vaak gebruikt voor de synthetische hydrogels crosslinking voor weefsel engineering en drug delivery-toepassingen. Gecontroleerde afbraak is essentieel voor deze toepassingen. Op dit moment de afbraakkinetiek van deze peptides worden gekenmerkt met behulp van enkele, gezuiverde enzymen. Echter, bepalen welke enzymen cellen eigenlijk produceren en zijn verantwoordelijk voor de splitsing van deze peptiden moeilijk geweest om te bepalen. Het gebruik van peptide zymography te kwantificeren van cellen en weefsel-specifieke enzym release zal sterk steun in het rationele ontwerp van deze peptide crosslinking sequenties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Financiering verstrekt door The Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering afdeling en de uitgebreide Cancer Center - Arthur G. James kanker ziekenhuis en Richard J. Solove Research Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes ThermoFisher Scientific NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs ThermoFisher Scientific NC3510
1x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
20% SDS Solution Ambion AM9820
3x Zymography Sample Buffer Bio-Rad 1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) Ambion AM9022
6 Well Tissue Culture Plates ThermoFisher Scientific 087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) Sigma-Aldrich UFC201024
Ammounium Persulfate Sigma-Aldrich A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit Click Chemistry Tools AZ107
Calcium Chloride ThermoFisher Scientific BP510100
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231
Isopropanol Fisher Scientific A416P
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826
Round Bottom Flask (100 mL) Fisher Scientific 50-873-144
Septum Rubber Stopper Fisher Scientific 50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) Fisher Scientific 14-823-434
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trizma hydrochlroide Sigma-Aldrich T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager GE Amersham 8149-30-9410
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10, (3), 211-220 (2013).
  2. Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
  3. Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102, (1), 196-202 (1980).
  4. Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255, (2), 211-216 (1998).
  5. Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63, (4), 174-180 (2017).
  6. Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. 43-52 (2017).
  7. van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38, (1), 73-83 (2005).
  8. Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
  9. Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64, (5), 203-210 (2018).
  10. Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28, (6), 1172-1173 (2000).
  11. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34, (30), 7344-7352 (2013).
  12. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (17), 5366-5371 (2015).
  13. Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
  14. Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40, (4), 399-416 (1996).
  15. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273, (5), 2763-2768 (1998).
  16. Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375, (2), 382-384 (2008).
  17. Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3, (7), 810-820 (2009).
  18. Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293, (1), 38-42 (2001).
Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).More

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter