Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Radyoaktif nabız-chase etiketleme eğitim konformasyon olgunlaşma, taşıma fonksiyonel hücresel konumlarını ve hedef proteinler canlı hücrelerde bozulma için güçlü bir araçtır. Kısa (darbe) radiolabeling kez kullanarak (< 30 dk) ve sıkı kontrol chase kere, toplam protein havuzu yalnızca küçük bir kısmını etiket ve onun katlama izleyin mümkündür. Nonreducing/azaltılması SDS-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ve immunoprecipitation (özel biçimi) antikorları ile birleştirildiğinde, süreçleri katlama ayrıntılı olarak incelenebilir. Bu sistem özellikleri çözünür protein, tekli ve çoklu geçiş transmembran proteinler, ağır N ve O glikozile proteinler gibi büyük bir varyasyon ile protein ve protein ve geniş disülfür olmadan Katlama çözümlemek için kullanılan bağ. Nabız-chase yöntemleri co ve ardından değişiklikleri, Oligomerizasyonda ve polimerizasyonu, temelde analiz bir protein doğumdan ölüme izin dahil olmak üzere ek özellikleri bir dizi içine kinetik çalışmalar temelidir. Nabız-chase çalışmalar protein katlanması üzerinde çalışmak için proteinler vitro artan zamansal çözünürlük ve fizyolojik bilgi sağlayarak diğer Biyokimya ve biyofizik yöntemleri ile tamamlayıcı niteliktedir. Bu kağıt içinde açıklandığı gibi yöntemleri kolayca neredeyse memeli ya da böcek-hücre sistemlerinde ifade edilebilir herhangi bir protein katlama çalışmaya adapte.
Giriş
Hatta nispeten basit protein katlama birçok farklı katlama enzim, moleküler chaperones ve kovalent modifikasyon1içerir. Bu işlemler vitro tam bir sulandırma farklı bileşenleri dahil çok sayıda göz önüne alındığında pratik olarak mümkün değildir. Bu nedenle, in vivo, canlı hücrelerde katlama protein çalışmaya son derece arzu edilir. Radyoaktif nabız-chase teknikleri sentezi, katlama, taşıma ve proteinlerin kendi doğal ortamlarında bozulma çalışmak için güçlü bir araç kanıtlamak.
Metabolik 35S etiketli metiyonin/Sistein ile kısa bir darbe sırasında proteinlerin etiketleme, radyoaktif bir et....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm radyoaktif reaktifler ve yordamlar yerel Utrecht Üniversitesi radyasyon kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde ele.
1. darbe Chase
-
Nabız Chase yapışık hücreleri için
Not: burada verilen birimleri 60 mm hücre kültür yemekleri üzerinde temel alır. 35 mm veya 100 mm yemekleri için birimleri tarafından 1/2 ya da 2, sırasıyla çarpın. Bu iletişim kuralı 0, 15, 30, 60, 120 ve 240 min 10 dk ve chase kez darbe zamanı kullanır. Bunlar belirli proteinler (Aşağıda tartışılan) okudu bağlı olarak farklı olabilir.- Böylece onlar olacak altı 60 mm hücre kültür yemekleri tohum yapışık hücreleri (Örneğin, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Katlama ve HIV-1 gp120 bir yapisan darbe chase üzerinden salgılanmasını Şekil 2' de gösterildiği. Nonreducing jel (şekilde hücreleri NR) oksidatif gp120 katlama gösterir. Nabız hemen sonra 5 dk (0 dak chase) gp120 etiketleme diffüz grup jel içinde daha yüksek olarak görünür ve chase ilerledikçe grup jel ile aşağı daha da sıkı grup (NT) birikir kadar ara ürün (BT) katlanır yayılmış geçirir Yerel olarak katlanmış gp120 temsil eder. Disülfür bağları oluşumu tam .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Nabız-chase yöntemleri protein sağlam hücreleri katlama bilim adamlarının anlayış geliştirmek için gerekli olmuştur. Biz mümkün olduğu kadar genel bir yöntem sağlamak teşebbüs ederken, bu yaklaşım katlanır, taşıma ve yaşam proteinlerin hücre içinde sırasında oluşan çeşitli işlemleri incelemek neredeyse sınırsız varyasyonları için potansiyele sahiptir.
Yemekleri yapışık hücreleri kullanarak bir darbe takip gerçekleştirirken, aynı ayrı tabak olarak mümkün olduğu kadar her zaman noktası ve/veya k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar geçmiş Braakman Lab, tüm üye teşekkür ve, onların verimli tartışmalar için mevcut ve bu makalede sunulan yöntemleri geliştirmede yardımcı. Bu proje Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) N ° 235649 altında ve Hollanda organizasyon, bilimsel araştırma (NWO) ECHO programı N ° 711.012.008 altında fon aldı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL safeseal mikrosantrifüj tüpleri | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Asetik Asit | Sigma | A6283 | buzlu asetik asit |
| BAS Depolama fosfor ekranı 20x25 cm | GE Yaşam Bilimleri | 28956475 | |
| Bromofenol Mavi | Sigma | B8026 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Carestream Biomax MR filmleri | Kodak | Z350370-50EA | |
| Hücre kültürü ortamı | Çeşitli | N/A | Kullanılan belirli hücre hatları için normal hücre kültürü |
| ortamı Hücre kültürü ortamı, metiyonin/sistein içermez | Çeşitli | N/A | Normal kültür ortamıyla aynı ortam formülasyonu, örneğin DMEM/MEM/RPMI, metiyonin ve sistein içermez |
| Kömür filtre kağıdı | Whatman | 1872047 | |
| Kömür filtreli pipet uçları | Moleküler biyoürünler | 5069B | |
| Kömür vakum koruyucu | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | elektroforez için |
| Sistein | Sigma | C7352 | Moleküler biyoloji sınıfı, 500 mM stok yapın, -20 'de saklayın; |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| EasyTag Express35S Protein Etiketleme Karışımı | Perkin Elmer | NEG772014MC | Kullanıma bağlı olarak diğer boyutta etiket grupları mevcuttur |
| EDTA | Sigma | E1644 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Jel kurutma ekipmanı | Çeşitli | N / A | |
| Gliserol | Sigma | G5516 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| 3. sınıf kromatografi kağıdı | GE Yaşam Bilimleri | 3003-917 | |
| Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes hassas görev mendilleri | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Metanol | Sigma | MX0490 ve nbsp; | |
| Metiyonin | Sigma | M5308 | Moleküler biyoloji sınıfı, 250 mM stok yapın, -20'de saklayın |
| Minigel döküm / koşu ekipmanı | Çeşitli | N / A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| N-etilmaleimid | Sigma | E3876 | Moleküler biyoloji sınıfı,% 100 etanolde 1M stok yapın, -20 |
| PBS | Sigma'da | P5368 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Protein-A Sefaroz hızlı akışlı boncuklar | GE sağlık hizmeti | 17-5280-04 | |
| Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) | Sigma | L3771 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| Trizma bazı (Tris) | Sigma | T6066 | Moleküler biyoloji sınıfı |
| IP Biyomoleküler görüntüleyici | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tüpü Rafı 20 mm su banyosu için | Nalgene | 5970-0320PK |
Kaynaklar
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
