Summary
介绍了从自动微生物反应器的收获细胞培养液(HCCF)中分离和后续分析的单克隆抗体的详细方案。还介绍了使用分析来确定关键质量属性 (CQA) 和最大化有限样本量以提取重要信息。
Abstract
单克隆抗体(mAbs)是当今生产的最受欢迎和最具特征的生物产品之一。最常用的使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,培养和工艺条件必须优化,以最大限度地提高抗体定位剂,并实现目标质量配置文件。通常,此优化使用自动微尺度生物反应器 (15 mL) 并行筛选多个工艺条件。优化标准包括培养性能和单克隆抗体(mAb)产品的关键质量属性(CQA),这可能会影响其有效性和安全性。培养性能指标包括细胞生长和营养消耗,而CQA包括mAb的N-糖基化和聚合谱、电荷变异和分子量。此详细协议描述了如何纯化并随后分析由自动化微生物反应器系统生成的 HCCF 样品,以获得宝贵的性能指标和输出。首先,采用自动蛋白快速蛋白液相色谱(FPLC)方法从收获的细胞培养样品中纯化mAb。浓缩后,使用特定平台通过质谱法分析甘油轮廓(参见材料表)。抗体分子量和聚合谱使用尺寸排除色谱-多角度光散射(SEC-MALS)确定,而电荷变型则使用微芯片毛细管区电泳(mCZE)进行分析。除了在生物反应器过程中捕获的培养性能指标(即培养活力、细胞计数和常见的代谢物(包括谷氨胺、葡萄糖、乳酸和氨)外,还分析废培养基,以确定将营养物质限制在改进进给策略和整体工艺设计。因此,还介绍了通过废介质的液相色谱-质谱法(LC-MS)对氨基酸进行绝对定量的详细方案。该协议中使用的方法利用了与大量小容量样本兼容的高吞吐量平台。
Introduction
蛋白质疗法正被用来治疗越来越多的医疗条件,包括组织移植并发症,自身免疫性疾病和癌症1。自 2004 年以来,美国食品和药物管理局 (USFDA) 记录的生物许可申请 (BLA) 中,药物评估和研究中心 (CDER) 监管的所有审批中的比例不断增加,其中 BLA 占 25% 以上2014年和2015年2.
考虑到这一不断扩大的市场,生物制药制造商面临着快速提供更多具有一致质量的产品的挑战。提高产品产量的努力集中在CHO细胞工程和生产线筛选上,尽管最显著的改进是由于介质/饲料策略优化和细胞培养环境控制的进步1,3,4,5在制造过程中。
由于mAbs是在生物系统中产生的,因此可能有固有的蛋白质变异性。抗体成分可以在翻译后改变,如糖基化或受降解或酶反应的影响。这些结构变异可能引起危险的免疫反应或改变抗体结合,这反过来又可以减少或消除预期的治疗功能5。因此,单克隆抗体的关键质量属性 (CQA) - N-甘油轮廓、电荷变异分布和单体形式的抗体百分比 - 在制造工艺1,6.在受监管的生产环境中,治疗蛋白必须符合验收标准才能被许可为经批准的商业药品7。本文介绍的方法通常是抗体7、8的质量表征过程的一部分,任何蛋白质科学家都会熟悉它们的用法。
在前期工作9中,介绍了微生物反应器在上游生物处理中用于高通量细胞培养条件筛选的应用和运行。从不同介质条件获得的纯化产物使用LC-MS进行N-甘油分析。各种甘油物种的存在与生物过程参数有关,如饲料策略、pH和温度12。不同的介质条件对产品质量的影响,以单体形式的IgG百分比表示,也通过尺寸排除色谱-多角度光散射(SEC-MALS)13、14进行评价,15.电荷变型配置文件表示一些可能影响产品功能的修改16。微毛细管区电泳 (mCZE) 是一种技术,与传统阳离子交换 (CEX) 色谱和毛细等电对焦 (cIEF) 方法相比,可提供更快的分析时间17 ,18.对废生物反应器介质进行了分析,以跟踪蛋白质生产过程中的氨基酸消耗,因为它与抗体识别属性的变化有关19、20、21、22 ,23.
蛋白质分析使我们能够根据工艺输入和CQA变化之间的关系来识别关键工艺参数(CPP)。在生物工艺开发过程中,识别和测量 CPP 从根本上证明了过程控制,并确保产品没有变化,这在高度规范的制造环境中至关重要。本文介绍了一些与产品CQA最相关的蛋白质的生化特性(N-甘油轮廓、电荷变型和大小均质)的分析技术。
Protocol
1. 抗体的纯化
注:内部抗体的平衡缓冲液为25 mM Tris,100 mM NaCl,pH 7.5。使用的洗脱缓冲液为0.1M醋酸。缓冲液和树脂(蛋白A)取决于纯化的特定抗体。柱体积相当于树脂的床高。使用的移动相位量根据列数确定。
- 初始化纯化系统
- 打开连接到净化系统的软件。使用手动说明,以 2 mL/min 的流速将列与平衡缓冲液平衡 40 分钟。
- 在分数收集器中,放置15 mL锥形管以收集纯化抗体洗脱液和50 mL锥形管,以收集高盐洗涤过程中的流通。通过在开始运行之前打开和关闭分数收集器,确保分数收集器重置为起始位置。分数收集器保持在 7°C。
注: 对于 15 mL 和 50 mL 管,可以在"设置"中的"分数收集器"选项卡下手动重置分数收集器。
- 样品注射
注:在以下过程中使用的收获细胞培养液是从在自动微生物反应器9中培养的中国仓鼠卵巢细胞中获得的。- 将 0.22 μm 过滤的收获细胞培养液添加到一个空的 12 mL 注射器中,其喷嘴端被盖住。
- 按住喷嘴朝下的注射器,插入注射器柱塞,直到柱塞的一小部分插入。确保液体没有泄漏,将喷嘴朝上转动注射器并取下盖子。
- 仍握住喷嘴朝上,推动气缸以驱散任何空气,直到细胞培养液位于喷嘴尖端。将注射器喷嘴插入净化系统上的手动注射口,然后拧紧。
- 向下推柱塞,直到注入所有样品,并在连接的 10 mL 大体积样品回路中可见。
- 打开保存的方法文件。将结果文件保存在所需位置,并在出现提示时指定文件名。将示例注入大体积样本循环后,命中运行。
- 运行纯化方法
- 选择保存的方法,并在仪器软件提示时单击运行(步骤 1.2.5)。
注: 系统设置为运行以下步骤。在仪器运行时,用户无需执行任何操作。 - 以 2 mL/min 的流速平衡三列卷 (CV) 的柱。一旦柱被平衡,系统将使用大体积样品循环,以1 mL/min的流速将样品注入到柱上。
- 280 nm 处的 UV 信号下降表示样品已完成加载。以 2 mL/min 的流速用平衡缓冲液清洗柱,直到 UV 信号降至 25 mAU 以下。
- 使用四台 25 mM Tris 的 CV,在 pH 7.5 下使用 1 M NaCl,以 2 mL/min 的流速进行二次高盐洗涤。系统分数收集器将收集在 50 mL 管中洗盐过程中从柱上脱落的任何蛋白质/DNA。
- 以 1 mL/min 的流速应用五个洗脱缓冲液的 CV,使抗体从柱上渗出。根据紫外线信号在15 mL管中收集渗脂液;当UV 280信号高于35 mAU时,收集开始;当信号下降到 50 mAU 以下时,收集结束;这称为峰值切割。
注:峰值切割确保洗脱型的规范化,并避免可能含有蛋白质聚集体24的洗脱峰值尾矿。 - 使用三个平衡缓冲液的 CV 清洗列。洗涤步骤后,运行结束。
- 洗脱后立即使用1M Tris碱基将纯化蛋白中和至pH£5.5。使用 280 nm 和 260 nm 的微体积 UV-Vis 分光光度计测量蛋白质浓度,并在 4°C 下储存。
- 使用离心装置浓缩纯化抗体(步骤 2)。然后使用LC-MS对纯化抗体进行甘油分析,并使用SEC-MALS(步骤3和4)进行聚合配置文件分析。
注:未经进一步缓冲液交换,不应冻结纯化抗体,因为频繁的冻融循环可能导致聚集和沉淀。
- 选择保存的方法,并在仪器软件提示时单击运行(步骤 1.2.5)。
2. 纯化抗体浓度
注: 三酸乙酯缓冲液为 0.1M 醋酸中和,1 M Tris 碱基至 pH £5.5。
- 将 100 kDa 过滤器插入离心管。
- 用 500 μL 的双蒸馏水清洗过滤器。在室温 (RT) 下,在 14,000 x g下离心 10 分钟。重复此步骤两次。丢弃滤液。
- 将冲洗过的过滤器转移到新鲜的离心管中,并将 500 μL 的样品添加到每个过滤器中。在14,000 x g下离心10分钟。
- 将滤镜倒置到新鲜的旋转管中。在1,000 x g下离心2分钟,以收集浓缩样品。
- 使用 UV-Vis 分光光度计确定样品浓度。使用三酸三酯缓冲液将分光光度计空白。在 280 nm 时使用 1.37 mL +(mg=cm)-1的蛋白质消光系数,用于 1% (%m/v) IgG 溶液。
- 使用浓缩样品制备 12.5 μL 的 2 mg/mL 工作溶液,用于甘油分析,30 μL 的 3.5 mg/mL 工作溶液用于 SEC-MALS。
注: 可以在此处暂停该协议。样品应在4°C下冷藏。在2mg/mL浓度下,这些样品在4°C下至少稳定3个月,而较高的浓度可能会沉淀。
3. 使用质谱分析N-甘油分析
- N-甘油标签和隔离
- 从抗体浓度2mg/mL在适当的缓冲液中开始,如中性磷酸钠、柠酸盐或HEPES缓冲液。以 2 mg/mL 的 2 mg/mL 制备完整的 mAb 标准(如 NIST mAb),与实验样品一起处理,作为阳性对照。
注:抗体应处于最终缓冲液中,不含SDS和小于0.1 mM的核亲基(如Tris、DTT、甘氨酸或组织蛋白)。必须删除示例缓冲区中的 SDS。如果核嗜血者位于缓冲液中,则将其稀释或执行缓冲液交换,因为它们会干扰试剂盒。一般协议随甘甘试剂盒一起提供。 - 在试剂盒提供的1 mL管中,用15.3 μL的LC-MS级水稀释7.5μL的抗体,然后用6μL的5%溶液在90°C下使用酶友好型和MS友好型表面活性剂进行变性3分钟。
- 将样品冷却 3 分钟至室温 (RT)。然后,加入1.2μL的PNGaseF,在50°C下孵育5分钟。
- 冷却 3 分钟到 RT 后,通过加入溶解在非水二甲基甲酰胺 (DMF) 中的 12 μL 荧光标记试剂,标记切碎的 N-甘油,并等待 5 分钟,用 358 μL 的醋酸酯 (ACN) 稀释标记的 N-甘油混合物。
- 将亲水相互作用色谱 (HILIC) 板放入带有垫片和废物托盘的真空歧管中。对大量样品使用多通道移液器。
- 用200 μL的水为井部提供调节,其中真空经过,这样液体需要15-30s才能通过HILIC树脂。在装入 ACN 稀释的标记甘油混合物 (400 μL) 之前,与 200 μL 的 85% ACN 进行平衡,在将每种新液体添加到井中后应用真空。用 600 μL 的 1% 甲酸 (FA)/90% ACN 两次清洗树脂。
- 用 600 μL 收集管更换废纸盒。将带有 SPE 洗脱缓冲液(3 次洗脱,每个 30 μL)的标记 N-甘油放入收集管中。用310 μL的DMF/ACN样品稀释剂稀释池的洗脱液。将样品移入自动取样瓶中,以便进行荧光 (FLR)-MS 分析。
注:这些样品在-80°C下储存至少1个月时稳定。将 HILIC 板存放在其原始包装中,贴上关闭胶带,并放在干燥器内,以便将来使用。
- 从抗体浓度2mg/mL在适当的缓冲液中开始,如中性磷酸钠、柠酸盐或HEPES缓冲液。以 2 mg/mL 的 2 mg/mL 制备完整的 mAb 标准(如 NIST mAb),与实验样品一起处理,作为阳性对照。
- 标记N-甘油的LC-MS分析
- 在与荧光检测器和四极极飞行时间 (Q-ToF) 质谱仪耦合的超高性能液相色谱 (UPLC) 系统上分析标记的 N-甘油洗脱样品。在分离过程中,使用经批准的用于标记甘油的色谱分离和热量至 60°C 的列。
注: 使用前必须用 60% 的醋酸酯和 40% H2O 冲洗该列:首次使用前为 50 份 CV,如果之前已使用该列,则必须冲洗 20 个 CV。- 使用 50 mM 铵甲酸铵 (AmF)(用移动相浓缩物制成)和 100% LC-MS 级 ACN 用于移动相。AmF 对 pH 变化敏感,混合后可使用 1 个月。将初始流速设置为 0.4 mL/min,LC 梯度在洗脱阶段提供增加的 AmF。
- 将FLR探测器设置为在EX 265/EM 425 nm处测量,采样率为2赫兹。将Q-ToF设置为MS1正电敏度模式,质量范围为100-2,000道尔顿(Da),扫描时间为0.25秒,连续数据采集。在"请勿应用校正"模式下,使用亮氨酸环脂素(2 纳克/μL,在 50% ACN/0.1% FA 中)作为内部质量参考。
注: 内部质量参考校正将在稍后数据处理期间应用。 - 在 22.5 μL 的 H2O、25 μL DMF 和 52.5 μL ACN 中按顺序重新悬浮 dextran 阶梯。准备 10 μL 等分在 -80°C 下存储,因为梯子在较高温度(室温 4 °C)下不稳定超过 24 小时。dextran 梯子在多个冻结-解冻循环后降解。
- 将样品置于自动采样器设置为 10°C。随样品一起加载一小瓶 dextran 梯子,因为梯子的保留时间信息将用于分配,而用于验证标识的质量信息。对样品使用 10 μL 注射,为梯子使用 7.5 μL 注射。将样品注入三联。运行加载的方法。
- 在与荧光检测器和四极极飞行时间 (Q-ToF) 质谱仪耦合的超高性能液相色谱 (UPLC) 系统上分析标记的 N-甘油洗脱样品。在分离过程中,使用经批准的用于标记甘油的色谱分离和热量至 60°C 的列。
- 用于 LC-MS 数据的 N-甘油标识
- 使用针对亲水相互作用色谱学(荧光质谱)数据优化的程序执行数据处理。
- 在程序中应用内部质量参考修正。在示例信息中指定 dextran 梯形喷射为"标准"。在分析方法中,将分离化合物的保留时间设置为运行过程中检测到的梯形化合物的保留时间。
- 为确保为已识别的甘油返回区域百分比,请修改分析方法:在"处理"选项卡下,单击"量化设置- 校准"并将"校准曲线拟合类型"设置为"相对响应 (%)"。
4. 使用SEC-MALS分析抗体聚集
- 样品制备
- 将 3.5 mg/mL(步骤 2)稀释的蛋白质转移到小瓶中,并插入 150 μL 玻璃嵌件。使用凝胶加载尖端将吸管移入刀片的底部钟中,以避免气泡的引入。
- 用塞帕盖盖住小瓶,并立即进行分析。如果稍后分析,则储存在 4°C。
- SEC-MALS 配置和平衡
注:在 SEC-MALS 上分析聚合,配置使用由 MALS 软件控制的 MALS 探测器和折射率检测器的超高压液相色谱 (UHPLC)。- 在UHPLC软件中配置一个方法文件来控制UHPLC系统,将流速设置为0.4 mL/min,移动相为1x磷酸盐缓冲盐碱(PBS),注射体积为5μL,柱温为25°C和二极管阵列检测器 (DAD) 以监控 280 nm。将运行时间设置为 20 分钟。
- UHPLC 和多角度光散射 - 折射率 (MALS-RI) 探测器之间的接口要求在 DAD 上使用模拟输出。在 DAD 方法文件中将 DAD 衰减设置为 1,000 mAU,将 AU/UV 设置为 1 (UV仪器>通道>通道 1)。
- 在开始分析前 30 分钟打开 DAD 灯,并将波长设置为 280 nm。同时,清除折射指数 (RI) 参考单元格 15 分钟或直到基线稳定,然后关闭参考单元格。
- 配置 SEC-MALS 软件序列,将收集时间设置为 12 分钟,将注射体积设置为 5 μL,将 dn/DC 设置为 0.185 mL/g,如果以前经实验确定,则 A280 消光系数或设置为 1.37 mL=(mg_cm)-1,以及样品。单击"运行"并等待屏幕上出现"等待注入"对话框。
注:A280消光系数是感兴趣的蛋白质所特有的,应通过实验确定。 - 以与 MALS-RI 软件相同的顺序在 UHPLC 软件中配置示例列表并提交。
注意: 在运行之前和之后运行系统适用性检查非常重要。牛血清白蛋白通常用于检查峰值扩大,表明 SEC 列可能需要清洁或更换。相同的 BSA 标准喷射可用于指定信号对齐、峰值扩宽和检测器规范化。
-
使用 MALS 软件进行聚合分析
- 单击标记为"过程"的选项卡。指定所需的最小分闸级别;没有通常就足够了。
- 验证基线是否已正确绘制,并在必要时调整 LS1、LS2、LS3、RI 和 UV 通道。设置感兴趣的峰值区域。
- 查看分子质量分布,确认被调用的峰值包含大小相似的颗粒。
5. 电荷变型分析
- 样品制备和标签
- 从 3.5 mg/mL 抗体溶液的 80 μL 开始。使用 0.5 mL 脱盐柱 (7k MWCO) 对样品进行脱盐。先从底部塞扣上,然后松开顶部塞子,并将其放入 1.7 mL 微离心机管中,从而准备柱子。在 1,500 x g下将脱盐柱离心 1 分钟。
注:用点标记列的外部,以便可以将其放置在后续步骤的原始方向中。 - 将柱转移到新的微型离心机管中。将80μL的稀释蛋白添加到柱的顶部。将列与原始方向对齐。在1,500 x g下离心2分钟。从离心机中取出样品,丢弃脱盐柱并混合好样品。
注: 仅当样品基质含有原胺、会干扰样品电泳的赋形剂或其他不相容物质时,才需要脱盐。 - 在25μL的体积内将样品稀释至2mg/mL的最终浓度,并在96孔板中加入5μL的标签缓冲液(参见材料表:电荷变异试剂套件)。通过稀释必要量的标记试剂(参见材料表:电荷变异试剂盒)1:30 在二甲基甲酰胺中制备标签试剂。在室温下,在远离光线的地方孵育样品10分钟。
注意:解冻后立即使用此试剂,并在与 DMF 混合后的 10 分钟内使用,这一点很重要。 - 孵育后,加入60μL的试剂级水,通过移液混合。用板密封盖住板,并在 1,000 x g下心板 1 分钟。
- 从 3.5 mg/mL 抗体溶液的 80 μL 开始。使用 0.5 mL 脱盐柱 (7k MWCO) 对样品进行脱盐。先从底部塞扣上,然后松开顶部塞子,并将其放入 1.7 mL 微离心机管中,从而准备柱子。在 1,500 x g下将脱盐柱离心 1 分钟。
- 准备电荷变型芯片
- 通过去除存储溶液和用水清洗井 1、3、4、7、8 和 10 来准备充电变型芯片。然后用pH 7.2运行缓冲液更换水(参见材料表:电荷变体试剂套件)。
- 将 750 μL 的 pH 7.2 运行缓冲液添加到缓冲管中,并将缓冲管放在样品托盘左上角的指定位置。现在,从 96 孔板中取出板密封,按仪器用户界面上的卸载板,然后将板插入 GXII 样品托盘中。
注: pH 7.2 缓冲区用于此分析。pH 5.6-7.2 缓冲液可根据蛋白质 pI 使用。使用较低的 pH 缓冲时,可能需要更长的采样运行时间。 - 按用户界面上的"卸载芯片"按钮。确保电极不含任何颗粒,如果没有,请使用无绒拭子清洁。插入芯片时,请确保芯片中心的窗口没有颗粒或污迹。如有必要,用无绒软布清洁。
注:使用毛细管电泳芯片时,通过真空吸气去除缓冲液,然后立即添加下一个溶液,以防止油井干涸。为了尽量减少气泡的引入,请采用反向移液技术。处理芯片时,请注意从芯片底部延伸的易碎毛细管,确保它不会干涸,也不会突破粗糙的搬运。 - 将盖子合上芯片室并选择HT 蛋白电荷变异测定。单击"运行"按钮。按照提示选择样品井、板类型、测定时间(68、90 或 100 s)和文件名。单击提示末尾的"开始"。
- 芯片清理需要用清水清洗每口井2次,然后添加存储缓冲液(参见材料表:电荷变体试剂套件)。进入存储缓冲液后,更换仪器中的芯片,并在提示时选择HT蛋白电荷测定。在主屏幕上选择用户界面上的"洗涤"。完成后,取出芯片,用水和无绒拭子擦拭电极,并将芯片储存在 4°C。
- 电荷变型分析
- 打开仪器分析软件。通过访问File>导入数据文件来导入运行...并单击所需的 *.gxd 文件。只有名称将转移到软件,所以重命名井是有利的 (工具 > 示例名称编辑器)。选择要导出的文件,在选择文件时按住 Shift。单击"文件">导出...然后选择"原始数据"框,然后选择AIA 格式框。
- 在分析软件中打开"浏览项目"选项卡。单击"数据库>导入数据..."并选择导出的 *。CDF 文件。
- 导入后,导航到"注入"选项卡,选择要分析的文件,右键单击并转到"处理"...在弹出的窗口中,选中"处理"旁边的复选框,并从下拉框中选择"使用指定的处理方法"无线电框和所需的处理方法。在下面的下拉框中,标有"如何:"选择"校准和定量"。处理完成后,导航到"结果"选项卡并检查色谱图的集成。
注: 需要验证每种方法的处理方法。作为起点,用于当前处理方法的参数包含在补充文件中。
注: 数据导出可以以报告的形式完成,也可以只导出峰值量化。这些可以在处理或从结果窗口同时完成。
6. 氨基酸分析
- 设置LC-MS绝对氨基酸定量的标准曲线
- 通过溶解 59.45 mg Asn、59.00 mg Hyp、65.77 mg Gln 和 91.95 mg Trp,在 25 mL 的 0.1 N HCl 中溶解延长氨基酸 (EAA) 混合物。EAA混合物中每种氨基酸的最终浓度为18 nmol/μL。
- 通过在 50 mL 的 HCl 中溶解 58.58 mg Nva 和 44.54 mg Sar 来制备内部标准 (ISTD) 库存溶液。
- 通过将含有阿拉、阿斯普、阿格、赛、格鲁、Gly、他、伊勒、勒、梅特、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val 的氨基酸库存溶液与 EAA 混合物相结合,分别含有阿拉、阿斯普、阿格、赛、Glu、Gly、He、Pro、Ser、Thr、Trp、Trp、Tyr、Val,每个溶液中含有含有阿联、阿斯普、阿氏、格力、Glu、Gly、He、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val(每种溶液)和EAA混合物,最终氨基酸浓度为900,225、90、22.5 和 9 pmol/μL.将制备的 ISTD 库存添加到氨基酸标准中,最终浓度为 90 pmol/μL 或 900 pmol/μL,以创建"低"和"高"的内部标准,用作该方法的正控制。
- 将样品小瓶中的氨基酸浓度放入UPLC的自动进样器中。使用以下说明,根据氨基酸标准浓度在仪器软件中生成校准曲线(9 至 900 pmol/μL)。
- 使用与UPLC耦合的电喷雾电离(ESI)正灵敏度模式的Q-ToF进行完整的氨基酸分析。对于色谱分离,使用为氨基酸分离而制成的正常相位柱。用质谱级试剂制备以下缓冲液:A = 醋酸 = 0.1%的甲酸和B = 100 mM铵甲酸。将 LC 流速设置为 0.6 mL/min,将柱温度设置为 40°C。
- 使用以下15分钟梯度条件分离氨基酸:14%B(0-3分钟),14-100%B(3-10分钟),100%B(10-13分钟),100-8%B(13-14分钟),8%B(14-15分钟)。
- 使用 MS 采集程序中的"样本类型"和"Conc A"列列表创建校准曲线,用于未来在定量程序中分析粗生物反应器介质。要使这些列显示在采集程序中,请在右键单击顶部菜单栏时使用"自定义显示..."命令。
- 氨基酸标准的样品类型为"标准",介质样本为"Analyte"。填写"Conc A"列,其中按所需单位(例如:pmol/μL)为单位的标准数值浓度。
- 运行准备的氨基酸标准浓度至少两次。通过检查 ISTD 峰值,验证 UPLC 仪器和质谱仪是否正常工作。
- 在量化应用程序中使用"编辑方法"选项创建量化方法 (*.mdb 文件)。定义定量应用中所有感兴趣的氨基酸,如化合物名称、m/z 值和预期保留时间。在此处更改方法的集成参数。
- 在标准样品上使用创建的氨基酸方法创建校准曲线。此曲线可导出到 *.cdb 文件,以便使用"导出>校准..."命令与介质示例一起使用。
- 在量化应用程序中,将所需的布局保存到 *.qlt 文件中,以便使用"将布局另存为..."应用于将来的数据集。名称(注入名称)、区域和 Conc 是最重要的输出列。
- LC-MS对粗生物反应器介质的氨基酸分析
- 在 1,962 x g下将原油生物反应器介质离心 5 分钟,并通过 0.22 μm 过滤器。
- 继续进行高氯酸清理以去除蛋白质和颗粒物:以1:1的比例将过滤的生物反应器介质与0.4 N HClO4混合,在RT以14,700 x g离心5分钟。在自动进样小瓶中收集澄清的介质。
注:根据需要调整注射体积,使氨基酸浓度在校准范围内。根据仪器的不同,注射体积可在0.1 μL和10μL之间调节。 - 通过 LC-MS 以三联形式运行介质样本。在定量程序下使用"过程样本"以及方法 (*.mdb) 和校准文件 (*.cdb)。完成所有注液后,定量应用将自动将方法和校准曲线应用于粗介质样品。
- 要导出数据以在另一个程序中进行分析(如电子表格),请使用"打印"命令并创建 *.xps 或 *.pdf 文件。
Representative Results
从自动微尺度生物反应器中采集的细胞培养液使用快速蛋白液相色谱法(FPLC)进行纯化,如图1所示,纯化蛋白的关键质量属性(CQAs)具有多种特征下游分析方法。这是自动化微生物反应器系统的主要优点;CQA 的差异可以在各种条件下快速评估。由质谱法处理的CHO-生产mAbs的N-甘油数据应如图2所示的色谱图所示。该图描述了两个色谱图之间的比较,显示一个样本中的 mannose 5 峰值 (M5) 要低得多。如果只观察到噪声基线而不是峰值,则可能意味着色谱设置有故障或过程不成功。使用控件可以简化故障排除。首先,从 dextran 阶梯评估 FLR 峰值;这些峰值表示色谱系统工作正常。接下来,将实验获得的峰值与从经过处理的完整 mAb 标准中获得的峰进行比较。如果标准的峰值可见,但没有识别样本峰值,则 mAb 样本的处理不正确。这可能是由于SDS或核亲子在缓冲液中干扰N-甘油标签和纯化。
SEC-MALS 可用于评估另外两个 CQA:抗体的聚合配置文件和分子量。具有代表性的 SEC-MALS 色谱图与图 3所示的色谱图相当。分子质量分布和绝对分子量是使用具有1.37 mL+(mg_cm)-1和0.185 mL/g的分光系数的所需软件确定的。由于峰值调用和在软件中的基线设置是手动执行的,因此结果可能因用户而异。图 3中单体 IgG1 的绝对分子量为 1.504 x 105 Da = 0.38%(蓝色),高阶复合物为 7.799 x 105 Da = 3.0%(红色)。如峰1的红摩尔质量分布所示,骨料的多分布度远远大于单体。图3。样品数量少,聚合作为CQA的重要性,使得该技术成为自动化微生物反应器系统极具价值的补充分析工具。
mCZE的结果为电象图,如图4所示,它显示了单克隆抗体的电荷变异轮廓。该配置文件是被调查的蛋白质的唯一特征,对操作 pH 高度敏感。充电变型轮廓左侧的游离染料峰值也可见。在建立工作pH值时,操作员有一些自由裁量权来平衡分辨率和信号;此外,操作员必须确保与以 ±30 s 迁移的自由染料峰值保持良好的分离。样品在贴标签后可以脱盐以去除此峰值,但这导致信号显著损失。一旦建立了工作pH值,样品配置文件就可以进行比较。虽然通常一致,但标签效率的变化或赋形剂的差异可能导致样品迁移和电荷变型轮廓的微小差异,使得电图难以直接比较。相反,比较方法通常基于基本、主要和酸性物种的百分比。在这种情况下,可以使用 mCZE 识别小至 1-2% 的相对差异。
可以监测氨基酸的消耗,以确定消耗是否导致CQA的变化。质谱仪的色谱图读出法可用于评估在粗生物反应器介质样品中氨基酸绝对定量的成功创建校准曲线。图 5描绘了两个总电子色谱图 (TIC) 和一个提取的电离度图 (XIC) 作为这一过程的代表性结果。在图5A中,图所示的TIC描述了来自缓冲系统的背景信号,因为只注入了水空白。图 5B描绘了氨基酸标准的代表性 TIC,与水空白相比,可以观察到对应于单个氨基酸物种的小峰(如 7.96 分钟的莱氨酸)。为了集成峰值并便于峰值区域(以及浓度)的量化,XIC 用于仅显示来自定义的"色谱图质量窗口"的信号。根据仪器的灵敏度和色谱分离的质量,最佳质量窗口必须由用户确定。在此示例中(图5C),以液田的 XIC (m/z = 147.1144) 的质量窗口为 10 ppm,其中氨基酸标准中的碱在 8.03 分钟时从柱中洗脱。
图 1.使用快速蛋白液相色谱 (FPLC) 技术的纯化方案的代表性色谱图。与体积 (mL) 对应的纯化方法阶段沿 x 轴标记。在整个纯化周期中,在 280 nm(mAU y 轴、实线)处监测紫外线吸收。在高盐洗涤过程中,通过增加电导率(mS/cm y轴,虚线)来去除非特约约束杂质。 当pH量降至4时,抗体通过引入洗脱缓冲液(Conc B,虚线)从蛋白质A柱中洗脱。如图所示)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.从经过质量验证的标记甘油中获得的代表性荧光色谱图。x 轴是保留时间(分钟),而 y 轴是信号强度。14.94 分钟的峰值表示 Mannose 5 (M5) 甘油,其中可观察到覆盖的两个样本之间的 M5 信号强度之间的巨大差异。请点击此处查看此图的较大版本。
图3.IgG1单克隆抗体的分子量分布。在 1x PBS (pH7.4) 中通过大小排除色谱分离的完整 IgG1 单克隆抗体的色谱图。在280nm(黑色;左轴)监测吸收率,使用光散射和折射指数探测器计算每个峰值的绝对分子量(红色和蓝色;右轴)。高分子量物种以标有"HMW"的峰值表示。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.IgG1单克隆抗体的电荷变异型材。此电图在 mCZE 平台上生成。自由染料峰值在 ±30 s 时迁移,与 IgG1 分离。在定量方面,使用仪器数据分析软件将峰分为基本、主和酸性物种。红线勾勒出综合峰区。请点击此处查看此图的较大版本。
图5.用于粗生物反应器介质质谱基氨基酸分析的组子色谱图的代表性结果。x 轴是时间(分钟),而 y 轴是信号强度(A) 水空白用作负控制,并显示在液相色谱梯度 (B) 过程中观察到的背景信号225 pmol/μL 氨基酸标准在这里用作正对照,因为在此总电离度图中观察到的单个峰表示标准混合物的不同氨基酸被解析色谱 (C ) 代表提取的电离度图m/z 147.1144,这是莱辛。B 中的 7.96 分钟峰值对应于以因水因的 C 中的 8.03 峰值。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
HCCF 含有碎屑和大颗粒,这些碎片和大颗粒会堵塞和破坏昂贵的仪器,因此在进一步下游处理之前需要澄清培养物。离心通常是首先将细胞和其他不溶性颗粒从蛋白质中分离出来,然后是过滤。然后,通过快速蛋白液相色谱(FPLC)进行纯化。从自动微生物反应器中纯化HCCF以获得产品是下游加工的重要一步。在这里,一个具有蛋白质A柱的台式FPLC系统用于从HCCF获得单克隆抗体。上游过程分析可以提供对细胞行为的有用洞察,并指导生物工艺设计,帮助获得一致可靠的优质产品。分析还允许将关键质量属性 (CQA) 链接到上游和下游流程。这里介绍的四种检测,通常用于单克隆抗体的表征。这些技术是健壮的,可靠的,易于部署从各种上游来源的过程和产品分析,只有部分纯化,可能仍然含有残留水平的DNA和HCP。
在清理样品进行分析时,必须在创建足够清洁的样品和保留生物反应器中存在的可变性之间取得重要平衡。影响产品最常见的两种污染物是DNA和HCP,可以通过测量260/280 nm的阻尼率和通过SDS-PAGE或_CE-SDS来检查。此处提供的测定对低DNA含量不敏感。产品的纯度为>95%纯,由_CE-SDS决定。
使用微毛细血管电泳系统的电荷变型分析提供了一种高通量方法,用于识别电荷变型,芯片和试剂相对容易实现。该技术的性质和标签试剂的化学性质对赋形剂和其他原发性胺都敏感,因此大多数样品基质都需要脱盐步骤。根据经验,低水平的DNA与标签反应的自由染料共同迁移,不影响结果的质量。虽然基本、主峰和酸性峰定量的变异性通常为<1%,但较高的DNA和其他污染物水平可以增加测定的变异性。与蛋白质标签保持一致,并确保在从瓶子中取出并与染料混合后迅速使用 DMF,这一点非常重要。推荐使用氨酸和/或组氨酸标准作为标签控制。随着时间的推移,根据样品质量,芯片可能会污染或失去微流体通道上的涂层,导致更大的噪声、鬼峰的存在以及更大的样品对样品变化。为了识别这种情况,空白和系统适用性标准(即 NISTmAb)与样本同时定期进行分析。当出现芯片问题时,可以使用存储解决方案清洗或更换芯片。
治疗性糖蛋白的甘油分析方法主要涉及液相色谱(LC)和/或质谱法(MS),其中叶酸微阵列分析作为第三个选项25越来越受欢迎。本文描述的方法同时使用LC和MS,这有其优点和缺点。质谱方法具有对分析的甘油进行质量验证的优势,使用荧光检测输出或叶酸微阵列的基于 LC 的方法是不可能的。此方法使用 LC 和荧光检测,使用与 dextran 梯形标准相比,使用保留时间来分配甘油标识。荧光监测允许提高灵敏度和定量,由于其检测的方便性,由于寡糖的电位效率差,仅MS就可能无法量化低丰度物种。来自 MS 的质量信息用于确认甘油标识,但处理软件不使用质量信息作为主要分配条件。因此,如果没有可重复的色谱和易于解决的峰值,这种方法可能会遭受甘油分配的影响。幸运的是,即使在色谱低于标准的情况下,质量信息也能帮助进行甘油分配,例如,在保留时间上发生偏移,妨碍可重复的甘油分配。如果在没有 MS 的情况下使用此方法,色谱必须处于最高水平,因为质量信息不能用于校正停留时间漂移。
本文描述的氨基酸分析方法利用LC-MS对粗细胞培养基中未成年氨基酸进行快速定量。替代氨基酸分析方法需要氨基酸衍生剂,以实现紫外线检测26。与LC-UV方法相比,LC-MS方法具有重要优势:它允许根据保留时间和电子质量进行识别,而不是LC-UV方法,后者因缺乏质量表征而受到限制。此外,LC-MS方法提供了时间和可重复性优势,因为LC-UV方法需要耗时的导导反应,这可能具有样品变异性27。然而,在LC-MS方法中注入粗细胞培养基,由于光子脱污剂结垢,会对MS信号造成有害影响。校准梯作为系统适用性检查频繁注入,样本顺序被随机化,以防止数据中的偏差。
使用微生物反应器生产抗体的细胞培养过程是9.在这项研究中,对单克隆抗体表征方法的详细协议进行了明确定义,这些方法可最大化从有限样本量中获得的数据。捕捞的细胞培养液数量有限,有时会限制所获取的产品信息,选择正确的分析程序以获得产品质量数据至关重要。分析对于将上游流程参数与产品质量变化联系起来非常重要。在这里,为用户提供了在使用微生物反应器时对mAbs进行表征的指南。
Disclosures
本出版物反映了作者的观点,不应被解释为代表FDA的观点或政策。
Acknowledgments
作者要感谢斯科特·卢特提供的分析支持。CDER 关键路径计划 (CA #1-13) 为这项工作提供部分内部资金和支持。这个项目的部分支持是被任命为美国食品和药物管理局生物技术产品办公室的实习/研究参与计划,由橡树岭科学与教育研究所管理,美国能源部和FDA之间的机构间协议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
| Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
| Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
| µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
| 0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
| 1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
| 1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
| 1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
| 1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
| 15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
| 150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
| 96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
| ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
| ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
| ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
| Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
| Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
| Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
| Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
| Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
| Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
| Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
| Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
| Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
| GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
| GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
| GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
| GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
| GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
| Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
| Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
| Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
| Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
| Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
| RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
| Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
| TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
| UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
| Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
| Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
| Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
| Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |
References
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